外源NO對(duì)鎘脅迫下生菜種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及抗氧化特性的影響

熊明國(guó)

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南商丘 476100）

隨著工業(yè)“三廢”的排放、礦產(chǎn)資源的開(kāi)采、污水灌溉以及各種含重金屬有機(jī)肥料的長(zhǎng)期使用，我國(guó)土壤重金屬污染問(wèn)題日益嚴(yán)重，其中，鎘（Cd）污染尤為嚴(yán)重。Cd的毒性較其他重金屬更強(qiáng)，具有致癌性。土壤中過(guò)量的Cd被植物吸收，并在可食部位大量積累，通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，從而危害人體健康。Cd 污染相關(guān)問(wèn)題是人類重要的研究課題。目前，很多學(xué)者都在研究Cd、鉻（Cr）、鉛（Pb）等重金屬脅迫對(duì)植物的影響及其相應(yīng)的解決方法[1?8]。一氧化氮（NO）是植物體內(nèi)重要的活性分子，對(duì)植物的萌發(fā)、生長(zhǎng)發(fā)育、氣孔運(yùn)動(dòng)等生理活動(dòng)有重要調(diào)節(jié)作用。NO 能激活植株的過(guò)敏性反應(yīng)，促使植物獲得抗性，還可誘導(dǎo)植株對(duì)高溫、缺水和鹽脅迫等非生物脅迫的抗性，更可以調(diào)節(jié)體內(nèi)的激素水平，調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)發(fā)育。研究發(fā)現(xiàn)，外源NO 對(duì)植物重金屬（Cr、Cd、Pb等）脅迫具有一定的緩解作用，這些植物主要集中于大豆、煙草、油菜、玉米、水稻、綠豆、黃瓜、蒙山茶、三葉鬼針草等[9?17]。生菜是一種常見(jiàn)的綠葉蔬菜，易于栽植，對(duì)環(huán)境因子的脅迫也具有較強(qiáng)的反應(yīng)，相對(duì)于其他蔬菜（番茄、黃瓜、茄子、辣椒、菠菜等）更容易吸收和積累Cd。目前，在生菜上采用的緩解重金屬毒害的物質(zhì)主要有農(nóng)業(yè)廢棄物、石灰、生物炭、金屬氧化物等[18]，關(guān)于外源NO 對(duì)生菜重金屬脅迫的緩解作用研究很少見(jiàn)[19]。徐林林[19]采用盆栽，將外源NO的供體硝普鈉（SNP）通過(guò)不同途徑加入土壤，研究外源NO 對(duì)Cd 脅迫下花生與生菜生長(zhǎng)的緩解效應(yīng)，結(jié)果認(rèn)為，葉面噴施500 μmol/L SNP 效果最好。目前，尚未見(jiàn)相關(guān)水培研究結(jié)果。為此，設(shè)置不同濃度SNP，研究水培條件下外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)及抗氧化特性的影響，為進(jìn)一步開(kāi)展外源物質(zhì)對(duì)重金屬毒害的緩解效應(yīng)研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試生菜為海南省?？谑杏路N子商行生產(chǎn)的“意大利生菜”（抗熱、耐抽薹）。SNP 和氯化鎘（CdCl2·2.5H2O）均購(gòu)自天津市歐博凱化產(chǎn)品銷售有限公司。營(yíng)養(yǎng)液采用的是Hoagland’s（霍格蘭氏）營(yíng)養(yǎng)液。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2019 年3—5 月在商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院園藝專業(yè)實(shí)訓(xùn)基地進(jìn)行試驗(yàn)。挑選飽滿且大小均一的生菜種子放在鋪有2層濾紙的培養(yǎng)皿（直徑90 cm）中，然后在培養(yǎng)皿中分別添加單一營(yíng)養(yǎng)液（CK）、含100 μmol/L Cd2+的營(yíng)養(yǎng)液、含100 μmol/L Cd2+和100 μmol/L SNP的營(yíng)養(yǎng)液、含100 μmol/L Cd2+和150 μmol/L SNP的營(yíng)養(yǎng)液、含100 μmol/L Cd2+和200 μmol/L SNP 的營(yíng)養(yǎng)液、含100 μmol/LCd2+和250 μmol/L SNP 的營(yíng)養(yǎng)液以及含100、150、200、250 μmol/L SNP 的營(yíng)養(yǎng)液，共10個(gè)處理，具體處理及編號(hào)見(jiàn)表1，100 μmol/L Cd2+脅迫是在前期試驗(yàn)基礎(chǔ)上根據(jù)生菜相對(duì)生長(zhǎng)速度篩選的（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。每皿添加相應(yīng)處理液3 mL。每處理100 粒種子，重復(fù)3 次，完全隨機(jī)區(qū)組排列。將培養(yǎng)皿置25 ℃下催芽，每天定時(shí)觀察發(fā)芽數(shù)，用稱質(zhì)量法補(bǔ)充處理液，5 d 發(fā)芽結(jié)束后將其種植到72 孔穴盤中，每穴1 株，每處理9穴，重復(fù)3 次。移植當(dāng)天用相應(yīng)處理液澆透培養(yǎng)基質(zhì)（m蛭石∶m珍珠巖=3∶1），保持其濕度。每天定時(shí)查看維護(hù)，10 d 后采用Hoagland’s 營(yíng)養(yǎng)液澆灌幼苗，14 d 后取樣用于指標(biāo)測(cè)定。

表1 處理及編號(hào)Tab.1 Treatment and number

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率 觀察3 d 內(nèi)和5 d 內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)，并計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率。其中，發(fā)芽勢(shì)=（3 d內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/被測(cè)種子數(shù)）×100%，發(fā)芽率=（5 d 內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/被測(cè)種子數(shù)）×100%。

1.3.2 葉綠素含量 葉綠素含量采用分光光度法測(cè)定[20]。

1.3.3 抗氧化特性 過(guò)氧化物酶（POD）活性的測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑法，過(guò)氧化氫酶（CAT）活性的測(cè)定采用高錳酸鉀滴定法，丙二醛（MDA）含量的測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[20]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用Excel 2016 進(jìn)行處理和作圖，使用軟件SPSS 22.0進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜種子萌發(fā)的影響

2.1.1 發(fā)芽率 從圖1 可看出，生菜種子遭遇Cd 脅迫后發(fā)芽率較CK 顯著降低，說(shuō)明Cd 脅迫抑制生菜種子發(fā)芽；在Cd 脅迫下添加適宜濃度的外源NO，T2、T5 處理生菜種子發(fā)芽率有所提高，但差異不顯著。在營(yíng)養(yǎng)液中添加不同濃度的SNP，隨著SNP 濃度的增加，生菜種子發(fā)芽率先升高后降低，T8 處理最高，為96.6%，與CK無(wú)顯著差異。

圖1 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of exogenous NO on seed germination rate of lettuce under cadmium stress

2.1.2 發(fā)芽勢(shì) 由圖2 可知，生菜種子遭遇Cd 脅迫后發(fā)芽勢(shì)較CK 降低，但差異不顯著；在Cd 脅迫下添加不同濃度的NO，其發(fā)芽勢(shì)與CK、T1 處理均無(wú)顯著差異。在營(yíng)養(yǎng)液中添加不同濃度的SNP，隨著SNP 濃度的增加，生菜發(fā)芽勢(shì)總體升高，T8 處理最高，但與CK 無(wú)顯著差異。綜上可知，在Cd 脅迫下生菜種子的發(fā)芽勢(shì)并未明顯受到影響。

圖2 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜種子發(fā)芽勢(shì)的影響Fig.2 Effects of exogenous NO on seed germination potential of lettuce under cadmium stress

2.2 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜幼苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 葉綠素含量 由圖3 可知，生菜幼苗遭遇Cd脅迫后葉片葉綠素較CK 顯著降低，在Cd 脅迫下添加不同濃度的外源NO，葉綠素含量顯著提高，且隨著NO 濃度的升高而升高，以T5 處理最高，T2、T3、T4、T5 處理分別較T1 處理提高131.00%、145.01%、151.38%、155.63%，但這些處理仍顯著低于CK。僅添加SNP 的T6、T7、T8、T9 處理葉綠素含量隨著SNP濃度增加而增加，以T9處理最高，與CK 無(wú)顯著差異，其他處理均顯著低于CK。因此，Cd 脅迫會(huì)抑制生菜葉葉綠素含量，且外源NO 可在一定程度上緩解此影響。

圖3 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜葉綠素含量的影響Fig.3 Effects of exogenous NO on chlorophyll content of lettuce under cadmium stress

2.2.2 地上部、地下部長(zhǎng)度 從圖4可看出，生菜幼苗遭遇Cd 脅迫后地上部、地下部長(zhǎng)度均較CK 顯著降低；在Cd脅迫下添加不同濃度的外源NO，總體上地上部、地下部長(zhǎng)度均顯著提高，地上部長(zhǎng)度以T5處理最高，地下部長(zhǎng)度以T4處理最高。僅添加SNP的T6、T7、T8、T9 處理,地上部長(zhǎng)度隨著SNP 濃度的增加而降低，地下部長(zhǎng)度隨著SNP 濃度的增加先增加后降低，除T9處理較CK降低外，其他處理總體上均高于CK。由此可知，Cd 脅迫會(huì)抑制生菜的生長(zhǎng)，添加外源NO則會(huì)適當(dāng)緩解這種抑制作用。

圖4 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜幼苗生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of exogenous NO on growth of lettuce seedlings under cadmium stress

2.3 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜幼苗抗氧化特性的影響

2.3.1 MDA含量 從圖5可知，生菜幼苗遭遇Cd脅迫后MDA含量較CK 顯著升高；在Cd脅迫下添加不同濃度的外源NO，MDA 含量均顯著降低，且均顯著低于CK，以T5 處理最低。僅添加SNP 的T6、T7、T8、T9 處理MDA 含量普遍較低，顯著低于CK 和T1處理。由此可知，Cd 脅迫會(huì)造成生菜幼苗MDA 含量增加，而外源NO則會(huì)抑制MDA的產(chǎn)生。

圖5 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜幼苗MDA含量的影響Fig.5 Effects of exogenous NO on the MDA content of lettuce seedlings under cadmium stress

2.3.2 抗氧化酶活性

2.3.2.1 POD 活性 由圖6 可看出，生菜幼苗遭遇Cd脅迫后POD活性較CK顯著降低；在Cd脅迫下添加不同濃度的外源NO，POD 活性顯著升高，且總體隨著SNP 濃度的升高而升高，以T5 處理最高，較T1處理顯著提高85.00%，與CK 無(wú)顯著差異,其他處理均顯著低于CK。僅添加SNP 的處理中，T6、T8、T9處理POD 活性與CK 無(wú)顯著差異，T7 處理顯著低于CK，但均顯著高于T1處理。由此可知，Cd脅迫下生菜幼苗的POD 活性會(huì)受到抑制，而一定量的外源NO 則會(huì)在一定程度上緩解Cd 脅迫對(duì)POD 活性的抑制作用。

圖6 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜幼苗POD活性的影響Fig.6 Effects of exogenous NO on the POD activity of lettuce seedlings under cadmium stress

2.3.2.2 CAT 活性 由圖7 可知，生菜幼苗遭遇Cd脅迫后CAT 活性較CK 顯著降低；在Cd 脅迫下添加不同濃度的外源NO，POD 活性顯著升高，且總體隨著SNP 濃度的升高而升高，以T5 處理最高，較T1 處理顯著提高81.20%，與CK 無(wú)顯著差異，其他處理均低于CK。僅添加SNP 的處理間CAT 活性差異不顯著，均顯著高于T1 處理，稍低于CK。由此可知，生菜幼苗在Cd 脅迫下的CAT 活性會(huì)受到一定程度的抑制，而添加適當(dāng)?shù)耐庠碞O 則可一定程度地緩解這種抑制作用。

圖7 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜幼苗CAT活性的影響Fig.7 Effects of exogenous NO on the CAT activity of lettuce seedlings under cadmium stress

2.3.2.3 SOD 活性 由圖8 可知，生菜幼苗遭遇Cd脅迫后SOD 活性較CK 顯著降低；在Cd 脅迫下添加不同濃度的外源NO，POD 活性顯著升高，且隨著SNP 濃度的升高而升高，以T5 處理最高，較T1 處理顯著提高63.27%，所有處理均低于CK。僅添加SNP的處理中，T6、T8、T9處理間POD活性差異不顯著，均顯著高于CK；T7 處理與CK 無(wú)顯著差異。由此推斷，Cd 脅迫對(duì)生菜幼苗SOD 活性有抑制作用，而外源NO則可以適當(dāng)緩解Cd脅迫的毒害效應(yīng)。

圖8 外源NO對(duì)Cd脅迫下生菜幼苗SOD活性的影響Fig.8 Effects of exogenous NO on the SOD Activity of lettuce seedlings under cadmium stress

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果表明，外源NO 對(duì)Cd 脅迫下生菜種子發(fā)芽率、發(fā)芽勢(shì)均無(wú)顯著影響，但總體上可顯著提高生菜幼苗葉綠素含量、地上部長(zhǎng)度、地下部長(zhǎng)度及POD、CAT、SOD 活性，顯著降低MDA 含量，以250 μmol/L SNP處理效果最佳。

近年來(lái)，關(guān)于重金屬脅迫對(duì)植物生長(zhǎng)的影響及緩解措施研究較多[1?3，5?7，9?23]，大多學(xué)者[9?17]均認(rèn)為，外源NO 對(duì)植物重金屬脅迫存在劑量效應(yīng)，低濃度有緩解效應(yīng)，高濃度有毒害效應(yīng)。本研究得出類似結(jié)論，Cd 脅迫會(huì)嚴(yán)重抑制生菜的生長(zhǎng)，適宜濃度外源NO 可以緩解Cd 對(duì)生菜的毒害。徐林林[19]通過(guò)將SNP直接施入土壤、包進(jìn)膠囊顆粒和紙袋、制成緩釋顆粒肥、制成溶液葉面噴施5 種方式向Cd 污染土壤中生長(zhǎng)的生菜供應(yīng)NO，5 種方式對(duì)緩解生菜Cd 毒害的效應(yīng)各異，效果最差的是SNP 直接施入土壤，最佳方式則是葉面噴施，SNP 最佳噴施濃度為500 μmol/L。本研究采用水培方式，設(shè)置100、150、200、250 μmol/L 4 個(gè)濃度，發(fā)現(xiàn)250 μmol/L SNP 效果最好。可能是因?yàn)樗喾绞?，生菜根系漂浮水中，更易吸收SNP 溶液，所以SNP 濃度較徐林林[19]認(rèn)為的低。