苯那普利和氯沙坦對腎間質(zhì)纖維化幼鼠組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的抑制作用*

趙曉華，劉寶環(huán)，李冠慧,馬　宏

(1.河北省滄州市人民醫(yī)院兒科　061000；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院兒科，山西太原 030001)

腎臟纖維化是各種不同病因的慢性腎臟疾病進展到終末期腎病的共同病理過程，包括腎小球硬化與腎間質(zhì)纖維化[1]。近年來大量研究表明，腎功能的損傷程度與腎小管間質(zhì)病變的嚴重程度密切相關(guān)[2]。腎小管間質(zhì)損傷程度是反映腎功能下降嚴重程度和判斷預(yù)后最重要的指標。因此，研究腎間質(zhì)纖維化的分子機制，探索有效的防治措施，對延緩終末期腎病的進程，延長患者生命意義重大。腎小管間質(zhì)纖維化是多種疾病引起腎損傷的重要病理特征，也是導(dǎo)致腎功能不可逆改變的重要病理基礎(chǔ)之一。腎小管間質(zhì)纖維化主要的病理表現(xiàn)：腎間質(zhì)出現(xiàn)單核細胞及淋巴細胞的浸潤，腎小管足細胞受損變形，腎間質(zhì)成纖維細胞活化增生，細胞外基質(zhì)大量沉積，形成瘢痕硬化[3-5]。

目前對于腎間質(zhì)纖維化的原因尚未完全闡明，但是已有研究證實，有多種細胞因子和血管活性物質(zhì)的產(chǎn)生和釋放與纖維化形成有關(guān)，其中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是重要的誘導(dǎo)因子，很多其他的細胞因子是通過TGF-β1來發(fā)揮作用。這些誘導(dǎo)因子共同作用于腎臟組織和細胞，使得腎小管上皮細胞和腎間質(zhì)細胞凋亡增加，細胞外基質(zhì)合成增加，最終導(dǎo)致細胞外基質(zhì)的大量沉積而出現(xiàn)腎間質(zhì)纖維化[6-7]。近年來發(fā)現(xiàn)TGF-β1對組織型轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶(tTG)具有調(diào)節(jié)作用，研究表明，tTG可以使細胞外基質(zhì)蛋白之間形成難降解的氨基酸肽鍵促進基質(zhì)蛋白的沉積，因此tTG也被認為是導(dǎo)致腎臟纖維化的重要誘導(dǎo)因子[8]。

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)及血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)通過降低系統(tǒng)高血壓及腎小球內(nèi)高壓的腎臟保護作用已為人們熟知，但它們的抗纖維化作用近年來才引起重視[9-10]。不僅已在動物實驗證實其抗纖維化作用，也是目前臨床上廣泛用于抗腎臟及心臟纖維化的藥物。本研究探討ACEI藥物苯那普利及ARB藥物氯沙坦對幼鼠腎間質(zhì)纖維化過程中TGF-β1和tTG的影響，以期為研究腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展及治療提供一些實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動物分組及模型建立雄性wistar幼鼠60只，3～4周齡，體質(zhì)量80～100 g，正常飲食，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，按照隨機數(shù)字表法分為對照組、模型組和干預(yù)組，每組20只。對模型組和干預(yù)組幼鼠建立單側(cè)輸尿管結(jié)扎模型(UUO模型)，具體方法：5%水合氯醛6 mL/kg腹腔注射麻醉，幼鼠下腹部常規(guī)備皮、消毒，腹正中切口，分離輸尿管，雙線結(jié)扎左側(cè)輸尿管，并從中間剪短，縫合切口。對照組幼鼠僅分離輸尿管，不結(jié)扎和剪短，之后縫合。

1.2干預(yù)方法干預(yù)組從建模后第2天起灌胃給予苯那普利和氯沙坦各6 mg/(kg·d)，1次/天；對照組和模型組灌胃給予等量生理鹽水。且于實驗開始后第3、7、14、28天每組取5只鼠，切取左腎，固定、脫水、石蠟包埋制成標本，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3檢測指標(1)HE染色：3 μm石蠟切片脫蠟至水，蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察腎組織結(jié)構(gòu)情況、腎間質(zhì)炎性浸潤情況。(2)Masson染色：采用200倍光學(xué)顯微鏡采集染色圖像，運用多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)進行測量分析，計算腎間質(zhì)纖維化組織相對面積(綠染區(qū)面積/總面積×100%)，求和取平均值作為腎間質(zhì)纖維化得分，用以評價腎間質(zhì)纖維化程度。(3)免疫組化染色：采用非生物素標記的PV6001二步法，檢測3組腎組織tTG、TGF-β1的表達，所用一抗、二抗來自中杉金橋生物技術(shù)有限公司和Newmaker公司，嚴格按照說明書進行各項操作。采用圖像分析軟件分析結(jié)果，觀察200倍光學(xué)顯微鏡下圖像15～25個，計算陽性染色區(qū)域的平均光密度值。

2　結(jié)　　果

2.13組幼鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化情況術(shù)后3組幼鼠恢復(fù)良好，無明顯感染和死亡情況發(fā)生。HE染色結(jié)果顯示對照組腎臟組織無明顯病理改變，腎小管排列整齊，腎間質(zhì)無炎性細胞浸潤。模型組幼鼠第3天時可見小部分腎小管出現(xiàn)，局部組織炎性細胞浸潤；隨著時間的延長(第3天→第7天→第14天→第28天)腎小管廣泛擴張，小管上皮細胞出現(xiàn)空泡樣變性，部分出現(xiàn)蛋白或管型，腎組織有大量炎性細胞浸潤。干預(yù)組腎小管部分擴張，擴張程度低于模型組，但仍高于對照組。Masson染色結(jié)果顯示對照組腎間質(zhì)無明顯綠染，模型組綠染面積顯著增加，干預(yù)組小部分綠染，方差分析結(jié)果顯示，3組之間綠染面積比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),且隨著時間延長，模型組和干預(yù)組綠染面積逐漸增加(P<0.01)。見表1。

2.23組幼鼠不同時間點tTG蛋白表達情況 tTG陽性表達為棕黃色顆粒沉積。免疫組化結(jié)果顯示，對照組tTG腎間質(zhì)和腎小球區(qū)域未見棕黃色顆粒沉積，且不同時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組自第3天時腎間質(zhì)可見棕黃色顆粒沉積，隨著時間延長(第3天→第7天→第14天→第28天)，染色逐漸加深(P<0.01)，呈片狀沉著。干預(yù)組在腎間質(zhì)區(qū)可見淡黃色顆粒沉積，隨時間延長有增加趨勢(P<0.01)。3組光密度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表2。

2.33組幼鼠不同時間點TGF-β1蛋白表達情況TGF-β1陽性表達為棕褐色顆粒沉積。免疫組化結(jié)果顯示，對照組TGF-β1主要在腎小管上皮細胞見褐色顆粒沉積，模型組顏色加深，且在腎間質(zhì)區(qū)域可見到棕褐色顆粒，隨著時間延長(第3天→第7天→第14天)，染色逐漸加深(P<0.01)。干預(yù)組在腎間質(zhì)區(qū)可見少量顆粒沉積，隨時間延長有增加趨勢(P<0.01)。3組TGF-β1光密度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。見表3。

表1　　3組幼鼠不同時間點Masson綠染面積百分比比較

表2　　3組幼鼠不同時間點tTG光密度值比較

表3　　3組幼鼠不同時間點TGF-β1光密度值比較

2.4相關(guān)性分析Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示，模型組幼鼠tTG水平與Masson染色面積呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.854,P<0.01)；tTG水平與TGF-β1水平呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.813,P<0.01)。

3　討　　論

腎臟纖維化是各種終末期腎病常見的病理變化，多是由于各種致病因子的長期作用，導(dǎo)致腎間質(zhì)細胞增加，蛋白合成增多，細胞外基質(zhì)大量沉積導(dǎo)致腎小球和腎小管纖維化。腎臟纖維化一般分為3個階段：第1階段為炎性反應(yīng)期，各種細胞因子及分泌物不斷作用于腎臟，導(dǎo)致炎性細胞出現(xiàn)浸潤，出現(xiàn)腎臟固有細胞的損傷；第2階段為基質(zhì)合成階段，主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)開始沉積，以及細胞因子和炎性因子等纖維化因子進一步釋放；第3階段為纖維化形成階段，該階段腎臟已成為纖維化樣物質(zhì)[11]。

隨著腎臟纖維化的研究逐漸深入，目前已知的腎臟纖維化誘導(dǎo)因子包括TGF-β1、缺氧誘導(dǎo)因子-1α、結(jié)締組織生長因子、血管內(nèi)皮生長因子及腫瘤壞死因子等，以上因素作用于腎臟組織和細胞，可以增加腎臟細胞外基質(zhì)的合成或(和)抑制其降解，共同參與腎臟纖維化病理過程[12-13]。TGF-β主要來源于血小板、淋巴細胞和單核細胞。已有研究表明TGF-β包括5個不同的亞型(TGF-β1～5)，其中TGF-β1在致纖維化過程中發(fā)揮重要作用，其他多種誘導(dǎo)因子通過直接或者間接作用于TGF-β1起作用[14-15]。有研究表明，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)是降解細胞外基質(zhì)的主要酶，TGF-β1能影響成纖維細胞中MMP-2的基因表達和轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致MMP-2蛋白生成減少和活性降低，降解細胞外基質(zhì)的能力下降[16-17]。tTG是TGF-β1活化的重要酶類之一，近年來有研究表明，tTG也可能導(dǎo)致腎臟纖維化，生理情況下TGF-β1以潛活性的復(fù)合物形式分泌出細胞，其激活的前提是TGF-β1與其前肽解離。tTG催化TGF-β1連接蛋白(LTBP)與細胞外基質(zhì)(ECM)交聯(lián)，從而使TGF-β1與其潛活相關(guān)肽解離，釋放出活性結(jié)構(gòu)[18]。tTG導(dǎo)致的TGF-β1的活化反過來可以引起tTG的基因表達，兩者組成一個有效的放大系統(tǒng)。有研究通過培養(yǎng)人腎間質(zhì)成纖維細胞在蛋白質(zhì)和mRNA水平證實該細胞有tTG表達，TGF-β1可以上調(diào)腎間質(zhì)成纖維細胞tTG的表達，兩者之間存在時間、劑量依賴性,說明TGF-β1對腎間質(zhì)成纖維細胞tTG表達的調(diào)節(jié)依賴于其mRNA的合成。而TGF-β1與tTG的這種正反饋機制在細胞外基質(zhì)聚集和纖維化形成中有重要意義。有研究對tTG基因敲除的大鼠行單側(cè)輸尿管梗阻術(shù)后發(fā)現(xiàn)，TGF-β1的蛋白表達量較未敲除大鼠減少，其腎間質(zhì)纖維化程度較未敲除的大鼠明顯減輕。tTG可能通過以下的機制促進腎間質(zhì)纖維化：(1)催化形成ε-(γ-谷氨?；?賴氨酸肽鍵，使蛋白分子內(nèi)和分子間形成穩(wěn)定的交聯(lián)產(chǎn)物，而使細胞外基質(zhì)更加穩(wěn)定；(2)激活促纖維化的重要因子，即組織生長因子TGF-β1，并形成正反饋；(3)上調(diào)結(jié)締組織生長因子(CTGF)的表達，而CTGF和TGF-β1均可以通過刺激腎小管上皮細胞、腎間質(zhì)成纖維細胞分泌tTG至腎間質(zhì)中，導(dǎo)致細胞外基質(zhì)蛋白交聯(lián)；(4)介導(dǎo)新型的細胞凋亡方式，主要發(fā)生在腎小管上皮細胞，促進腎小管的萎縮，腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。此外，tTG還可以作用于胰島素樣生長因子、血小板源性生長因子(PDGF)促進腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生、發(fā)展。

本研究HE染色結(jié)果顯示，對照組腎臟組織無明顯病理改變，腎小管排列整齊，腎間質(zhì)無炎性細胞浸潤。模型組幼鼠3 d時可見小部分腎小管出現(xiàn)，局部組織炎性細胞浸潤；隨著時間的延長(第3天→第7天→第14天→第28天)腎小管廣泛擴張，小管上皮細胞出現(xiàn)空泡樣變性，部分出現(xiàn)蛋白或管型，腎組織有大量炎性細胞浸潤。干預(yù)組腎小管部分擴張，擴張程度低于模型組，但仍高于對照組。Masson染色結(jié)果顯示對照組腎間質(zhì)無明顯綠染，模型組綠染面積顯著增加，干預(yù)組小部分綠染，方差分析結(jié)果顯示，3組之間綠染面積比較，且隨著時間延長，模型組和干預(yù)組綠染面積逐漸增加。說明苯那普利和氯沙坦對治療腎臟損傷的效果減少，可以明顯降低細胞外基質(zhì)的沉積，改善纖維化程度。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對照組TGF-β1主要在腎小管上皮細胞見褐色顆粒沉積，模型組顏色加深，且在腎間質(zhì)區(qū)域可見到棕褐色顆粒，隨著時間延長，染色逐漸加深。干預(yù)組在腎間質(zhì)區(qū)可見少量顆粒沉積，隨時間延長有增加趨勢(P<0.01)。3組TGF-β1光密度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。tTG陽性表達為棕黃色顆粒沉積。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，對照組tTG腎間質(zhì)和腎小球區(qū)域未見棕黃色顆粒的沉積，且不同時間點比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，模型組自第3天時腎間質(zhì)可見棕黃色顆粒沉積，隨著時間延長(第3天→第7天→第14天→第28天)，染色逐漸加深(P<0.01)，呈片狀沉著。干預(yù)組在腎間質(zhì)區(qū)可見淡黃色顆粒沉積，隨時間延長有增加趨勢(P<0.01)。3組tTG光密度值比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。該結(jié)果說明苯那普利和氯沙坦可以通過抑制TGF-β1和tTG起到抗纖維化作用。

綜上所述，腎間質(zhì)纖維化過程中tTG與TGF-β1呈正相關(guān)關(guān)系，苯那普利和氯沙坦抗纖維化作用可能與抑制tTG、TGF-β1有關(guān)。