高效液相色譜切換波長法同時(shí)測定辛夷鼻炎丸中4種成分的含量

黃莉莉 羅軼 吳桂凡 謝培德 張濤

中圖分類號(hào) R927.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2018）05-0625-04

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2018.05.12

摘 要 目的：建立同時(shí)測定辛夷鼻炎丸中升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨含量的方法。方法：采用高效液相色譜切換波長法對A、B、C 3家企業(yè)共52批次辛夷鼻炎丸樣品進(jìn)行含量測定。色譜柱為Kromasil C18，流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，流速為1.0 mL/min，檢測波長為220 nm（升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷）和250 nm（甘草酸銨），柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為6.138～122.77 ?g/mL（r=0.999 9）、2.502～50.03 ?g/mL（r=0.999 9）、5.988～119.75 ?g/mL（r=0.999 9）、12.788～255.76 ?g/mL（r=0.999 9）；精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性試驗(yàn)的RSD均<2.0%（n=6）；加樣回收率分別為100.32%（RSD=0.58%，n=6）、100.24%（RSD=0.56%，n=6）、101.28%（RSD=0.91%，n=6）、101.48%（RSD=0.79%，n=6）。A企業(yè)的4種成分含量測定總值普遍高于B、C企業(yè)，其中甘草苷的差異尤為顯著；B企業(yè)的升麻素苷含量高于A、C企業(yè)，而5-O-甲基維斯阿米醇苷卻低于A、C企業(yè)；B企業(yè)甘草苷的含量均是離群值。結(jié)論：該方法操作簡便、重復(fù)性好，可為辛夷鼻炎丸的質(zhì)量控制提供參考。

關(guān)鍵詞 辛夷鼻炎丸；升麻素苷；甘草苷；5-O-甲基維斯阿米醇苷；甘草酸銨；高效液相色譜法；切換波長法

ABSTRACT OBJECTIVE： To establish the method for simultaneous determination of pim-O-glucosylcimifugin， liquiritin， 5-O- methylvisammioside and amonium glycyrrhizinate in Xinyi byan pills. METHODS： HPLC-switching wavelength method was used for content determination of 52 batches of Xinyi byan pills sample from enterprises A， B， C. The determination was performed on Kromasil C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.1% phosphoric acid at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelengths were set at 220 nm （pim-O-glucosylcimifugin， liquiritin， 5-O-methylvisammioside） and 250 nm （amonium glycyrrhizinate）. The column temperature was 30 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： The linear ranges of prim-O-glucosylcimifugin， liquiritin， 5-O-methylvisammioside and amonium glycyrrhizinate were 6.138-122.77 ?g/mL （r=0.999 9）， 2.502-50.03 ?g/mL （r=0.999 9）， 5.988-119.75 ?g/mL （r=0.999 9） and 12.788-255.76 ?g/mL （r=0.999 9）， respectively. RSDs of precision， stability and reproducibility tests were all lower than 2.0% （n=6）. The recovery rate were 100.32% （RSD=0.58%，n=6）， 100.24% （RSD=0.56%，n=6）， 101.28% （RSD=0.91%，n=6） and 101.48% （RSD=0.79%，n=6）， respectively. Total contents of 4 components in enterprise A were generally higher than enterprises B， C， among which the difference of liquiritin was significant； the content of prim-O-glucosylcimifugin in enterprise B was higher than enterprises A， C， while the content of 5-O-methylvisammioside was lower than enterprises A， C. The content of liquiritin in enterprise B was outlier. CONCLUSIONS： This method is simple， reproducible and can provide reference for quality control of Xinyi biyan pills.

KEYWORDS Xinyi biyan pills； Pim-O-glucosylcimifugin； Liquiritin； 5-O-methylvisammioside； Amonium glycyrrhizinate； HPLC； Switching wavelength method

辛夷鼻炎丸由辛夷、薄荷、紫蘇葉、甘草、廣藿香、蒼耳子、鵝不食草、板藍(lán)根、山白芷、防風(fēng)、魚腥草、菊花、三叉苦等13味藥材組成，2015年版《中國藥典》（一部）[1]中對該制劑功能與主治描述為祛風(fēng)宣竅、清熱解毒。用于風(fēng)熱上攻、熱毒蘊(yùn)肺所致的鼻塞、鼻流清涕或濁涕、發(fā)熱、頭痛，慢性鼻炎、過敏性鼻炎、神經(jīng)性頭痛見上述證候者。其中，防風(fēng)具有祛風(fēng)解表、勝濕止痛之功效，對于流感引起的頭痛有效，在方中配合君藥達(dá)到祛風(fēng)的療效；甘草具有祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥[2]之功效。升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷為該方中防風(fēng)的有效成分，甘草酸及甘草苷為該方中甘草的活性成分。而近年來經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)區(qū)的甘草質(zhì)量參差不齊，甘草酸和甘草苷的含量高低差異較大[3]。由于我國對甘草需求量大，更有不法分子銷售國外低價(jià)甘草的情況，主要表現(xiàn)在所含甘草苷含量不合格[4]。原標(biāo)準(zhǔn)及文獻(xiàn)報(bào)道僅有防風(fēng)中升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷[5-6]的含量測定，尚未見對甘草質(zhì)量進(jìn)行控制的報(bào)道。筆者在本文中建立了采用高效液相色譜切換波長法[7]同時(shí)測定辛夷鼻炎丸中升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨的含量的方法。

1 材料

1.1 儀器

2960高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器及Empower色譜工作站（美國Waters公司）；Milli-Q純水儀（德國Merck Millipore公司）；ABS-6G雙量程十萬分之一電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

1.2 藥品與試劑

辛夷鼻炎丸（企業(yè)A，規(guī)格：0.75 g/10丸，38批次，編號(hào)A1～A38；企業(yè)B，規(guī)格：3 g/袋，10批次，編號(hào)B1～B10；企業(yè)C，規(guī)格：0.75 g/10丸，4批次，編號(hào)C1～C4）；升麻素苷對照品（批號(hào)：111522-201511，純度：94.8%）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對照品（批號(hào)：111523-201509，純度：95.8%）、甘草苷對照品（批號(hào)：111610-201106，純度：93.7%）、甘草酸銨對照品（批號(hào)：110731-201418，純度：93.1%）均由中國食品藥品檢定研究院提供；乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250 mm×4.5 mm，5 μm）； 流動(dòng)相：乙腈為A相，0.1%磷酸為B相，梯度洗脫（0～25 min，5%～15%A；25～36 min，15%～21%A； 36～80 min，21%～50%A）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：220 nm，60 min時(shí)變換波長為250 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 ?L。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱量升麻素苷12.95 mg、甘草苷10.68 mg、5-O-甲基維斯阿米醇苷12.50 mg、甘草酸銨14.02 mg，分別置于5、10、5、5 mL的棕色量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，得到各對照品的貯備液。分別精密吸取甘草酸銨貯備液2.0 mL及其他3種對照品貯備液1.0 mL，置于同一10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，制成每1 mL含升麻素苷245.53 μg、甘草苷100.07 μg、5-O-甲基維斯阿米醇苷239.50 μg、甘草酸銨511.52 μg的混合對照品溶液（甘草酸質(zhì)量=甘草酸銨質(zhì)量/1.021）。

2.2.2 供試品溶液 取A3樣品，研細(xì)，取1 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率：320 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0.45 ?m濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液 自制缺防風(fēng)陰性樣品及缺甘草陰性樣品，研細(xì)，取1 g，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，分別作為缺防風(fēng)和缺甘草陰性樣品溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性樣品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。

由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度>1.5 ；理論板數(shù)以5-O-甲基維斯阿米醇苷峰計(jì)為12 000。結(jié)果表明，其他成分對主成分測定無干擾。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液0.125、0.2、0.5、1.0、2.0、2.5 mL，分別置于5 mL量瓶中，加入50%甲醇稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取10 μL注入液相色譜儀，以待測成分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，μg/mL）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性關(guān)系考察結(jié)果見表1。

2.5 檢測限與定量限考察

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對照品溶液0.25、0.5、1 mL，分別置于10 mL量瓶中，加50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，進(jìn)樣分析。當(dāng)信噪比為3 ∶ 1時(shí)，得檢測限；當(dāng)信噪比為10 ∶ 1時(shí)，得定量限。結(jié)果，升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸銨的檢測限分別為0.200、0.200、0.150、0.125 μg/mL，定量限分別為0.500、0.505、0.350、0.271 μg/mL。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取供試品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.08%、1.17%、0.57%、1.00%（n=6）。表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取A3樣品約1.0 g，共6份，精密稱定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液并測定及計(jì)算含量。結(jié)果，升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨的平均含量依次為0.61、0.14、0.81、0.61 mg/g，RSD分別為1.01%、1.07%、1.27%、1.27%（n=6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液（A3） ，于室溫放置0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果，升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨峰面積的RSD分別為1.37%、1.21%、0.95%、1.15%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的供試品粉末（A3）6份，每份約0. 5 g，精密稱定，準(zhǔn)確加入適量對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果，升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨的平均加樣回收率分別為100.32%（RSD=0.58%，n=6）、100.24%（RSD=0.56%，n=6）、101.28%（RSD=0.91%，n=6）、101.48%（RSD=0.79%，n=6）。

2.10 含量測定

取52批次辛夷鼻炎丸樣品適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積并計(jì)算樣品含量，結(jié)果見表2。

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇

甘草酸銨對照品為銨鹽，當(dāng)流動(dòng)相為酸性時(shí)，甘草酸銨在色譜中脫離銨離子即變?yōu)楦什菟?，故選擇磷酸水溶液、醋酸水溶液以及甲酸水溶液等進(jìn)行考察。本文采用220 nm切換250 nm作為檢測波長，而磷酸在這兩個(gè)波長下均無吸收，故選擇其作為水相；在有機(jī)相方面，雖然甲醇價(jià)格便宜且毒性比乙腈小，但考慮到乙腈洗脫能力強(qiáng)，且在低波長處無吸收，幾乎不與樣品發(fā)生反應(yīng)。為了提高靈敏度，最終采用流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸[8]系統(tǒng)，且經(jīng)試驗(yàn)，以該系統(tǒng)梯度洗脫，分離效果好，峰形對稱。

3.2 檢測波長的選擇

采用二極管陣列檢測器對辛夷鼻炎丸中所有成分進(jìn)行檢測，在220 nm波長處升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草苷均有較好吸收，而甘草酸[9]在220 nm波長處幾乎沒有吸收，在250 nm波長處有最大吸收，且甘草酸出峰時(shí)間較晚，故在60 min變換波長為250 nm[10]，以達(dá)到同時(shí)測定4個(gè)成分的目的。變換波長法[11]已經(jīng)成為同時(shí)測定不同類別成分的主流方法，應(yīng)用廣泛，值得推廣。

3.3 含量測定結(jié)果分析

A、B、C 3家企業(yè)的樣品含量數(shù)據(jù)經(jīng)分析比較后發(fā)現(xiàn)，A企業(yè)的4種成分含量普遍高于B企業(yè)及C企業(yè)，其中甘草苷含量的差異尤為顯著。A企業(yè)為該方的原研企業(yè)，數(shù)據(jù)可靠度高。另外，B企業(yè)的升麻素苷含量均高于A企業(yè)及C企業(yè)，而同為防風(fēng)中另一成分5-O-甲基維斯阿米醇苷含量卻低于A企業(yè)及C企業(yè)，該數(shù)值的差異有待進(jìn)一步深入研究。通過Grubbs法則計(jì)算，去除離群值，得到4種成分的平均值，發(fā)現(xiàn)企業(yè)B的10個(gè)被測定批次中甘草苷的含量均是離群值，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于原研企業(yè)A中甘草苷的含量，提示B企業(yè)甘草投料有待進(jìn)一步調(diào)查及研究。本方法的建立可為控制辛夷鼻炎丸中甘草及防風(fēng)的投料質(zhì)量[12]提供參考作用。

中成藥多為多種藥材配伍并根據(jù)相應(yīng)工藝生產(chǎn)而制成的制劑，單一指標(biāo)成分的控制已經(jīng)不能完全滿足中成藥的質(zhì)量控制要求。而不同產(chǎn)區(qū)的藥材質(zhì)量差異較大，例如甘草[13]，因此有必要對成方制劑進(jìn)行多成分的質(zhì)量控制。目前報(bào)道的測定辛夷鼻炎丸中升麻素苷及5-O-甲基維斯阿米醇苷的方法較多，但未曾見同時(shí)測定辛夷鼻炎丸中升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨含量的報(bào)道。筆者所建立的高效液相色譜切換波長法可同時(shí)測定辛夷鼻炎丸中升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷、甘草酸銨的含量，該方法操作簡便、重復(fù)性好，可為辛夷鼻炎丸的質(zhì)量控制提供參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：985-987.

[ 2 ] 趙祎鐳，師清芝，唐星.甘草中甘草酸和甘草苷的提取純化工藝研究[J].中國藥房，2009，20（6）：426-429.

[ 3 ] 黃明進(jìn)，王文全，魏勝利.我國甘草藥用植物資源調(diào)查及質(zhì)量評(píng)價(jià)研究[J].中國中藥雜志，2010，35（8）：947-952.

[ 4 ] 車曉彥，鄧曉鴻，余曉琴，等. HPLC測定辛夷鼻炎丸中升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的總含量[J].中成藥，2010，32（11）：1917-1919.

[ 5 ] 劉雙利，姜程曦，趙巖，等.防風(fēng)化學(xué)成分及其藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2017，48（10）：2146-2152.

[ 6 ] 馬麗杰，楊濱，馮學(xué)鋒，等.野生與栽培防風(fēng)中升麻苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷的含量測定及指紋圖譜分析[J].中國中藥雜志，2010，35（13）：1731-1734.

[ 7 ] 周萃，楊燕云，張振秋，等.波長切換HPLC法同時(shí)測定甘草及其炮制品中7個(gè)物質(zhì)的含量[J].藥物分析雜志，2011，36（11）：2067-2069.

[ 8 ] 謝培山.中藥色譜指紋圖譜[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2005：13-17.

[ 9 ] 杜蓉，張孟佑. HPLC法測定加味逍遙丸中芍藥苷與甘草苷的含量[J].中國藥房，2015，26（18）：2571-2572.

[10] 成英，宋九華. HPLC測定逍遙丸中甘草苷、異甘草素和甘草酸的含量[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29（2）：163- 166.

[11] 楊金鏵，殷敏敏，張健，等. HPLC波長切換法測定青陽參中7 個(gè)C21甾體皂苷的含量[J].中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，45（2）：200-204.

[12] 羅軼，唐秀玲，黃莉莉，等.辛夷鼻炎丸質(zhì)量分析概述[J].大眾科技，2016，18（4）：81-84.

[13] MONTERO L，IB??EZ E，RUSSO M，et al. Metabolite profiling of licorice （glycyrrhiza glabra） from different locations using comprehensive two-dimensional liquid chromatography coupled to diode array and tandem mass spectrometry detection[J]. Analytica Chimica Acta，2016.DOI：10.1016/j.aca.2016.01.040.

（收稿日期：2017-06-14 修回日期：2018-01-03）

（編輯：余慶華）