基于全基因組De novo測序的異常漢遜酵母菌株792基因組重復序列的分布特征研究

王　婷， 張寒玉， 蔡長龍， 唐　朝， 毛培宏,，錢衛(wèi)東*， 李永東

(1.陜西科技大學 食品與生物工程學院, 陜西 西安　710021; 2.新疆大學 離子束生物技術中心, 新疆 烏魯木齊　830046; 3.西安工業(yè)大學 離子束生物工程與生物多樣性研究中心, 陜西 西安　710032； 4.寧波市疾病預防控制中心， 浙江 寧波　315010)

0　引言

酵母菌根據(jù)其合成乙醇能力的差異分為釀酒酵母和非釀酒酵母.大量研究表明一些非釀酒酵母對酒的品質(zhì)發(fā)揮積極作用，特別是產(chǎn)香氣型酵母，其賦予果酒濃郁的發(fā)酵香味，對果酒中醇類、酯類物質(zhì)的形成扮演著重要的角色.因此，近年來非釀酒酵母的釀酒作用、生物多樣性、分離鑒定及其潛在應用價值研究已成為國內(nèi)外的研究熱點[1].前期本課題組從陜西洛川蘋果表面分離一株產(chǎn)香氣能力強的異常漢遜酵母(Hansenulaanomala)，命名為Hansenulaanomala792.

異常漢遜酵母作為一種重要的非釀酒酵母，具有高產(chǎn)乙酸乙酯的能力，且在較高溫度的下具有較強的發(fā)酵力和酯化力.同時還具有一定的產(chǎn)酒精能力，并可以降低乙酸含量，提高丙三醇含量，提高有益香氣成分含量[1-5].目前，一些研究主要關注非釀酒酵母異常漢遜酵母的產(chǎn)香氣代謝能力研究，對其基因組的遺傳背景的研究報道相對較少.

重復序列是真核生物基因組中重要的組成部分，按其在基因組中的分布方式，分為串聯(lián)重復序列(Tandem Repeat Sequences)和散在重復序列(Interspersed Repeat Sequences)[6].串聯(lián)重復序列又可根據(jù)其重復單元長度劃分為衛(wèi)星DNA (Satellite DNA)[7]、小衛(wèi)星DNA (Minisatellite DNA)[8]和微衛(wèi)星DNA (Microsatellite DNA)[9].其中微衛(wèi)星DNA又稱為短串聯(lián)重復序列(Short Tandom Repeat,STR)或簡單重復序列(Simple Sequence Repeats,SSRs)，隨機分布于生物體整個基因組中.微衛(wèi)星標記作為理想的分子遺傳標記，被廣泛地用于目的基因篩選、基因診斷多樣性分析及遺傳連鎖圖譜構建等工作中.而散在重復序列(又稱轉座子元件，Transposable Element,TE)分為RNA介導的轉座元件(又稱 RNA轉座子)和DNA介導的轉座元件(又稱DNA 轉座子)，不僅可以影響基因組的大小，還能直接或間接促成基因組重排，并可影響基因表達水平、改寫基因調(diào)控網(wǎng)絡[10].

本研究在異常漢遜酵母菌株792(Hansenulaanomala792)全基因組denovo測序的基礎上，利用生物信息學方法分析其基因組中各種重復序列的類型及分布特點，以期深入了解漢遜酵母菌株基因組結構中重復序列的特征，為基于重復序列定向進化的分子育種及開發(fā)SSR分子標記提供理論依據(jù).

1　實驗部分

1.1　菌株及其全基因組De nove測序

菌株分離自陜西洛川蘋果表面，經(jīng)常規(guī)培養(yǎng)，分離純化，收集菌體，利用18S rDNA、28S rDNA和ITS(Internal Transcribed Spacer)的分子生物學方法鑒定為異常漢遜酵母，命名為異常漢遜酵母792，現(xiàn)保存于陜西科技大學食品與生物工程學院微生物制造研究室.異常漢遜酵母792菌株由北京諾禾致源生物信息科技有限公司微生物部制備基因組DNA，并應用PacBio單分子測序技術對其進行全基因組Denove測序，所獲得的全基因組DNA序列，作為本研究的基本數(shù)據(jù).

1.2　基因組中重復序列的獲取

應用TRF(Tandem Repeat Finder)方法 (http://tandem.bu.edu/trf/trf404.linux64.download.html)獲取異常漢遜酵母菌株792全基因組DNA序列中的串聯(lián)重復序列，最大的重復單元bp數(shù)設置為2 000 bp.

對TRF獲取的結果進行細分，設置微衛(wèi)星DNA序列重復單位為2～6 bp，小衛(wèi)星DNA序列重復單位為10～60 bp.

使用RepeatMasker 方法(http://www.repeatmasker.org/RMDownload.html)獲取異常漢遜酵母菌株792全基因組DNA序列中的散在重復序列.

2　結果與討論

2.1　微衛(wèi)星DNA序列在基因組中的分布特征

應用TRF方法在異常漢遜酵母菌株792基因組中發(fā)現(xiàn)了175個SSR，總長分別為8 163 bp，占基因組DNA序列總長度的0.059%，平均每78.63 Kb就能檢測到一個SSR.

SSR在三核苷酸(Tri-)模體中的數(shù)目最多，為94條，占重復序列總數(shù)的53.71%；其次是六核苷酸(Hexa-)模體，為47條，占26.86%；五核苷酸(Penta-)和四核苷酸(Tetra-)模體數(shù)目相對較少，分別13～16條之間，占比約為7.43%～9.14%；二核苷酸(Di-)模體的重復序列最少，僅有3條，占1.71%.具體如圖1所示.

圖1　異常漢遜酵母菌株792基因組中不同模體類型的SSR分布

堿基類型的重復基序分析結果如表1所示.由表1可知，在4種兩堿基類型重復中，僅有AT重復基序.

三堿基類型重復基序有10種，其中數(shù)量較多的堿基類型依次是AAC(49條，52.13%)、ACT(15條，15.96%)、AAG(11條，11.70%).累積長度最長的依然是上述三個類型的重復序列：AAC(2011 bp)、ACT(744 bp)、AAG(545 bp).

四堿基類型重復序列中含有AAAT、AACT、ATTA、GAAT和GTTG重復類型，且前兩種類型數(shù)量較多，占四堿基重復序列數(shù)目的73.33%，長度較長，約占四核苷酸重復序列累積長度的74.05%.五堿基類型重復序列共有16條，其中AAAAC、TATAC和TGAAT重復單元的序列各有2條，共占五核苷酸重復的37.5%，其余各類型基序重復序列均只有1條.六堿基類型重復序列共46條，其每種重復單元基序數(shù)目均為1～2個.

表1　異常漢遜酵母菌株792基因組微衛(wèi)星DNA的重復基序分布

續(xù)表1

重復類型重復序列數(shù)目占SSR總數(shù)的百分比/%累積長度/bp占SSR總長度百分比/%拷貝數(shù)范圍平　均拷貝數(shù)GATGAC10.57410.506.86.8GATGGT10.57510.628.58.5GGATCA10.57380.476.36.3GGTTCA10.57330.405.55.5GTGAAA10.571121.371919TATTAC10.57520.649.39.3TCATAA10.57330.405.55.5TCATCC10.57350.435.85.8TCATTT10.57290.364.84.8TCTTCA21.141201.478.3～11.29.75TCTTCC21.141301.5910～11.710.85TGAAGA21.141121.378.7～109.35TGAGGT21.14841.035.5～8.57TGATGG10.57350.435.85.8TGATGT10.57300.3755TGCTGT10.57320.395.35.3TTATGT10.57330.405.55.5TTCGTC10.57330.405.55.5TTCTGA21.14750.925.3～7.26.25TTCTTC10.571932.3632.232.2TTGCTG10.57270.334.54.5TTGTTT10.57340.425.75.7Subtotal4726.86239029.284.2～32.28.51

各種重復類型的拷貝數(shù)分析結果如表2所示.由表2可以看出，微衛(wèi)星序列均在低拷貝區(qū)出現(xiàn)頻率較高，拷貝數(shù)低于15次的微衛(wèi)星序列占比75.43%；拷貝數(shù)在15～27之間的微衛(wèi)星序列，占比17.14%；拷貝數(shù)在27～39之間的占比6.86%；拷貝數(shù)大于39次的微衛(wèi)星序列最少，僅占0.57%.五種重復單位的平均拷貝數(shù)分別為33、15.04、12.76、7.33、8.51.從圖2可以看出，拷貝數(shù)越大，微衛(wèi)星序列數(shù)目越少，微衛(wèi)星平均拷貝數(shù)隨著重復單位長度的增加而減少.

表2　異常漢遜酵母菌株792基因組微衛(wèi)星DNA不同模體的拷貝數(shù)分布

上述研究數(shù)據(jù)表明，重復序列是基因組的重要組成部分，對生物的進化、遺傳和基因的表達與調(diào)控有重要作用.重復序列是考察遺傳物質(zhì)在進化中無數(shù)次的重組及整合的活化石，其出現(xiàn)說明基因組中的遺傳物質(zhì)在不斷地進行自我復制，并進行水平交換和垂直交換，對豐富生物的遺傳信息具有重要作用[11].生物體中許多關鍵基因是單拷貝的，重復序列的存在能保護這些重要的基因結構不受破壞，同時也是新基因產(chǎn)生的物質(zhì)基礎，是驅動生物進化的重要因素之一[12].

圖2　異常漢遜酵母菌株792基因組微衛(wèi)星DNA的重復單元長度與拷貝數(shù)關系

2.2　小衛(wèi)星DNA序列在基因組中的分布特征

利用TRF方法在異常漢遜酵母菌株792基因組的串聯(lián)重復序列中發(fā)現(xiàn)了1 384條小衛(wèi)星DNA序列，總長分別為79 849 bp，占串聯(lián)重復序列長度的33.80%，占基因組序列總長的0.58%，平均每10 Kb出現(xiàn)一個小衛(wèi)星序列.

小衛(wèi)星DNA的長度介于25 bp至958 bp之間，根據(jù)其序列長度可分為142種類型，長度為25～78 bp的序列數(shù)目占76.81%，30 bp的小衛(wèi)星序列最多，有80條，長度大于82 bp的序列各含一條.長度為15 bp的重復單位序列數(shù)目最多，有211條，占小衛(wèi)星序列總數(shù)的15.25%.重復單元為15 bp的序列累積長度最長，高達8 328 bp，占小衛(wèi)星序列總長的10.43%.各重復單元的拷貝數(shù)范圍為1.9～42.5，平均拷貝數(shù)為2.6的重復序列數(shù)目最多，有211條.小衛(wèi)星DNA序列的重復類型數(shù)目、序列長度及拷貝數(shù)見圖3所示.

圖3　異常漢遜酵母菌株792基因組小衛(wèi)星DNA序列的重復單元長度與其數(shù)量關系

小衛(wèi)星DNA序列數(shù)目與重復單位長度有一定關系，隨著重復單位長度的增加呈下降趨勢，這一特征在重復單元大于15 bp的小衛(wèi)星序列中尤為顯著；與微衛(wèi)星DNA類似，小衛(wèi)星DNA序列重復單位拷貝數(shù)較低，主要分布在1～3次；重復單元拷貝數(shù)與小衛(wèi)星DNA序列之間無顯著相關關系，見圖4所示.

圖4　異常漢遜酵母菌株792基因組小衛(wèi)星DNA序列的重復單元長度與其拷貝數(shù)關系

2.3　散在重復序列在基因組中的分布特征

運用RepeatMasker方法，獲得了異常漢遜酵母菌株792基因組中的多種散在重復序列(表3所示)，其在基因組中占比很小，僅為0.79%左右.其中長末端重復序列(LTR)數(shù)目最多，為695條，占總數(shù)的46.30%；其次是DNA轉座子，為459個；長散在重復序列(LINE)共303條；而短散在重復序列(SINE)只有25條；滾環(huán)(RC)14個.各類型散在重復的總長度分布與數(shù)目分布保持一致，其長度大小關系為LTR>DNA>LINE>SINE>RC，各占散在重復序列總長的48.54%、30.62%、23.42%、1.38%和1.27%.值得注意的是，雖然RC的重復序列數(shù)目較少，但其平均長度約為SINE的兩倍.

本研究所采用的RepeatMasker方法具有較高的效率和搜索速度，可以發(fā)現(xiàn)低拷貝數(shù)量的家族，但只能搜索同源序列，不能產(chǎn)生新的元素.這類方法被認為是黃金準則，通常作為查找重復序列的第一步.

表3　異常漢遜酵母菌株792基因組中散在重復序列的分布

3　結論

本研究利用生物信息學RepeatMasker方法分析了異常漢遜酵母菌株792全基因組中的重復序列在其基因組中的分布及特征.結果表明，重復序列在基因組中含量較少，為全基因組的2.52%；微衛(wèi)星DNA序列在其基因組中的占比不到千分之一，重復單元的拷貝數(shù)大多低于15個，重復單位長度與其拷貝數(shù)間存在著負相關；優(yōu)勢重復類型為三核苷酸重復，AAC為所有微衛(wèi)星DNA類型中數(shù)目最多的基序；兩核苷酸重復序列數(shù)目最少，且僅有AT重復.

在微衛(wèi)星DNA和小衛(wèi)星DNA中，AT含量均大于50%.這與Edwards等人的研究結果一致，AT類型重復的在植物、酵母和真菌類串聯(lián)重復序列中的頻率最高[13].串聯(lián)重復串聯(lián)序列中富含AT，與其全基因組DNA序列中AT含量較高有關，異常漢遜酵母菌株792全基因組的AT含量高達65.47%，為串聯(lián)重復序列中富含AT提供了基礎.對重復序列中的轉座元件的分析發(fā)現(xiàn)，RNA轉座子的數(shù)目與長度均高于DNA轉座子，這與其他酵母菌的研究結果一致[14].三核苷酸類型重復和六核苷酸類型重復是異常漢遜酵母菌株792基因組微衛(wèi)星DNA序列的優(yōu)勢核苷酸類型.

異常漢遜酵母菌作為漢遜酵母屬中常見的一個種，具有一些釀酒酵母缺乏的釀造特性，是釀造產(chǎn)品香氣成分的主要貢獻者之一[15,16]，有助于最終產(chǎn)品感官特性的提高[17]，本研究結果為其分子育種和SSR分子標記的開發(fā)提供了理論基礎，也為其遺傳多樣性研究提供了基礎數(shù)據(jù).