功能化磁性熒光復(fù)合納米粒子的制備及其作為雙功能造影劑的應(yīng)用

褚建祎，陳瑩

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，遼寧 錦州 121000；2.31697部隊(duì)，遼寧 大連 116000)

在臨床診斷過(guò)程中，對(duì)早期病變患者的病理信息診出率不足，獲取的信息單一，可能導(dǎo)致治療策略的遺漏或失誤；另在治療過(guò)程中，復(fù)雜手術(shù)環(huán)境下對(duì)病灶和正常組織難以實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)區(qū)分定位，以及無(wú)法及時(shí)獲取形變狀態(tài)，都導(dǎo)致了治療方法與范圍的誤差，降低手術(shù)成功率與預(yù)后效果。這種種的臨床需求都迫切地要求臨床的診斷方式要從過(guò)去的相互獨(dú)立、單一化向一體化、多樣化趨勢(shì)發(fā)展[1]。磁共振成像技術(shù)(Magnetic Resonance Imaging，MRI)作為臨床醫(yī)學(xué)影像診斷方面最常用手段具有三維高質(zhì)量軟組織成像，高空間分辨率和無(wú)放射性損傷等優(yōu)點(diǎn)，但是其靈敏度較差，很難發(fā)現(xiàn)較小的病灶[2-3]。而熒光成像(FluoresenceImaging/FI)具有極高的靈敏度，可以在手術(shù)和治療過(guò)程中提供實(shí)時(shí)清晰的成像，但是其空間分辨率較差，穿透性不足。因此將MRI與FI兩種成像模式結(jié)合，便可提供充足和完整的醫(yī)學(xué)信息，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。

二氧化硅由于其出色的理化性質(zhì)，如良好的水溶性、高的透光性、化學(xué)惰性、以及表面容易修飾基團(tuán)可用于連接多種生物分子等，引起了人們廣泛地關(guān)注。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，近幾年，硅包覆QDs和Fe3O4的復(fù)合粒子(Fe3O4-QDs/SiO2)的合成及應(yīng)用已成為了多功能磁性熒光復(fù)合納米粒子的研究熱點(diǎn)之一[4]。本文擬利用反相微乳法制備超小Fe3O4-QDs/SiO2復(fù)合納米粒子，由于Fe3O4-QDs/SiO2復(fù)合納米粒子兼具出色的熒光和磁性信號(hào)，并能夠有效地防止量子點(diǎn)等納米粒子的泄露等優(yōu)點(diǎn)，因此其作為造影劑可同時(shí)用于高空間的MRI和高靈敏的FI的雙模態(tài)成像。

1　材料與方法

1.1儀器與試藥硼氫化鈉、碲粉(99.99%)、氯化鎘、巰基丁二酸(MSA)、六水合三氯化鐵、四水合二氯化鐵、四甲基氫氧化銨(TMAH)、曲拉通X-100、正己醇、聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽、四甲基硅烷絡(luò)合物等均購(gòu)買(mǎi)于Sigma-Aldrich公司，纖維素透析袋(截留分子量：5000)及尼龍超濾膜(孔徑：0.2 μm)購(gòu)買(mǎi)于Spectrum Labs公司。Fe3O4-QDs/SiO2納米粒子的形貌和尺寸通過(guò)FEI Tecnai G2型透射電子顯微鏡進(jìn)行觀察。將制備好的納米粒子的懸浮液超聲分散后，取一滴滴于銅網(wǎng)上，自然干燥。Hitachi U4100 UV Spectrometer紫外光譜儀和F-2700熒光分光光度計(jì)用于記錄Fe3O4-QDs/SiO2納米粒子的紫外光譜和熒光光譜。振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)用來(lái)機(jī)率Fe3O4-QDs/SiO2納米粒子的磁化強(qiáng)度，同時(shí)Magnetom Verio 3.0 TMRI 掃描儀(Siemens，德國(guó))對(duì)Fe3O4-QDs/SiO2納米粒子進(jìn)行體外MRI成像研究。

1.2方法

1.2.1水相CdTe量子點(diǎn)的合成采用水熱法合成水相CdTe量子點(diǎn)。稱(chēng)取80 mg 的硼氫化鈉，將其放于一個(gè)通氮除氧后的密閉小燒瓶中，然后向其中加入1 mL的去離子水，再加入127.5 mg的碲粉。在小燒瓶上方留一可以排氣的小孔，以便排除反應(yīng)所產(chǎn)生的氫氣。在常溫下電磁攪拌反應(yīng)4 h，產(chǎn)生白色的NaHTe中間體。按照摩爾比Cd2+/MSA/NaHTe=1∶2.4∶0.5的比例，將NaHTe溶液加入到通氮去氧后、混有巰基丁二酸(MSA)的CdCl2溶液中。然后將混合溶液加入到反應(yīng)釜中，在160 ℃下反應(yīng)45 min，制備出最大發(fā)射波長(zhǎng)為635 nm，摩爾濃度為2 mM，巰基丁二酸修飾的CdTe量子點(diǎn)。

單分散的超順磁性四氧化三鐵納米粒子由化學(xué)共沉淀法制備，首先將六水合三氯化鐵(FeCl3·6H2O)，四水合二氯化鐵(FeCl2·4H2O)按照摩爾比Fe3+∶Fe2+=2∶1加入到已通N230 min的盛有100 mL水的三頸瓶中。保持通N2 并劇烈攪拌，此時(shí)緩慢加入12 mL氨水(25%)。30 min后，停止反應(yīng)，用磁鐵將黑色的Fe3O4生成物從水溶液中分離，用蒸餾水反復(fù)洗滌3次。然后加入適量的四甲基氨TMA對(duì)四氧化三鐵進(jìn)行修飾，超聲1 min，搖勻，分散在10 mL去離子水中備用。最終所制備的Fe3O4納米粒子濃度約為10 mM。

1.2.2制備Fe3O4-CdTeQDs/SiO2復(fù)合納米粒子Fe3O4-CdTeQDs/SiO2復(fù)合納米粒子是在室溫下由反相微乳法制得。在合成過(guò)程中，環(huán)己烷作為連續(xù)相，曲拉通X-100作為表面活性劑和正己醇作為助表面活性劑。當(dāng)水相的CdTe和Fe3O4納米粒子加入后，攪拌形成微乳液(W/O)體系，在堿性條件下，正硅酸乙酯TEOS在油水界面進(jìn)行水解，從而將水相的CdTe和Fe3O4納米粒子包覆在二氧化硅殼中。在本實(shí)驗(yàn)中，將7.5 mL環(huán)己烷，1.77 mL曲拉通X-100，1.8 mL正己醇，100 μL合成的Fe3O4納米粒子溶液，400 μL CdTe量子點(diǎn)水溶液，60μL聚二烯丙基二甲基胺鹽酸鹽PDDA 水溶液(0.075% v/v)和100 μL的TEOS混合，攪拌30 min，形成均勻的微乳液體系。然后將60 μL濃度為28%的NH4OH加入到微乳液體系中，在堿性條件下，TEOS開(kāi)始水解反應(yīng)。室溫下，避光反應(yīng)24 h后，20 mL丙酮溶液加入到錐形瓶中進(jìn)行破乳，即所得Fe3O4-CdTeQDs/SiO2復(fù)合納米粒子。最后，分別用異丙醇，乙醇，水清洗復(fù)合納米粒子。

1.2.3功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子穩(wěn)定性測(cè)試將制備的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子溶于pH=7.4的PBS溶液中，將其置于室溫下進(jìn)行放置，利用動(dòng)態(tài)光散射儀分別對(duì)1、3、5、7、14、21 d時(shí)對(duì)溶液中納米粒子的水合離子半徑進(jìn)行測(cè)量，反映功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的聚集狀態(tài)，從而檢驗(yàn)納米粒子的穩(wěn)定性。

1.2.4MRI成像配置不同濃度的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子，按照鐵離子濃度分別為0.02、0.05、0.1 mM，同時(shí)用水做對(duì)照劑。利用Magnetom Verio 3.0 T MRI 掃描儀對(duì)樣品進(jìn)行MRI的T2加權(quán)成像。

2　結(jié)　　果

2.1功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的形貌與性質(zhì)分析

功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的形貌與粒徑可通過(guò)TEM 進(jìn)行觀察，如圖1所示。功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的形態(tài)規(guī)則，粒徑均勻分布，二氧化硅成功地包覆了Fe3O4和CdTeQDs納米粒子具有明顯的核殼結(jié)構(gòu)，呈球形，大小約為50 nm 左右。有較強(qiáng)的尺寸優(yōu)勢(shì)和高的表面積。另外，通過(guò)氨基化硅烷絡(luò)合劑，使其表面成功連接活性的氨基基團(tuán)，使其保持活性可以與多種生物分子進(jìn)行相連，且具有極好的水溶性。

另通過(guò)激光粒度儀對(duì)其穩(wěn)定性的研究表明(見(jiàn)圖2)，F(xiàn)e3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的水合半徑，在室溫及普通光照下，能夠穩(wěn)定存在超過(guò)2 w。在測(cè)定期間內(nèi)，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的水合半徑?jīng)]有明顯變化，表明表面氨基修飾能夠有效的防止納米粒子因表面積造成的團(tuán)聚，顯示了較好的穩(wěn)定性。

圖1　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的電子透射電鏡TEM成像圖2　室溫下不同時(shí)間內(nèi)功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子水合離子半徑檢測(cè)

2.2功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的熒光和超順磁性性質(zhì)分析

功能Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的熒光發(fā)射光譜如圖3所示，從圖中可以看出，F(xiàn)e3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子發(fā)射波長(zhǎng)在653 nm，且顯示了杰出的熒光性質(zhì)，較大的Stock’s位移和窄而對(duì)稱(chēng)的發(fā)射光譜，這使其作為一種FI造影劑在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域上可提供事實(shí)的高靈敏的熒光成像，具有廣泛而深遠(yuǎn)的應(yīng)用前景。另通過(guò)磁滯回線(見(jiàn)圖4)可以看出Fe3O4-CdTeQDs/SiO2具有較好的超順磁性和可忽略的剩磁與矯頑力。其飽和磁強(qiáng)比達(dá)到了20.1 emu/g，顯示了較好的超順磁性，這為其作為T(mén)2加權(quán)MRI造影劑奠定了理論基礎(chǔ)。

圖3　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的熒光光譜圖4　功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的磁滯回線

2.3功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的體外T2加權(quán)MRI成像

磁共振顯影劑是磁共振成像的基礎(chǔ)，造影劑的使用，可有效地改變病變組織中質(zhì)子的自旋-自旋弛豫時(shí)間，從而有效地增強(qiáng)對(duì)比度。不同濃度的功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子的體外T2加權(quán)MRI成像如圖5所示。T2加權(quán)MRI成像的使信號(hào)值的逐漸減弱顯暗色，其中作為對(duì)照劑，水的信號(hào)強(qiáng)度很高，對(duì)應(yīng)的T2加權(quán)MRI 成像呈亮色，這與水分子的反磁性性質(zhì)相對(duì)應(yīng)。而作為造影劑，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子溶液的 MRI 圖像顯暗色，對(duì)應(yīng)的造影強(qiáng)度與其濃度表現(xiàn)出明顯的依靠關(guān)系，隨著濃度逐漸增大，對(duì)比的MRI成像暗度增加，信號(hào)逐漸減弱。這說(shuō)明制備的功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子作為T(mén)2加權(quán)造影劑可以明顯縮短縱向馳豫時(shí)間T2，并隨著功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子濃度的增加縮短顯著。

圖5功能化Fe3O4-CdTe QDs/SiO2納米粒子的體外T2加權(quán)MRI成像

3　討　　論

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，基于磁性Fe3O4納米粒子和熒光探針的磁性熒光復(fù)合納米粒子收到了廣泛地關(guān)注。作為一種新型的多功能雙模式造影劑(Contrast agents)，其不僅具有磁性納米粒子的磁靶向、傳遞、細(xì)胞分離、MRI等特性，同時(shí)將熒光示蹤特性融入其中，可以用作熒光基礎(chǔ)的生物標(biāo)記和熒光成像。將FI與MRI相結(jié)合，可提供更加立體和清晰的醫(yī)學(xué)成像，更深一步為重大疾病早期診斷和手術(shù)提供依據(jù)和幫助。有報(bào)道稱(chēng)，在不遠(yuǎn)的未來(lái)，結(jié)合了磁性和光學(xué)特性的復(fù)合納米粒子將使生物醫(yī)學(xué)研究取得重大突破[5]。到目前為止，F(xiàn)e3O4與多種有機(jī)熒光染料聯(lián)合共同用于MR/FI 雙模式成像已經(jīng)有過(guò)報(bào)道[6-7]，但由于有機(jī)染料易光漂白和不穩(wěn)定，導(dǎo)致這些雙成像造影劑的應(yīng)用受到很大限制。熒光量子點(diǎn)(Quantum dots/QDs)作為新一代的熒光探針，由于其獨(dú)特的光學(xué)尺寸依賴(lài)特性、寬的激發(fā)波長(zhǎng)、窄的發(fā)射光譜、出色的光穩(wěn)定性和抗光漂白性，已經(jīng)在在分子標(biāo)記、免疫分析、生物成像、離子檢測(cè)等方面得到了廣泛的應(yīng)用[8]。對(duì)于磁性熒光復(fù)合納米體系的制備和應(yīng)用，ShiDL研究組曾用聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)包覆磁性聚苯乙烯微球和QDs制備了多功能的納米體系[9]；Zhang HX 研究組制備了殼聚糖包覆QDs和Fe3O4的納米凝膠，在其表面修飾了葉酸分子后，對(duì)其在人肺癌細(xì)胞A549內(nèi)的毒性、細(xì)胞成像、靶向給藥及在小鼠內(nèi)的磁靶向聚集等性能進(jìn)行了考察[10]。Sun JQ教授等人用聚烯丙胺鹽酸鹽與葡聚糖的聚微凝膠包覆磁性Fe3O4納米粒子，并通過(guò)化學(xué)鍵連接CdTe QDs量子點(diǎn)，制備了復(fù)合的磁性熒光納米體系[11]。在上述方法中，均直接使用聚合物材料對(duì)Fe3O4及QDs進(jìn)行包覆，這導(dǎo)致了當(dāng)復(fù)合納米粒子用于細(xì)胞或活體成像時(shí)，隨著造影劑在體內(nèi)的聚集和循環(huán)，QDs及Fe3O4納米粒子很容易從復(fù)合納米粒子中泄露出來(lái)，從而對(duì)周邊細(xì)胞及組織產(chǎn)生毒性(如量子點(diǎn)泄露會(huì)產(chǎn)生游離的重金屬離子，造成的重金屬中毒)，故上述已報(bào)到的磁性熒光復(fù)合納米粒子在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用受到很大的限制。

為了解決上述問(wèn)題，本文通過(guò)反相微乳法一步制備了功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子，通過(guò)系統(tǒng)地研究表明，功能化Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子具有杰出的分散性，核殼結(jié)構(gòu)，穩(wěn)定性和較強(qiáng)的熒光和超順磁性，由于表面的二氧化硅的包覆可以有效地避免QDs及Fe3O4納米粒子泄露給生物體環(huán)境所帶來(lái)的影響。通過(guò)體外的T2加權(quán)MRI成像，證明了我們所制備的Fe3O4-CdTeQDs/SiO2納米粒子可以作為一種出色的造影劑用于未來(lái)的MRI/FI成像研究。