紫外分光光度法測定鴨腳通顆粒中總黃酮的含量

★ 易徐航　張鈺琪　袁娟麗（萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗所 江西 萍鄉(xiāng) 337000）

鴨腳通顆粒為萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院的醫(yī)院制劑，具有益氣補虛之功效，用于尿路結(jié)石的治療。本品為銀杏樹根經(jīng)加工制成的顆粒。銀杏又稱白果，是我國特有的珍稀樹種。近年來，國內(nèi)外學者對銀杏的化學成分、藥理作用等做了大量的研究工作。研究發(fā)現(xiàn)，其主要成分包括淀粉、蛋白質(zhì)、酚類、黃酮類、萜類、生物堿、多糖類、氨基酸、微量元素等成分，具有鎮(zhèn)咳、平喘、抗菌、抗疲勞、消炎、抗病毒、抗癌等作用［1-2］；其中銀杏樹根中主要含有黃酮類化合物，不含山奈酚、異鼠李素等物質(zhì)［3-4］。目前鴨腳通顆粒收錄于2007年版《江西省食品藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療機構(gòu)制劑標準》，主要質(zhì)控項目僅為性狀、薄層鑒別兩個項目，尚未有鴨腳通顆粒的含量測定方法。隨著國家對醫(yī)院制劑標準的提高和規(guī)范化管理的加強［5］，為了保證制劑質(zhì)量，現(xiàn)建立鴨腳通顆粒中總黃酮的含量測定方法，本方法以蘆丁為指標性成分采用紫外分光光度法測定鴨腳通顆粒中總黃酮的含量，經(jīng)方法學驗證，該法簡便、快捷、準確，可用于鴨腳通顆粒的質(zhì)量控制。

1　材料

雙光束紫外可見分光光度計TU-1901（北京普析通用儀器有限公司）；ME-204（萬分之一天平，梅特勒-托利多國際貿(mào)易（上海）有限公司）；CP225D 電子分析天平（十萬分之一天平，賽多利斯科學儀器有限公司）。蘆丁對照品（92.6%，批號100080-201409，中國食品藥品檢定研究院）；水為娃哈哈水；鴨腳通顆粒由萍鄉(xiāng)市中醫(yī)院提供；其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1對照品溶液的制備 取蘆丁對照品20mg，精密稱定，置100mL量瓶中，加70%乙醇70mL，超聲處理使溶解，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得（每1mL中含蘆丁0.2mg）。

2.2供試品溶液的制備 取10袋本品內(nèi)容物，精密稱定，研細，取約2.5g，精密稱定，置25mL量瓶中，加70%乙醇20mL，超聲處理（功率500W，頻率40kHz）20min，放冷，加70%乙醇至刻度，搖勻，即得。

2.3吸收波長的選擇 取上述對照品溶液和供試品溶液3.0mL，分別置25mL量瓶中，加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液1mL，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min，同法用70%乙醇作空白。采用紫外分光光度計在400～700nm對蘆丁對照品溶液、供試品溶液和空白溶劑進行光譜掃描，以確定蘆丁對照品溶液和樣品溶液的最大吸收波長，最大吸收波長為508nm。

2.4標準曲線的制備 精密量取對照品溶液1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0mL，分 別 置 25mL量 瓶中，加水至6mL，加5%亞硝酸鈉溶液 1mL，混勻，放置6min，加10%硝酸鋁溶液1mL，搖勻，放置6min，加氫氧化鈉試液10mL，再加水至刻度，搖勻，放置15min；以相應的溶液為空白。在508nm波長處測定吸收度，以吸光度為縱坐標（Y）、濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線。

2.5測定方法 取上述供試品溶液適量，4000r/min離心10min，精密量取上清液3mL，置25mL量瓶中，照“2.4標準曲線的制備”項下的方法，自“加水至6mL”起，依法測定吸光度，通過標準曲線計算供試品溶液中蘆丁的量，即得。

2.6方法學考察

2.6.1線性范圍考察 按“2.4”項下制備標準曲線供試品，在508nm波長處測定吸收度，以吸光度為縱坐標（Y）、濃度為橫坐標（X），繪制標準曲線，得回歸方程：Y=74.57339X＋0.32877，r=0.9999。結(jié)果表明蘆丁濃度在7.5300～45.1810μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關系。

2.6.2精密度試驗 取同一標準品溶液，按“2.5”項下測定法重復測定6次，測定蘆丁吸光度的RSD為0.10%。結(jié)果表明該方法具有較好的精密度。

2.6.3重現(xiàn)性試驗 取同一批號樣品共6份，按“2.2”項下供試品溶液的制備方法制備供試液，測定蘆丁的含量（mg/袋），計算得蘆丁含量的RSD為0.58%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6.4穩(wěn)定性試驗 取供試品溶液，室溫保存，按“2.5”項下測定法測定，分別于0，5，10，15，20，25，30，40，50min測定蘆丁的吸光度，測得蘆丁吸光度的RSD為2.86%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下50min內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5加樣回收率試驗 取已知含量（14.38mg/袋）的鴨腳通顆粒樣品約1.25g，精密稱定，研細，置25mL量瓶中，分別加入適量蘆丁標準儲備液，按“2.5”項下測定方法測定含量，計算加樣回收率（n=6），結(jié)果表明蘆丁的平均回收率為94.24%（RSD%=2.98），符合方法學要求。見表1。

表1　加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.7樣品測定 取不同批號鴨腳通顆粒樣品，按“2.5”項下測定法測定吸光度，通過標準曲線計算供試品溶液中蘆丁的量，結(jié)果見表2。

表2　樣品含量測定結(jié)果（n=3） mg/袋

3　討論

紫外分光光度法是常見的總黃酮測定方法之一［6］，其中以亞硝酸鈉-硝酸鋁-氫氧化鈉法最常用［7］，以蘆丁作為對照，銀杏樹根中黃酮類化合物與鋁鹽（NaNO2-Al（NO3）3-NaOH）反應生成紅色絡合物，在可見光區(qū)能獲得穩(wěn)定的特征吸收峰，故本試驗采用比色法測定鴨腳通顆粒中總黃酮的含量。

在提取方法的選擇中，比較了以70%乙醇、甲醇、無水乙醇為提取溶劑，結(jié)果表明以70%乙醇提取效率最高，分別超聲處理10，20，30min，最后確定采用70%乙醇超聲（500W，40kHz）處理20min為宜。在做穩(wěn)定性試驗考察時發(fā)現(xiàn)樣品隨著時間的增加，吸光度會逐漸的減少，故制備完對照品、供試品溶液應在50min之內(nèi)完成測定，嚴格控制測定的時間。

從對5批鴨腳通顆粒中總黃酮的含量測定結(jié)果來看，總黃酮含量相差較大，提示銀杏樹根原藥材的質(zhì)量存在差別，為避免由原藥材引起中成藥的療效差異，因此有必要對其進行質(zhì)量控制。本文建立了鴨腳通顆粒中總黃酮的含量測定方法，經(jīng)方法學驗證，該方法準確、快速，簡便，重現(xiàn)性好，可用于鴨腳通顆粒的質(zhì)量評價。