豫麥158 及其硬質變異系重要性狀基因的KASP 標記檢測

趙永濤，張 鋒，張中州，袁 謙，甄士聰，望俊森

（漯河市農(nóng)業(yè)科學院，河南漯河 462300）

根據(jù)小麥胚乳質地可將小麥劃分為硬質小麥、軟質小麥和混合小麥。小麥籽粒硬度影響小麥的營養(yǎng)品質和加工品質，是評價小麥品質的一項重要指標。軟質麥蛋白質含量低，磨出的面粉顆粒小，適合做饅頭、餅干、糕點等；硬質麥蛋白質含量高，磨出的面粉顆粒較大，吸水能力強，適合做面包、優(yōu)質面條等[1]。角質率在同一環(huán)境下可以大致反映籽粒硬度，角質率越高，籽粒硬度越高[2]。

小麥籽粒硬度主要由位于5D 染色體短臂上的主效基因Pina（Puroindoline a）和Pinb控制。夏蘭芹等[3]開發(fā)了相應的分子標記并克隆了Pina和Pinb基因。籽粒硬度差異主要由Pina和Pinb基因的不同變異類型造成。含有野生型Pina和Pinb基因的籽粒表現(xiàn)為軟質，Pina和Pinb基因任何一個發(fā)生突變，籽粒便表現(xiàn)為混合型或硬質。對籽粒硬度基因的研究主要采用分子標記和序列分析，近年來，KASP(Kompetitive allele specific PCR)技術也逐漸應用到小麥籽粒硬度基因分析中。KASP 可在廣泛的基因組DNA 樣品中，對單核苷酸多態(tài)性（SNP）或特定位點上的插入或缺失（InDel）進行精準的雙等位基因判定[4]。KASP 可應用于QTL 精細定位、種子質量控制、大樣本量的分子標記驗證、分子輔助育種、種子資源鑒定等方面，可以在短時間內準確判斷分子標記類型[5?7]。利用KASP 可以方便地篩選出小麥有利性狀基因，并指導后續(xù)品種改良，也可以對已改良品種進行基因驗證[8]。

豫麥158 由漯河市農(nóng)業(yè)科學院選育，于2014 年通過國家農(nóng)作物品種審定委員會審定，該品種具有高產(chǎn)、綜合抗性較好、品質較好等優(yōu)點[9?10]。豫麥158-42 為豫麥158 的自然變異系，其籽粒硬度增加，加工品質得到較大改善，達到優(yōu)質強筋小麥標準，對其重要性狀進行KASP 標記分析具有重要意義。為此，通過已知小麥性狀相關SNP 位點，對豫麥158 和豫麥158-42 的株高、光周期、春化、粒質量、抗逆、品質等相關基因進行KASP 標記檢測，分析豫麥158 和豫麥158-42 上述重要性狀等位基因的異同，為小麥重要性狀改良提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試小麥材料為豫麥158及其硬質變異系。豫麥158高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、綜合抗性較好，其品質接近中強筋小麥標準；豫麥158-42為漯河市農(nóng)業(yè)科學院超級小麥研究室于2015 年通過對豫麥158 田間選擇5 200個單穗，后經(jīng)考種選擇種植穗行圃5 000 個，2016 年經(jīng)田間調查及考種選擇112 個穗系圃種植，2017 年經(jīng)田間調查及考種選育出的硬質變異系，該系田間長相和豫麥158極其相似，但籽粒性狀有所改變。

1.2 田間試驗設計

試驗于2017—2018 年在漯河市農(nóng)業(yè)科學院試驗基地進行，豫麥158 和豫麥158-42 播種量均為300 kg/hm2，小區(qū)面積1.5 m×6 m，其他按常規(guī)大田管理。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 農(nóng)藝性狀 苗期調查幼苗習性，成株期調查抗病性、成熟期、株高、成穗數(shù)、穗粒數(shù)，收獲后調查產(chǎn)量、千粒質量、籽粒質地。按照《農(nóng)作物品種區(qū)域試驗技術規(guī)程小麥》（NY/T 1301—2007）進行上述指標的調查。

1.3.2 籽粒硬度及品質指標 采用單粒谷物特性測定儀（PertenSKCS4100）測定籽粒硬度，硬度指數(shù)小于40 為軟質麥，大于60 為硬質麥，居兩者中間為混合麥。

粗蛋白含量采用國標法（GB 5009.5—2016）測定，濕面筋含量和面筋指數(shù)采用機洗法（GB/T 5506.2—2008）測定，面團形成時間、穩(wěn)定時間及吸水率和弱化度均采用粉質儀（GB/T 14490—2008）測定。

1.3.3 KASP 分析 KASP 分析由中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所品質育種課題組完成，該次KASP分析包括多個單位的材料，匯總后一并完成，漯河市農(nóng)業(yè)科學院超級小麥研究室選取豫麥158及豫麥158-42 進行數(shù)據(jù)分析。KASP 分析過程：選取小麥干籽粒20 粒，采用CTAB 法提取DNA。選取小麥株高、光周期、春化、品質、粒質量和抗逆等相關基因的61 對引物進行PCR 擴增。PCR 反應體系為5 μL，包括2 μL DNA(10 ng/μL)、2.5 μL 2×KASP Master Mix、0.07 μL 引物（2.5 μmol/L）和0.43 μL ddH2O。PCR 反應程序：95 ℃預熱15 min；95 ℃變性20 s，65 ℃退火延伸25 s，每個循環(huán)降低1 ℃，10 個循環(huán)；95 ℃變性10 s，57 ℃退火延伸60 s，30 個循環(huán)。反應結束后，用Kluster Caller 軟件對Synergy H1全功能酶標儀掃描數(shù)據(jù)進行分析。

2 結果與分析

2.1 豫麥158和豫麥158-42的農(nóng)藝性狀

由表1 可知，豫麥158 與豫麥158-42 的農(nóng)藝性狀差別不大，豫麥158-42成穗數(shù)、千粒質量、產(chǎn)量稍低；兩者籽粒性狀差別明顯，豫麥158 為混合麥，豫麥158-42為硬質麥。

表1 豫麥158和豫麥158-42主要農(nóng)藝性狀Tab.1 Main agronomic characters of Yumai 158 and Yumai 158-42

2.2 豫麥158和豫麥158-42的加工品質性狀

由表2可知，與豫麥158相比，豫麥158-42品質有了較大的改善，籽粒硬度指數(shù)從43 提高到67，粗蛋白含量從13.5%提高到15.3%，濕面筋含量從29.7% 提高到35.5%，面筋指數(shù)從53.2% 提高到73.1%，弱化度從93 FU 降到了69 FU，形成時間從6.2 min 提高到10.4 min，穩(wěn)定時間從7.1 min 提高到10.9 min。

表2 豫麥158和豫麥158-42加工品質性狀Tab.2 Processing quality characters of Yumai 158 and Yumai 158-42

2.3 豫麥158和豫麥158-42重要性狀基因的KASP標記檢測

豫麥158 和豫麥158-42 的株高、光周期、春化、粒質量、抗逆、品質等相關基因的KASP 標記檢測結果如表3 所示。在推廣小麥品種中應用的Rht（Reduced height）基因主要有Rht-B1、Rht-D1、Rht8和Rht9，Rht-B1a表現(xiàn)為高稈，Rht-B1b表現(xiàn)為矮稈；Rht-D1a表現(xiàn)為高稈，Rht-D1b表現(xiàn)為矮稈[11]。豫麥158、豫麥158-42 均含有株高主效基因Rht-B1a和Rht-D1b，豫麥158 與豫麥158-42 株高無顯著差異，田間表現(xiàn)為中等株高。小麥春化關鍵作用基因有Vrn-A1（Vernalization?A1）、Vrn-B1、Vrn-D1，分別位于5A、5B、5D染色體長臂上，3個基因中任何一個為顯性時，小麥的發(fā)育特性為春性[12]。豫麥158 和豫麥158-42 中均含有2 個春化隱性基因vrn-A1、vrn-D1，缺失春化基因Vrn-B1，均含有春化基因vrn-B3CS類型和vrn-A12147類型以及vrn-D3Jagger類型，兩者還同時含有春化相關微效基因TaELF3-B1（Early flowering 3-B1）Cadenza 類型、TaELF3-D1Ria 類型、TaTOE1-B1-1（Target of eat 1?B1?1）Cadenza 類型和TaMOT1-D1（Molybdate transporter 1?D1）Wild 類型，同時缺失春化相關微效基因TaFT3-B1（Flowering locus T3?B1）。另外，兩者均含有光周期基因Ppd-A1a（Photoperiod?A1a）、Ppd-B1a和Ppd-D1b，豫麥158 及豫麥158-42 田間均表現(xiàn)為半冬性。共檢測到18 個微效粒質量基因，豫麥158和豫麥158-42 均含有14 個高粒質量微效等位基因TaGS2-A1b（Grain size 2?A1b）、TaGS-D1a、TaGS5-A1b、TaCwi-A1a（Cell wall?bound invertase?A1a）、TaCKX-D1a（Cytokinin oxidase/dehydrogenase?D1a）、TaGW6-A1a（Grain weight 6?A1a）、TaTGW-7Aa（Thousand grain weight?7Aa）、TaSus-7A-1（Sucrose synthase?7A?1）、Hap-A、Hap-Ⅱ、Hap-6A-A、Hap-T、Hap-Ⅰ、Hap-7A-3，4 個低粒質量微效等位基因Tabas1-B1b（Plant 2?Cys peroxiredoxin BAS1?B1b）、TPP-6AL1b（Trehalose 6?phosphate phosphatase?6AL1b）、Hap-L、TaTGW6-b。

表3 豫麥158和豫麥158-42重要性狀基因的KASP標記檢測結果Tab.3 Detection result of important traits genes with KASP markers in Yumai 158 and Yumai 158-42

續(xù)表3 豫麥158和豫麥158-42重要性狀基因的KASP標記檢測結果Tab.3（Continued） Detection result of important agronomic traits genes with KASP Markers in Yumai 158 and Yumai 158-42

抗逆相關基因的KASP 標記檢測結果（表3）顯示，豫麥158 和豫麥158-42 均檢測到5 個葉銹病相關基因Lr34-（Leaf rust 34?）、Lr46-、Lr37-、Lr67-、Lr68-，除葉銹病主效基因Lr67-為抗病基因外，其余均為感病基因，豫麥158 和豫麥158-42 田間均表現(xiàn)為高感葉銹病。豫麥158 和豫麥158-42 均不含有抗赤霉病主效基因Fhb1（Fusarium head blight 1）。豫麥158 和豫麥158-42 均含有抗穗發(fā)芽基因Vp1-B1c（Viviparous 1?B1c）、TaPHS_646（Pre?harvest sprouting_646）、TaPHS1-prom和感穗發(fā)芽基因TaSdr-B1b（Seed dormancy?B1b）、TaSdr-A1b。檢測到5 個抗旱微效基因，豫麥158 和豫麥158-42 均同時含有4 個抗旱微效基因1-feh-w3（Fructan 1?exohydrolase?w3）Westonia 類型、Hap-4A-C、Hap-5D-C、TaDREB-B1a（Dehydration?responsive element binding protein?B1a）和1個不抗旱微效基因Hap-L。

籽粒品質相關基因的KASP 標記檢測結果（表3）顯示，豫麥158 和豫麥158-42 都含有1和5+10高分子質量麥谷蛋白亞基基因，兩者品質均較好，豫麥158 接近中強筋小麥標準，豫麥158-42 達到強筋標準。Pinb-D1、Pina-D1基因為控制小麥籽粒硬度的主效基因，表現(xiàn)為軟質；Pinb2則為微效基因，表現(xiàn)為硬質。豫麥158 同時含有Pinb-D1a、Pina-D1a、Pinb-B2a基因，而豫麥158-42 僅含有Pinb-B2a基因，缺失了小麥籽粒硬度等位基因Pinb-D1a和Pina-D1a，籽粒硬度較豫麥158 增加，而籽粒硬度與蛋白質含量、濕面筋含量、吸水率呈顯著正相關關系[13]，故豫麥158-42 品質較豫麥158提高。多酚氧化酶活性、黃色素含量會影響面粉品質，豫麥158 及豫麥158-42 均檢測到低多酚氧化酶基因Ppo-A1b（Polyphenol oxidase?A1b）。豫麥158含有高黃色素基因TaZds-A1b（Zeta?carotene desaturase?A1b）、Psy-A1a（Phytone synthease?A1a）、TaZds-D1a和低黃色素基因Psy-D1a（Phytone synthease?D1a），豫麥158-42 含有高黃色素基因TaZds-A1b、Psy-A1a、Psy-D1g、TaZds-D1a。可見兩者黃色素含量主效基因Psy-D1有所不同，豫麥158含有Psy-D1a，為低黃色素主效基因；豫麥158-42含有Psy-D1g，為高黃色素主效基因。胡瑞波等[14]研究發(fā)現(xiàn)，面粉黃色素含量與籽粒硬度呈正相關，本研究結果也間接印證了此結論。

3 結論與討論

多種分子標記可用于小麥遺傳基礎分析，鄭永勝等[15]采用SSR 標記對350 份小麥種質進行遺傳多樣性分析，把350份小麥種質劃分為四大類；孔子明等[16]用芯片對小麥骨干品種周麥16 進行全基因組掃描，發(fā)現(xiàn)親本周8425B 對周麥16 的遺傳貢獻率遠大于親本周麥9 號。本研究用KASP 技術對豫麥158 及其硬質變異系進行重要性狀基因分析，較SSR 方法省時省工，較基因芯片法簡單、費用低、效率高。KASP 標記檢測分析結果與田間表現(xiàn)對應較好，用KASP 標記檢測小麥農(nóng)藝性狀相關基因方法可行。

研究小麥某一性狀受小麥復雜遺傳背景的影響比較困難，人們?yōu)榱搜芯啃←溎骋恍誀罨蛘吣骋惶囟ɑ?，往往利用除了目標性狀不同外其他遺傳背景都相同的小麥近等基因系來研究。吳新儒等[17]用導入系和SSR 標記檢測選出了22 個萊州953 的AM3 單片段代換系；張建周等[18]以銘賢169 為背景構建了抗條銹基因Yrju4的近等基因系；孔忠新等[19]以望水白和川麥42 為背景構建了粒質量主效QTLQGw.nau-5A的近等基因系。本研究采用自然變異的方法選擇籽粒硬度自然變異系，基因背景單純，干擾因素少，便于開展研究。

關于籽粒硬度基因類型的研究比較多，丁茂予等[20]對85 份小麥品種的籽粒硬度基因進行分析，共檢測到4 種籽粒硬度基因類型；楊子博等[21]對74 份江蘇淮北地區(qū)和38 份黃淮麥區(qū)的小麥材料進行KASP 標記檢測，并對所含的籽粒硬度基因型進行了分析，共檢測到4 種籽粒硬度基因類型；王雪玲等[22]對66 份青海小麥品種籽粒硬度主效基因進行分析，發(fā)現(xiàn)66 份材料中硬度基因有5 種組合類型；張福彥等[23]對109 份黃淮麥區(qū)小麥材料進行籽粒硬度基因分析，發(fā)現(xiàn)所檢測的硬粒小麥中含有Pinb-D1b、Pinb-D1p和Pina-D1b3 種變異類型。本研究所發(fā)現(xiàn)的硬質變異系豫麥158-42 與豫麥158 大多性狀相同，只有籽粒性狀和品質發(fā)生了變化，經(jīng)過KASP 分析，重要性狀基因組成變化不大，只有影響籽粒性狀的硬度基因和影響品質的黃色素含量基因發(fā)生了改變，是難得的關于籽粒硬度基因的近等基因系，這為籽粒硬度研究以及分析單個硬度基因對籽粒硬度的作用或者籽粒硬度和籽粒品質關系提供了較好的材料。