姜黃素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

彭?xiàng)澚? 王曉娜 楊軍

摘要 目的：探討姜黃素對(duì)大鼠視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷（RIRI）時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）的影響。方法：選取清潔級(jí)Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠96只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（n=32）：對(duì)照組（C組）、缺血/再灌注組（I/R組）和姜黃素組（CUR組）。I/R組和CUR組采用前房灌注法使眼內(nèi)壓升高而制備大鼠RIRI模型，缺血60 min，再灌注24 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。于缺血前60 min時(shí)，CUR組腹腔注射姜黃素100 mg/kg，C組和I/R組腹腔注射等容量生理鹽水。各組于再灌注24 h時(shí)處死8只大鼠，取視網(wǎng)膜組織，光鏡下觀察病理學(xué)改變；采用TUNEL法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)（AI）。3組于再灌注24 h時(shí)處死8只大鼠，取視網(wǎng)膜組織，電鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜組織超微結(jié)構(gòu)改變。3組于再灌注24 h時(shí)處死8只大鼠，取視網(wǎng)膜組織，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織中CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）同源蛋白（CHOP）、活化的轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）和X-盒結(jié)合蛋白-1（XBP1）mRNA表達(dá)。3組于再灌注24 h時(shí)處死8只大鼠，取視網(wǎng)膜組織，蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織中、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase-3）的蛋白表達(dá)，計(jì)算Bcl-2/Bax比值。結(jié)果：與C組比較，I/R組大鼠視網(wǎng)膜組織XBP-1、ATF4和CHOP mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）；與I/R組比較，CUR組大鼠視網(wǎng)膜組織XBP-1、ATF4和CHOP mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05）。與C組比較，I/R組大鼠視網(wǎng)膜組織CHOP、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)升高，Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值均下降，與C組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），CUR組大鼠視網(wǎng)膜組織CHOP、Bax和caspase-3蛋白表達(dá)下降，Bcl-2蛋白表達(dá)及Bcl-2/Bax比值均升高，與I/R組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與C組比較，I/R組大鼠視網(wǎng)膜組織出現(xiàn)形態(tài)結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)損傷，AI值升高（P<0.05）。與I/R組比較，CUR組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)結(jié)構(gòu)及超微結(jié)構(gòu)損傷均減輕，AI值降低（P<0.05）。結(jié)論：姜黃素可減輕大鼠RIRI，其機(jī)制可能與抑制ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

關(guān)鍵詞 姜黃素；CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白；活化的轉(zhuǎn)錄因子4；X-盒結(jié)合蛋白-1（XBP1）；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；再灌注損傷；視網(wǎng)膜

Abstract Objective：To investigate the effect of curcumin on endoplasmic reticulum stress （ERS） retinal ischemia/reperfusion injury （RIRI） in rats.Methods：A total of 96 Sprague-Dawley （SD） male rats were randomly divided into normal control group （C group），ischemia/reperfusion group （I/R group） and curcumin group （CUR group），with 32 rats in each group.The rat model of RIRI was established by using anterior chamber eannulafion to elevate intra-ocular pressure above systolic pressure for 60 minutes，and the test was finished after 24 h for reperfusion.Curcumin （100 mg/kg） was injected into the abdominal cavity 60 min before ischemia in CUR group，and the same dose of 0.9% normal saline was injected into the abdominal cavity at the same time points in C group and I/R group，respectively.In order to take the retinal tissue of rats，I/R model was established successfully and then eight rats were sacrificed 24 h after reperfusion，the changes of pathology of retinal tissue of rat were observed after conventional hematoxylin-eosin （HE） staining，and the cell apoptosis was detected by TUNEL method and the apoptosis index （AI） of retinal ganglion was calculated.Eight rats were sacrificed 24 h after reperfusion and retinal tissue was collected，and the ultrastructural changes of retinal tissue of rats were observed by transmission electron microscope.Eight rats were sacrificed 24 h after reperfusion and retinal tissue was collected，and the expressions of CCAAT-enhancer binding protein homologous protein （CHOP），activation of transcription factors （ATF4） and X-4 box binding protein 1 （XBP1） mRNA in retinal tissue were detected by reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）.Eight rats were sacrificed 24 h after reperfusion and retinal tissue was collected，and the expressions of CHOP，B-cell lymphoma-2 （Bcl-2），Bcl-2 associated X protein （Bax） and cysteinyl aspartate specific proteinase 3 （caspase-3） proteins in retinal tissue were measured by Western Bolt，and the ratio of Bcl-2 to Bax was calculated.Results：Compared with C group，the expressions of XBP1，ATF4 and CHOP mRNA of retinal tissue were significantly increased （P<0.05） in I/R group.Compared with I/R group，the expressions of XBP1，ATF4 and CHOP mRNA of retinal tissue were significantly decreased （P<0.05） in CUR group.Compared with C group，the expressions of CHOP，Bax and caspase-3 proteins were significantly higher （P<0.05），while the expression of Bcl-2 protein and the ratio of Bcl-2 to Bax were both lower （P<0.05） in I/R group.Compared with I/R group，the expressions of CHOP，Bax and caspase-3 protein were significantly lower （P<0.05），while the expression of Bcl-2 protein and the ratio of Bcl-2 to Bax were both higher （P<0.05） in CUR group.Compared with C group，the structure and the ultrastructure of retinal tissue of rats were more significantly injured，and AI was higher （P<0.05） in I/R group.Compared with I/R group，the injuries of the structure and the ultrastructure of retinal tissue of rats were distinctly alleviative，and AI was lower （P<0.05） in CUR group.Conclusion：Curcumin can significantly reduce RIRI in rats，and the mechanism may be related to alleviate ERS related cell apoptosis of retina.

Key Words Curcumin； CCAAT-enhancer binding protein homologous protein； Activation of transcription factors； X-4 box binding protein 1； Endoplasmic reticulum stress； Apoptosis； Ischemia/reperfusion； Retina

中圖分類號(hào)：R284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2018.04.035

視網(wǎng)膜缺血/再灌注損傷（Retinal Ischemical Reperfusion Injury，RIRI）是臨床常見的眼科疾病之一，主要發(fā)生于青光眼、糖尿病視網(wǎng)膜病變、缺血性視神經(jīng)病變、增殖性視網(wǎng)膜病變、視網(wǎng)膜中央動(dòng)靜脈栓塞、視網(wǎng)膜血管性疾病、新生兒視網(wǎng)膜病變、視神經(jīng)病變等眼部疾病，是眼科臨床診療工作中常見的視網(wǎng)膜病理過(guò)程，表現(xiàn)為血液再通后視網(wǎng)膜損傷嚴(yán)重，視功能反而進(jìn)一步下降。因此，臨床上有必要探討其有效的防治措施。姜黃素是一種從姜科植物姜黃等的根莖中提取出的黃色色素，為酸性多酚類物質(zhì)，具有抗炎、抗氧化等藥理作用[1]。有研究表明，姜黃素可減輕大鼠RIRI，作用機(jī)制與其抑制炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2-3]。但姜黃素抑制細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍未明確。因此，本實(shí)驗(yàn)采用大鼠RIRI模型，觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）及視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，并給予姜黃素進(jìn)行干預(yù)，探討該藥對(duì)大鼠RIRI的影響及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 C57BL/6雄性大鼠96只，8周齡，體重20～24 g，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，飼養(yǎng)于恒溫恒濕、12 h光照/12 h黑暗的環(huán)境，自由攝食和飲水。

1.1.2 藥物 姜黃素（美國(guó)Sigma-Aldrich公司，批號(hào)：C7727），生理鹽水（石家莊四藥有限公司），托吡卡胺（武漢五景藥業(yè)有限公司），氯霉素滴眼液（長(zhǎng)春迪瑞制藥有限公司）。

1.1.3 試劑與儀器 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒[寶生物工程（大連）有限公司]，CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBP）同源蛋白（CHOP）、活化的轉(zhuǎn)錄因子4（ATF4）和X-盒結(jié)合蛋白-1（XBP1）及甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物序列（生工生物工程（上海）股份有限公司），原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（德國(guó)羅氏公司），CHOP、B淋巴細(xì)胞瘤-2基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（caspase-3）一抗及GAPDH一抗（美國(guó)CST公司），二抗工作液（辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)山羊抗兔免疫球蛋白G，IgG，中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所），其余均為市售分析純。顯微手術(shù)器械（蘇州66視覺醫(yī)療器械廠），眼科顯微鏡（德國(guó)蔡司公司），T110TM型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）儀、680型全自動(dòng)酶標(biāo)儀及電轉(zhuǎn)儀和電泳儀（美國(guó)BIO-RAD公司），Powerlab系統(tǒng)（澳大利亞AD Instruments公司），BX51熒光顯微鏡、BX-50型光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司），Hitachih-7000FA透射電鏡（日本日立公司）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：對(duì)照組（C組）、缺血/再灌注組（I/R組）和姜黃素組（CUR組），每組32只。模型制備方法如下：腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉100 mg/kg麻醉后，消毒鋪巾，將大鼠側(cè)臥位置于預(yù)先準(zhǔn)備好的泡沫平板上，用膠布固定。右眼作為手術(shù)眼，左眼作為對(duì)照眼。在手術(shù)開始前，使用托吡卡胺散瞳，然后用氯霉素滴眼液輕輕沖洗結(jié)膜囊。使用30 G的銳利針頭作為穿刺針，另外一端與輸液瓶相連，然后打開輸液帶閥門通道，呈45°刺破角膜，使針尖緩緩進(jìn)入前房，避免損傷眼球組織內(nèi)的晶體和虹膜，用膠布把輸液帶固定在桌子上。慢慢抬高輸液瓶，使其與右眼垂直平面的高度為150 cm，此時(shí)前房?jī)?nèi)壓力達(dá)到110 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），光鏡下觀察大鼠眼睛，可見眼球內(nèi)球結(jié)膜和虹膜變?yōu)樯n白、水腫。缺血60 min后關(guān)閉輸液帶閥門通道，拔出針頭，結(jié)膜囊涂紅霉素眼膏；再灌注24 h后結(jié)束實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 給藥方法 分別于缺血前15 min和再灌注前5 min時(shí)，CUR組腹腔注射姜黃素25 μg/kg，C組和I/R組腹腔注射等容量生理鹽水。

1.2.3 光鏡下檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)的變化3組于再灌注24 h時(shí)處死8只大鼠，迅速摘除眼球，在冰水浴中環(huán)角鞏膜緣切開，棄去眼前節(jié)和晶體，外翻眼球，解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，置于4%多聚甲醛溶液中固定48 h，常規(guī)脫水透明，石蠟包埋，制備切片（厚約4 μm）。石蠟切片常規(guī)脫蠟入水，蒸餾水沖洗，蘇木精染色5～10 min，自來(lái)水充分沖洗10 min，75%鹽酸乙醇分化3 s，然后自來(lái)水中沖洗15～30 min以返藍(lán)。伊紅染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜組織病理學(xué)結(jié)果。

1.2.4 電鏡下觀察大鼠視網(wǎng)膜組織超微結(jié)構(gòu)的改變 3組于再灌注24 h時(shí)處死8只大鼠，迅速摘除眼球，在冰水浴中環(huán)角鞏膜緣切開，棄去眼前節(jié)和晶體，外翻眼球，解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，置于2.5%戊二醛溶液，固定24 h。經(jīng)漂洗、再固定、脫水、環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片后裝上銅載網(wǎng)格，行鉛鈾雙染，置于透射電鏡下觀察超微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.5 TUNEL法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況 石蠟切片二甲苯與梯度乙醇脫蠟與水化后，磷酸鹽緩沖液（PBS）徹底沖洗，37 ℃下使用蛋白酶K工作液處理30 min；采用TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行處理；拍照后用甲基綠復(fù)染數(shù)秒后立即用自來(lái)水沖洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，熒光顯微鏡下觀察視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡情況。200倍光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況，染色后，凋亡細(xì)胞核為棕褐色，未發(fā)生凋亡細(xì)胞核為藍(lán)紫色。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，計(jì)算細(xì)胞凋亡指數(shù)（AI）=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.6 逆轉(zhuǎn)錄-PCR（RT-PCR）檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織CHOP、ATF4和XBP1 mRNA的表達(dá) 3組于再灌注24 h時(shí)處死8只大鼠，迅速摘除眼球，在冰水浴中環(huán)角鞏膜緣切開，棄去眼前節(jié)和晶體，外翻眼球，解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，迅速用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后放入液氮冷卻，-80 ℃凍存。取視網(wǎng)膜組織100 mg，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度，OD260/OD280比值在1.78～2.0范圍內(nèi)的RNA樣品為合格樣品。應(yīng)用RT-PCR測(cè)定CHOP、ATF4和XBP1 mRNA表達(dá)水平。各目的基因的引物序列如下：CHOP：正義鏈：5′-GGGAAACAGCGCATGAAGGA-3′，反義鏈：5′-GCGTGATGGTGCTGGGTACA-3′；ATF4：正義鏈：5′-CCAGGGCCCACCAGACAGT-3′，反義鏈：5′-CGCCAGTGAGGGCCTTCCTGC-3′；XBP1：正義鏈：5′-CTGCCGCTCATGGTTCCGGG-3′，反義鏈：5′-TCTCCTCCGGGCTCAGGTGC-3′；GAPDH：正義鏈：5′-AACAAGTAACCCTCAACCCTG-3′，反義鏈：5′-ACACCCTCTGATACCCACATT-3′。建立反應(yīng)體系，GAPDH作為內(nèi)參照基因分別將其與CHOP、ATF4和XBP1在同一反應(yīng)體系內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s共40個(gè)循環(huán)。GAPDH、CHOP、ATF4和XBP1基因產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為377 bp、173 bp、204 bp和103 bp，反應(yīng)結(jié)束后，按儀器默認(rèn)條件收集熒光，把離心管迅速放入PCR擴(kuò)增儀，按擴(kuò)增程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)拍照，采用Image J軟件進(jìn)行各目的條帶光密度的半定量分析。

1.2.7 Western Blot檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織CHOP、Bcl-2、Bax及caspase-3的表達(dá)水平 3組于再灌注24 h時(shí)處死8只大鼠，迅速摘除眼球，在冰水浴中環(huán)角鞏膜緣切開，棄去眼前節(jié)和晶體，外翻眼球，解剖顯微鏡下剝離視網(wǎng)膜，迅速用預(yù)冷的生理鹽水沖洗后放入液氮冷卻，-80 ℃凍存。采用Western blot法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織Bax、Bcl-2、caspase-3和CHOP蛋白的表達(dá)。將視網(wǎng)膜組織塊加蛋白裂解液進(jìn)行勻漿裂解，提取蛋白，用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，然后把蛋白樣品分裝到離心管中，并加入上樣緩沖液，100 ℃沸水中煮沸5 min，使蛋白變性，制成蛋白濃度為4 g/L的電泳樣品，-20 ℃保存以備用。制備10% SDS-PAGE分離膠和5%濃縮膠，各取4 μL蛋白樣品進(jìn)行上樣，電泳4～5 h，轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，然后用5%牛奶封閉，分別加入Bax一抗（稀釋度1∶1 000）、Bcl-2一抗（稀釋度1∶1 000）、caspase-3一抗（稀釋度1∶1 000）、CHOP一抗（稀釋度1∶1 000）和GAPDH一抗（稀釋度1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜。TBST沖洗5～10 min，反復(fù)3次，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（稀釋度1∶500），室溫孵育1～2 h，洗膜、顯影、定影。采用Gel Doc凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描并測(cè)定各蛋白條帶的灰度值，以各目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值的比值分別反映各目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組大鼠視網(wǎng)膜組織形態(tài)學(xué)比較 光鏡下，C組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常，各層細(xì)胞排列整齊，未見空泡變性細(xì)胞，炎性反應(yīng)細(xì)胞極少見。見圖1。I/R組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)核層到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞開始減少，可見細(xì)胞空泡化現(xiàn)象，炎性反應(yīng)細(xì)胞增多。見圖2。CUR組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，水腫明顯減輕，炎性反應(yīng)細(xì)胞較少，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層空泡變性細(xì)胞數(shù)量減少。見圖3。

2.2 3組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變 C組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，細(xì)胞核完整，細(xì)胞器結(jié)構(gòu)完整且數(shù)目豐富，線粒體無(wú)水腫，嵴可見，電子密度低。見圖4。I/R組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞體積變小，線粒體明顯腫脹，嵴消失，核膜不完整，甚至固縮、斷裂，染色質(zhì)濃縮且分布不均，細(xì)胞出現(xiàn)一定程度的凋亡征象。見圖5。CUR組大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腫脹減輕，線粒體腫脹不明顯（黑色箭頭所示），嵴可見，核膜較完整，染色質(zhì)部分濃縮，分布尚均勻。見圖6。

2.3 3組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況的比較 TUNEL染色結(jié)果顯示，C組視網(wǎng)膜未見細(xì)胞凋亡發(fā)生；I/R組可見視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)核層細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡（箭頭）；CUR組視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)核層細(xì)胞凋亡明顯減少。見表1、圖7～9。

2.4 3組大鼠視網(wǎng)膜組織CHOP、ATF4和XBP1 mRNA表達(dá)比較 與C組比較，I/R組大鼠視網(wǎng)膜組織CHOP、ATF4和XBP1 mRNA表達(dá)均上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與I/R組比較，CUR組大鼠視網(wǎng)膜組織CHOP、ATF4和XBP1 mRNA表達(dá)明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見表2、圖10。

2.5 3組大鼠視網(wǎng)膜組織CHOP、Bax、Bcl-2及caspase-3蛋白表達(dá)比較 與C組比較，I/R組視網(wǎng)膜組織Bax、caspase-3和CHO蛋白P的表達(dá)上調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào)，Bcl-2/Bax比值下降（P<0.05）。與I/R組比較，CUR組視網(wǎng)膜組織Bax、caspase-3和CHOP蛋白的表達(dá)下調(diào)，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，Bcl-2/Bax比值升高（P<0.05）。見表3、圖11。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用前房灌注升高眼內(nèi)壓的方法建立大鼠視網(wǎng)膜RIRI模型，通過(guò)調(diào)節(jié)連有針頭的灌注容器高度來(lái)控制眼內(nèi)壓，造成視網(wǎng)膜的不同程度缺血損傷。有研究表明，通過(guò)前房灌注升高眼壓至110 mmHg而導(dǎo)致視網(wǎng)膜缺血；當(dāng)缺血時(shí)間60 min便可引起視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，視網(wǎng)膜形態(tài)和功能均發(fā)生不可逆改變[4]。本實(shí)驗(yàn)參考相關(guān)資料并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將缺血時(shí)間設(shè)定為60 min，眼壓升高設(shè)定為110 mmHg。本研究結(jié)果表明，光鏡下，I/R組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)紊亂，內(nèi)核層到神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層出現(xiàn)水腫，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞開始減少，可見細(xì)胞空泡化現(xiàn)象，炎性反應(yīng)細(xì)胞增多。提示大鼠RIRI模型復(fù)制成功。

本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[5]報(bào)道并結(jié)合預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選定分別于缺血前60 min時(shí)大鼠腹腔注射姜黃素100 mg/kg。本研究結(jié)果表明，光鏡下，CUR組大鼠視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，水腫明顯減輕，炎性反應(yīng)細(xì)胞較少，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層空泡變性細(xì)胞數(shù)量減少。提示姜黃素可減輕大鼠RIRI。

視網(wǎng)膜屬于神經(jīng)組織，其血供來(lái)自于視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈，該動(dòng)脈屬于終動(dòng)脈，故視網(wǎng)膜在缺血環(huán)境中極易受到損傷[6]。RIRI的機(jī)制比較復(fù)雜，是多種因素綜合反應(yīng)的結(jié)果，主要包括氧自由基的損傷、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、凋亡及凋亡基因的調(diào)控、炎性反應(yīng)損傷、細(xì)胞凋亡和壞死等多種病理生理過(guò)程[7-8]。其中，細(xì)胞凋亡在RIRI中具有重要作用，且已成為研究熱點(diǎn)之一。目前，細(xì)胞凋亡的途徑有兩條[9]，一條為外源性或死亡受體途徑引起的細(xì)胞凋亡途徑，這一途徑是細(xì)胞通過(guò)激活的死亡受體招募接頭蛋白Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白，進(jìn)而招募并激活caspase-8從而啟動(dòng)細(xì)胞凋亡；另一條為內(nèi)源性或線粒體途徑引起的細(xì)胞凋亡[10]。caspase是一組天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白酶，在凋亡信號(hào)作用下，線粒體膜上的通道開放，內(nèi)部Cytc和caspase的前體蛋白釋放出來(lái)，激活caspase核酸酶，或抑制胞內(nèi)的抗凋亡蛋白，使細(xì)胞發(fā)生凋亡[11]。Cytc是線粒體呼吸鏈的重要組成部分，既可通過(guò)對(duì)細(xì)胞能量代謝的調(diào)節(jié)來(lái)調(diào)控細(xì)胞死亡，又能通過(guò)對(duì)凋亡信號(hào)的傳導(dǎo)和放大直接介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[12]。目前較為明確的是，Cytc釋放到胞質(zhì)中可導(dǎo)致caspase-9激活，最終導(dǎo)致caspase-3的激活，誘發(fā)細(xì)胞凋亡[13]。研究表明，抑凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax的比值與細(xì)胞凋亡壞死有關(guān)[14-15]。研究表明，大鼠RIRI后導(dǎo)致視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞壞死凋亡，引起促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高，而抑凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)下降[16]。

RIRI后的缺血、缺氧導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞ATP與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)快速消耗后不能及時(shí)補(bǔ)充，出現(xiàn)能量代謝障礙誘發(fā)ERS。重新恢復(fù)血供后視網(wǎng)膜出現(xiàn)血液再灌注，再灌注后產(chǎn)生大量氧自由基、Ca2+超負(fù)荷等因素能夠加重ERS[17]。當(dāng)發(fā)生輕度ERS時(shí)，未折疊蛋白反應(yīng)通過(guò)下調(diào)翻譯和上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶分子等維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，從而保護(hù)細(xì)胞，但當(dāng)發(fā)生持續(xù)或過(guò)強(qiáng)的ERS時(shí)則會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。且ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑主要為CHOP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑[18]。正常情況下，CHOP表達(dá)量極低，在ERS時(shí)，CHOP明顯升高，過(guò)度表達(dá)的CHOP則可促進(jìn)細(xì)胞周期停滯或凋亡。ERS時(shí)，蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（PERK）被激活，真核翻譯起始因子2的α亞基（elF2α）發(fā)生磷酸化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子ATF4和XBP1發(fā)生表達(dá)，并結(jié)合ERS反應(yīng)元件（ERSE）序列，誘導(dǎo)CHOP的表達(dá)[18]。而CHOP通過(guò)下調(diào)Bcl-2表達(dá)，耗竭谷胱甘肽，促進(jìn)反應(yīng)性氧族（ROS）的產(chǎn)生，活化caspase-3，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。由于ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)對(duì)Bcl-2家族的調(diào)控而實(shí)現(xiàn)的[20]，故可將ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡視為內(nèi)源性或線粒體途徑引起細(xì)胞凋亡的補(bǔ)充。

姜黃素為一種中藥單體，具有諸多功效如抗氧化應(yīng)激、抑制炎性反應(yīng)性細(xì)胞因子釋放以及抗細(xì)胞凋亡等[1-3]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，姜黃素在多種動(dòng)物模型上對(duì)各種局部器官組織的缺血/再灌注損傷，包括腎臟、肝臟、肺及腦的I/R損傷均表現(xiàn)出一定的保護(hù)作用，且可減輕大鼠RIRI[2-3]。但姜黃素減輕RIRI的作用機(jī)制目前缺乏足夠證據(jù)。有研究表明，調(diào)控凋亡相關(guān)基因p53蛋白的表達(dá)可能是姜黃素的作用機(jī)制之一[5]。但姜黃素通過(guò)何種通路來(lái)抑制細(xì)胞凋亡仍未明確。因此，本研究從ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡入手，以探討姜黃素對(duì)RIRI的深層機(jī)制。本研究結(jié)果表明，I/R組大鼠視網(wǎng)膜組織可見細(xì)胞水腫現(xiàn)象，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層細(xì)胞可見細(xì)胞空泡化現(xiàn)象，視網(wǎng)膜內(nèi)炎性反應(yīng)細(xì)胞增多，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂。這提示，缺血/再灌注可引起大鼠視網(wǎng)膜發(fā)生損傷。而CUR組大鼠視網(wǎng)膜水腫現(xiàn)象明顯減輕，內(nèi)核層結(jié)構(gòu)比較完整，視網(wǎng)膜內(nèi)炎性反應(yīng)細(xì)胞較少，視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)相對(duì)比較完整。這提示，姜黃素可減輕大鼠RIRI，對(duì)缺血/再灌注大鼠的視網(wǎng)膜有一定的保護(hù)作用。同時(shí)，本研究結(jié)果表明，IR組大鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)升高，促凋亡蛋白Bax及CHOP表達(dá)亦升高，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降。而CUR組大鼠視網(wǎng)膜組織凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)下降，促凋亡蛋白Bax及CHOP表達(dá)亦下降，而抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)升高。提示，姜黃素可能通過(guò)減弱RIRI后視網(wǎng)膜細(xì)胞內(nèi)的促凋亡蛋白Bax、caspase-3和CHOP的表達(dá)，提高抑凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)而減輕機(jī)體組織內(nèi)細(xì)胞凋亡，從而對(duì)大鼠缺血/再灌注損傷時(shí)視網(wǎng)膜起到一定的保護(hù)作用。

本實(shí)驗(yàn)采用大鼠RIRI模型，并給予姜黃素進(jìn)行干預(yù)，初步證實(shí)了姜黃素可通過(guò)抑制ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而減輕大鼠RIRI。這為探討姜黃素減輕RIRI的作用機(jī)制提供了又一有力的證據(jù)。本研究采用的大鼠RIRI模型易于復(fù)制，可靠性較高，這為本實(shí)驗(yàn)結(jié)果的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性提供了有力的保障。然而，關(guān)于姜黃素減輕RIRI的作用機(jī)制可能有多方面，而本實(shí)驗(yàn)僅從ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡這一方面入手，未能從更多方面去探討姜黃素的可能機(jī)制。今后本實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步工作便是從其他方面去探討姜黃素減輕RIRI的作用機(jī)制。

綜上所述，姜黃素可減輕大鼠RIRI，其機(jī)制可能與抑制ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]Fan Z，Yao J，Li Y，et al.Anti-inflammatory and antioxidant effects of curcumin on acute lung injury in a rodent model of intestinal ischemia reperfusion by inhibiting the pathway of NF-Kb[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（4）：3451-3459.

[2]Zhang HJ，Xing YQ，Jin W，et al.Effects of curcumin on interleukin-23 and interleukin-17 expression in rat retina after retinal ischemia-reperfusion injury[J].Int J Clin Exp Pathol，2015，8（8）：9223-9231.

[3]Wang S，Ye Q，Tu J，et al.Curcumin protects against hypertension aggravated retinal ischemia/reperfusion in a rat strokemodel[J].Clin Exp Hypertens，2017，39（8）：711-717.

[4]Chen YJ，Huang YS，Chen JT，et al.Protective effects of glucosamine on oxidative-stress and ischemia/reperfusion-induced retinal injury[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2015，56（3）：1506-1516.

[5]王賽斌，姬斌，黃曉燕，等.姜黃素對(duì)自發(fā)性高血壓大鼠缺血再灌注后視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡及p53表達(dá)的影響[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，36（7）：798-802.

[6]Hu T，You Q，Chen D，et al.Inhibiting Matrix Metalloproteinase 3 Ameliorates Neuronal Loss in the Ganglion Cell Layer of Rats in Retinal Ischemia/Reperfusion[J].Neurochem Res，2016，41（5）：1107-1118.

[7]Xu YP，Han F，Tan J.Edaravone protects the retina against ischemia/reperfusioninduced oxidative injury through the PI3K/Akt/Nrf2 pathway[J].Mol Med Rep，2017，16（6）：9210-9216.

[8]Seong H，Ryu J，Yoo WS，et al.Resveratrol Ameliorates Retinal Ischemia/Reperfusion Injury in C57BL/6J Mice viaDownregulation of Caspase-3[J].Curr Eye Res，2017，42（12）：1650-1658.

[9]Bomsztyk K，Mar D，An D，et al.Experimental acute lung injury induces multi-organ epigenetic modifications in key angiogenic genes implicated in sepsis-associated endothelial dysfunction[J].Crit Care，2015，19（1）：225.

[10]Yin J，Tu C，Zhao J，et al.Exogenous hydrogen sulfide protects against global cerebral ischemia/reperfusion injury via its anti-oxidative，anti-inflammatory and anti-apoptotic effects in rats[J].Brain Res，2013，1491：188-196.

[11]Cheng P，Wang F，Chen K，et al.Hydrogen sulfide ameliorates ischemia/reperfusion-induced hepatitis by inhibiting apoptosis and autophagy pathways[J].Mediators Inflamm，2014，2014：935251.

[12]Kawamura T，Wakabayashi N，Shigemura N，et al.Hydrogen gas reduces hyperoxic lung injury via the Nrf2 pathway in vivo[J].Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2013，304（10）：L646-L656.

[13]Meng G，Wang J，Xiao Y，et al.GYY4137 protects against myocardial ischemia and reperfusion injury by attenuating oxidative stress and apoptosis in rats[J].J Biomed Res，2015，29（3）：203-213.

[14]Pe[3]a-Blanco A，García-Sáez AJ.Bax，Bak and beyond-mitochondrial performance in apoptosis[J].FEBS J，2018，285（3）：416-431.

[15]Karch J，Molkentin JD.Regulated necrotic cell death：the passive aggressive side of Bax and Bak[J].Circ Res，2015，116（11）：1800-1809.

[16]Migita H，Yoshitake S，Tange Y，et al.Hyperbaric Oxygen Therapy Suppresses Apoptosis and Promotes Renal Tubular Regeneration After Renal Ischemia/Reperfusion Injury in Rats[J].Nephrourol Mon，2016，8（1）：e34421.

[17]Nashine S，Liu Y，Kim BJ，et al.Role of C/EBP homologous protein in retinal ganglion cell death after ischemia/reperfusion injury[J].Invest Ophthalmol Vis Sci，2014，56（1）：221-231.

[18]Rozpedek W，Pytel D，Mucha B，et al.The Role of the PERK/eIF2α/ATF4/CHOP Signaling Pathway in Tumor Progression During Endoplasmic Reticulum Stress[J].Curr Mol Med，2016，16（6）：533-544.

[19]Dilshara MG，RGPT J，IMN M，et al.Silibinin sensitizes TRAIL-mediated apoptosis by upregulating DR5 through ROS-induced endoplasmic reticulum stress-Ca2+-CaMKII-Sp1 pathway[J].Oncotarget，2018，9（12）：10324-10342.

[20]Carpio MA，Michaud M，Zhou W，et al.BCL-2 family member BOK promotes apoptosis in response to endoplasmic reticulum stress[J].Proc Natl Acad Sci USA，2015，112（23）：7201-7206.