白細胞介素-1基因多樣性與2型糖尿病伴重度牙周炎的關系研究

王鑫

(錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院，遼寧 錦州 121000)

近些年，我國糖尿病患者數量逐年增加，作為糖尿病第六大并發(fā)癥的牙周炎患者數量亦隨著增加。糖尿病和牙周炎互為促進的關系也被越來越多的學者證實。一般來說，糖尿病患者的牙周狀況一般不會太好，同樣的，牙周病患者的糖尿病患病率也比正常人高很多[1]。本實驗運用PCR和酶切的方法對142名實驗對象進行分組，2型糖尿病伴重度慢性牙周炎組、單純糖尿病組、單純重度慢性牙周炎組以及健康對照組外周血中IL-1β+3953等位基因進行檢測，探究白細胞介素-1的基因多樣性與2型糖尿病伴重度牙周炎的關系。

1　材料與方法

1.1　研究對象

研究對象全部來自錦州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院牙周科及內科診室病人，共142人，包括男性83人，女性59人，年齡在32～74歲之間。對所有相關病人全口牙周狀況進行檢查，所有研究對象全部是居住在錦州及周邊地區(qū)10年以上的漢族人群，且全部知曉本次試驗的有關事宜并在知情同意書上簽字。

1.1.1健康對照組人群牙周狀況全部良好，平均年齡(49.72士5.36)歲，男17例，女13例，未發(fā)現全身系統性疾病。

1.1.2單純糖尿病患者符合以下條件遵照1999年WHO診斷標準：空腹血糖不低于7.0 mmol/L和(或)糖耐量實驗2 h后血糖不低于11.1 mmol/L，因各種原因引起胰島素絕對或相對不足所致的糖尿病，且沒有其他系統性伴發(fā)疾病。

1.1.3重度慢性牙周炎診斷標準牙齦炎癥和探診出血，牙周袋深度大于6 mm，附著喪失超過5 mm，X線片顯示牙齒鄰面硬骨板消失，牙槽骨吸收超過根長的1/2，全口牙平均牙周臨床附著喪失水平不低于2.5 mm，至少3個區(qū)有1個或多個鄰面位點牙周臨床附著喪失水平不低于2.5 mm。

1.1.42型糖尿病伴重度慢性牙周炎患者標準身體狀況尚可，沒有嚴重糖尿病并發(fā)癥發(fā)生；口內現存牙齒數目不低于15個；至少有6個位點附著喪失超過4 mm，探診深度(PD)超過4 mm；X線顯示多個位點牙槽骨吸收超過根長的1/3；近6個月未在牙周科室進行過任何治療；近期血糖控制良好，無明顯波動；無影響糖尿病及牙周炎的不良嗜好，如吸煙、酗酒等。

1.2　樣本采集

所有研究對象均空腹下抽取前臂靜脈血5 mL，EDTA抗凝，統一編號后于-70 ℃凍存以備檢測。

1.3　IL-1β+3953等位基因的檢測

1.3.1外周血基因組DNA的提取取l mL含有肝素的全血，按外周血DNA提取試劑盒說明書進行操作，取2 μL DNA樣品，加入雙蒸水600 μL，紫外分光光度儀測定OD260、OD280，計算OD260/OD280比值，比值介于1.7～2.0之間表示DNA純度良好。

1.3.2IL-1β+3953特異性引物設計及PCR擴增IL-1β+3953循環(huán)條件： 94 ℃預變性5 min，94 ℃變性1 min,56 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,循環(huán)35次，72 ℃再延伸5 min(見表1)。

上游：5′-CTCAGGTGTCCTCGAAGAAATCAAA-3′

下游：5′-GCTTTTTTGCTGTGAGTCCCG-3′

擴增片段為194 bp。

表1　IL-1β+3953的反應體系

1.3.3PCR擴增產物電泳檢測擴增產物中加入Loadingbuffer后用加入溴化乙錠(1.0 mg/mL)染色的1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電壓100 V，時間30 min，經自動凝膠成像分析儀拍照。

1.3.4酶切反應條件:65 ℃水浴過夜后終止酶切反應(見表2)。

表2　IL-1β+3953酶切體系

1.3.5酶切后產物檢測取酶切產物4 μL，加2 μL載樣緩沖液點樣，1%瓊脂糖電泳檢測結果。

1.4　PCR質量控制措施

所有DNA標本均在盲法下測定其基因型，操作者不知道該標本的任何臨床資料或分組情況，在反應體系中以無菌去離子水代替模板DNA作為陰性對照，隨機抽取10%的樣本仍在盲法下重復檢測其基因型，以檢測PCR結果的可靠性。

1.5　統計學方法

采用SPSS17.0 for windows統計軟件進行數據分析，計數資料以百分比表示，組間比較采用秩和檢驗。

2　結　　果

2.1　IL-1β+3953PCR擴增產物凝膠電泳

所有IL-1β+3953PCR擴增產物在1.5%瓊脂糖凝膠電泳圖上均顯示單一條帶，目的基因擴增片段長度約200 bp，說明目的基因擴增產物沒有較大的插入或缺失(見圖1)。

M道：分子量標記Marker；5道：空白道

圖1IL-1β+3953擴增產物電泳圖

2.2　IL-1β+3953PCR擴增產物酶切后凝膠電泳

IL-1β+3953等位基因I純合子因存在TaqⅠ酶切位點而出現108 bp和86 bp兩個片段，等位基因Ⅱ純合子因酶切位點消失不能被切開仍顯示194 bp片段，等位基因雜合子將出現194、108、86 bp3個片段(見圖2)。

M道：分子量標記Marker；2、6、7道：等位基因Ⅰ/Ⅰ純合子；1道：等位基因Ⅱ/Ⅱ純合子；3、4、5道：等位基因Ⅰ/Ⅱ純合子

圖2IL-1β+3953擴增產物酶切后電泳圖

2.3　各組IL-1β+3953基因型分布及等位基因頻率情況

通過對IL-1β+3953等位基因的檢測，慢性重度牙周炎患者攜帶IL-1β+3953等位基因Ⅱ的例數為6例，頻率為29.81%，2型糖尿病伴重度慢性牙周炎攜帶等位基因Ⅱ的例數為7例，頻率為36.84%，都明顯高于健康對照組10.34%的攜帶頻率，患病組檢出率明顯增加。通過對基因型及等位基因的統計分析，發(fā)現4組之間基因型頻率分布存在統計學意義(χ2=13.489，P=0.036)，等位基因頻率分布亦存在統計學意義(χ2=14.252，P=0.003)，見表3。

表3　各組IL-1β+3953基因型分布及等位基因頻率

3　討　　論

牙周炎作為糖尿病的并發(fā)癥之一，它形成的因素有很多，主要是由于以牙齦卟啉單胞菌(Pg)為主菌斑微生物刺激造成的牙周支持組織進行性破壞，而機體的免疫防御也因為致病微生物引起失衡，釋放TNF-α、IL等炎性介質加速牙周炎的發(fā)生[2-3]。牙周炎患者最常見的表現之一則是牙齦炎癥和出血，而糖尿病患者血液則因為含糖量高更容易成為菌斑微生物的底物，促進其成熟和發(fā)展，從而影響機體免疫應答，最終使牙周炎癥愈加嚴重。隨著流行病學的深入研究，人們逐漸重視牙周炎與糖尿病的雙向促進關系。糖尿病是牙周炎發(fā)生發(fā)展的一個重要促進因素，而牙周炎的發(fā)展程度也反映和影響著糖尿病嚴重情況和其并發(fā)癥的發(fā)生。近些年隨著科技的不斷進步，糖尿病伴牙周炎的相關性研究也逐漸向著基因表達的方向拓展，并且現在已有動物實驗表明[4-5]，2型糖尿病小鼠對牙周致病菌的免疫反應增強，小鼠齦溝液中IL-1β水平也有明顯增加，這也間接證明了本項研究的結論。

與牙周炎相關的基因研究一直是牙周領域的最前沿，其中對IL-1基因多態(tài)性又是牙周炎敏感基因研究中最多的。白細胞介素-1家族是一類炎前細胞因子，其在牙周炎癥的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，尤其在對牙槽骨等牙周支持組織的破壞中，是調節(jié)炎癥反應的關鍵因子[6]。而IL-1β可以說是白細胞介素-1家族對牙周炎的發(fā)生、發(fā)展起到重要作用的炎性因子，誘導牙破骨細胞形成，進而促進巨噬細胞分泌其他炎癥因子如前列腺素-E2、腫瘤壞死因子-α等，進而加速牙槽骨吸收和膠原降解，加重牙周炎的發(fā)展。李向利等通過研究證實[7]，在相同條件下，糖尿病合并慢性牙周炎患者外周血中IL-1β的含量明顯高于單純慢性牙周炎患者，而單純慢性牙周炎患者外周血中IL-1β的含量又明顯高于健康對照組，并且經統計學分析，兩者具有顯著性差異。有相關文獻[8]報道，在牙周炎患者的牙周組織中各種炎性因子基因表達水平大幅增加，而IL-1β的基因表達加強更是促進著牙周組織的進一步破壞。因此，本實驗通過對合并重度牙周炎和2型糖尿病的病人進行基因表達的研究和統計學分析,通過測定被檢測人員血清IL-1β水平，探討IL-1β在2型糖尿病合并重度慢性牙周炎的內在關系。本研究經過檢測和統計學分析顯示，在2型糖尿病伴重度牙周病病人中IL-1β+3953等位基因Ⅱ型攜帶頻率的人群顯著高于正常人水平。

因此，合理分析IL-1β+3953等位基因與2型糖尿病伴重度牙周病的關系，可以更加完善牙周炎患者的發(fā)生發(fā)展機制和相關促進因素，使牙周病的診斷、治療更加準確、清晰，以至于在臨床上對牙周病的深入了解,也能更好的為病人解除痛苦。