內(nèi)源性硫化氫抗氧化作用對乙酸潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠黏膜損傷的影響

梁慧潔， 陳尼維， 趙祥運， 朱梅影， 伏桂香， 閆厚煜

(1. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院消化內(nèi)科，上?！?10000; 2. 廈門市第一醫(yī)院，福建 廈門　361011)

近年來，潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)的發(fā)病率呈現(xiàn)出逐年上升的趨勢。有關(guān)活性氧，包括超氧陰離子、過氧化氫、次氯酸、羥自由基和氮等，與炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)的相關(guān)性多有報導(dǎo)。有研究[1]提示硫化氫(H2S)與胰腺炎、膿毒血癥、關(guān)節(jié)炎、慢性阻塞性肺病等炎性疾病密切相關(guān)。宋敏敏等[2]發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S能夠有效抑制實驗性大鼠胰腺纖維化。H2S的抗炎機制可能與抗氧化、舒展血管、促中性粒細(xì)胞凋亡、降低NF-κB活性、減少白細(xì)胞-內(nèi)皮細(xì)胞黏附有關(guān)。研究[3]發(fā)現(xiàn)，腸壁受損后胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)及3-巰基丙酮酸硫轉(zhuǎn)移酶(3-MST)表達顯著增高，且在潰瘍部位更加明顯。本研究以乙酸誘導(dǎo)小鼠UC，探討H2S是否能通過其抗炎抗氧化作用對UC進行保護并探討可能的機制。

1　材料與方法

1.1　實驗動物及主要試劑

健康雄性昆明小鼠40只，7～8周齡，體質(zhì)量20～30g，購自上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院實驗室。小鼠飼養(yǎng)環(huán)境為SPF級： 通風(fēng)良好，20℃恒溫，60%～70%濕度，12h： 12h光照周期。自然光照下分籠飼養(yǎng)，實驗動物飼以標(biāo)準(zhǔn)普通飼料和水，自由取食和飲水。

乙酸、硫氫化鈉(NaHS)、DL-炔丙基甘氨酸(PAG)、乙酸鋅、對苯二胺鹽酸鹽、三氯化鐵、三氯乙酸購自Sigma公司；丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)生化試劑盒購自南京建成生物工程研究所；ELISA試劑盒購自Cloud-Clone Corp公司；CSE抗體購自Santa Cruz公司。

1.2　小鼠UC模型的建立

昆明小鼠40只，隨機分為4組： 對照組、模型組乙酸+NaHS(H2S供體)組、乙酸+PAG(CSE酶的抑制劑)組。采用乙酸UC造模方法對對照組以外的3組進行造模。昆明小鼠禁食12h后，配制8%乙酸，小鼠麻醉，用硅膠管鈍頭插入小鼠肛門約4cm，抽取8%乙酸0.15mL順硅膠管注入小鼠肛門，速度不宜過快，完成后倒提鼠尾20s，注入1～2mL生理鹽水沖洗，稀釋腸內(nèi)乙酸，常規(guī)飼養(yǎng)，對照組同樣處理，不加乙酸。灌腸1d后,H2S組每天腹腔注射供體NaHS 50μmol/kg，PAG組每天腹腔注射CSE酶抑制劑PAG 10mg/kg，其余兩組每天腹腔注射等體積生理鹽水溶液。藥物干預(yù)后3d處死小鼠。

1.3　結(jié)腸炎癥程度及造模情況的評估

自實驗開始即每天記錄小鼠活動及進食情況以及有無腹瀉、便血、體質(zhì)量減輕,每日留取小鼠糞便進行隱血測定，測量小鼠造模前及造模后的體質(zhì)量，按Okayasu等[4]標(biāo)準(zhǔn)進行DAI評分。處死小鼠后觀察腸黏膜外觀,參照Luk等[5]標(biāo)準(zhǔn)進行結(jié)腸組織大體評分，無損傷為0分；黏膜充血但沒有潰瘍?yōu)?分；充血而且腸病變厚但沒有潰瘍?yōu)?分；有一處潰瘍但沒有腸壁增厚為3分；有兩處或兩處以上潰瘍/炎癥為4分；有兩處或兩處以上大潰瘍或有一處潰瘍/炎癥沿結(jié)腸縱軸超過1cm為5分；沿結(jié)腸縱軸損傷超過2cm，每超過1cm加1分，為6～10分。取近肛門端結(jié)腸組織及有潰瘍部位結(jié)腸組織進行固定、H-E染色,參照Ekstrom等[6]標(biāo)準(zhǔn)進行結(jié)腸組織病理評分，見表1。

表1　結(jié)腸組織病理評分表

1.4　血清H2S的測定

小鼠處死前，麻醉后心臟穿刺采血0.5～1.0mL，注入肝素抗凝真空采血管中,靜置2h后低溫離心(離心半徑16cm，3000r/min，離心10min)，分離血漿。在試管中加入0.5mL 10g/L濃度的醋酸鋅，再加入0.2mL血漿標(biāo)本，震蕩均勻，再依次加入20mmol/L對氨基二甲基苯胺鹽酸鹽0.5mL、30mmol/L三氯化鐵0.4mL、室溫孵育20min，加入10%三氯乙酸1mL，加入蒸餾水補足體積至5mL。離心半徑16cm，6000r/min，離心5min，吸出上清液，在波長670nm處用分光光度計檢測吸光度(A670)。根據(jù)H2S標(biāo)準(zhǔn)曲線計算上清液中H2S的含量。

1.5　ELISA法測定HO-1、NQO-1

處死小鼠后，取病變組織制備勻漿，離心半徑16cm，3000r/min，離心20min,收集上清液,參照ELISA試劑盒說明書進行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算HO-1、NQO-1含量。

1.6　生化法測定MDA、SOD、GSH

取病變組織制備勻漿，離心半徑16cm，3000r/min，離心20min,收集上清液,參照MDA、SOD、GSH試劑盒說明書進行操作。用分光光度法測量出MDA、SOD、GSH含量。

1.7　Western印跡法

取病變組織制備勻漿，以裂解液裂解，使用胞漿蛋白提取試劑盒提取胞漿蛋白,BCA法測蛋白濃度。每孔上樣100μg蛋白,12% SDS-PAGE凝膠電泳分離,將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉2h,孵育一抗(CSE抗體),4℃過夜,次日室溫孵育HRP標(biāo)記的二抗(1： 10000稀釋)1h。化學(xué)發(fā)光法顯示結(jié)果,壓片曝光,顯影定影,采用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照,使用Image J軟件進行灰度分析。

1.8　統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　　果

2.1　小鼠的一般情況和DAI評分

對照組小鼠活動、進食情況如常，無腹瀉、體質(zhì)量減輕、便血等情況。模型組乙酸灌腸后出現(xiàn)腹瀉、體質(zhì)量減輕、便血等情況。灌腸后3d，上述癥狀達高峰。PAG組上述癥狀相較于模型組及NaHS組重，而NaHS組較模型組減輕。模型組、NaHS組、PAG組DAI評分均高于對照組(P<0.05)，PAG組高于模型組、NaHS組(P<0.05)，NaHS組較模型組較低(P<0.05)，見表2。

2.2　大體和病理損傷評分

肉眼觀察，對照組小鼠結(jié)腸大體標(biāo)本無水腫、糜爛和潰瘍的形成，模型組、NaHS組及PAG組均可見黏膜充血水腫糜爛及潰瘍形成，但NaHS組病變程度輕于模型組，PAG組較模型組、NaHS組重，見表2。組織病理切片顯示，除對照組外，其他3組病變結(jié)腸黏膜均出現(xiàn)不同程度的水腫、出血、潰瘍、隱窩消失、偽膜形成,各層均有淋巴細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞浸潤,病變呈連續(xù)性，病理損傷評分均高于對照組(P<0.05)，PAG組高于模型組及NaHS組(P<0.05)，NAHS組則低于模型組(P<0.05)，見表2、圖1。

表2　疾病活動度及炎癥程度評分Tab.2　Disease activity index and inflammation score

與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與NaHS組相比，cP<0.05

圖1　各組小鼠結(jié)腸組織H-E染色Fig.1　Colonic tissue H-E staining in mice of each group

2.3　血清H2S含量比較

模型組、NaHS組血漿H2S含量高于正常對照組(P<0.05),PAG組低于NaHS組和模型組，NAHS組高于模型組及對照組(P<0.05)，見表3。

2.4　結(jié)腸組織HO-1、NQO-1含量

模型組、PAG組、NAHS組結(jié)腸組織HO-1含量低于正常對照組(P<0.05)，NaHS組高于模型組(P<0.05)，PAG組低于模型組及NaHS組(P<0.05)。模型組、PAG組、NAHS組結(jié)腸組織NQO-1含量低于正常對照組(P<0.05),NaHS組高于模型組(P<0.05)，PAG組低于NAHS組(P<0.05),見表3。

2.5　結(jié)腸組織MDA、SOD、GSH含量

模型組結(jié)腸組織MDA含量高于對照組(P<0.05)，而NaHS組低于模型組(P<0.05)，PAG組高于對照組及NaHS組(P<0.05)。模型組、PAG組(P<0.05)、NAHS組結(jié)腸組織SOD活力、GSH含量相對表達量明顯低于正常對照組(P<0.05),NAHS組高于模型組(P<0.05)，PAG組低于模型組及NAHS組(P<0.05)，見表4。

表3　各組血清H2S含量,結(jié)腸組織HO-1、NQO-1含量Tab.3　The levels of H2S in serum and the levels of HO-1、NQO-1 in colonic tissue of each groups

與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與NaHS組相比，cP<0.05

表4　各組結(jié)腸組織MDA、GSH含量、SOD活力Tab.4　The levels of MDA、GSH and the activity of SODin colonic tissue of each groups

與對照組相比，aP<0.05；與模型組相比，bP<0.05；與NaHS組相比，cP<0.05

2.6　Western印跡法結(jié)果

模型組CSE量較其他3組升高(P<0.05)，PAG組CSE量較NaHS及模型組降低(P<0.05)，NAHS組CSE量較模型組降低(P<0.05)，見圖2。對照組、模型組、NAHS組和PAG組CSE/GAPDH量分別為0.60±0.04、0.86±0.18、0.44±0.25、0.28±0.10。

圖2　各組結(jié)腸CSE蛋白表達水平Fig.2　The levels of CSE protein expression in the colon homogenates

3　討　　論

近年來，研究[7]表明氧自由基和抗氧化酶失衡所導(dǎo)致的氧化應(yīng)激與UC密切相關(guān)。研究[8]顯示，自發(fā)性UC實驗犬血清ROS較健康對照組升高。乙酸UC模型的致病機制、組織病理學(xué)特征及炎性介質(zhì)與人類IBD相似，均存在顯著的氧化物與抗氧化物失衡[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，模型組結(jié)腸MDA含量升高，且HO-1、NQO-1含量及MDA、SOD、GSH活性降低。以往研究[10]發(fā)現(xiàn)乙酸UC小鼠血清抗化酶活性(SOD、GSH)降低，氧化損傷標(biāo)志物MDA含量升高，與本研究結(jié)果相似。綜上所述，UC的黏膜損傷機制可能與過氧化物的增多及抗氧化酶活性的下降呈正相關(guān)。

H2S的抗炎的作用已被逐漸認(rèn)識。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組相比，NaHS組DAI、大體及病理損傷評分均低于模型組，并且PAG組評分均高于模型組，這表明H2S對UC具有保護作用。研究[11]顯示，H2S對UC具有治療作用，并認(rèn)為其機制可能與上調(diào)CSE的表達并提高隨后的H2S釋放有關(guān)，這與本研究一致。研究[12]用H2S干預(yù)UC小鼠，發(fā)現(xiàn)H2S可減輕腸黏膜損傷，并能降低結(jié)腸組織IL-4含量。研究[13]顯示，上調(diào)乙酸UC小鼠結(jié)腸組織中的GSH、SOD等抗氧化酶的表達可降低腸黏膜損傷。本研究發(fā)現(xiàn)，NaHS組HO-1、NQO-1含量及MDA、SOD、GSH活性升高，并且氧化標(biāo)志物MDA含量降低，抑制H2S的產(chǎn)生后則相反，由此推斷H2S的保護作用與對抗氧化酶的激活密切相關(guān)。

本研究通過乙酸誘導(dǎo)小鼠UC模型發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性H2S能有效減輕腸黏膜損傷，其中的機制可能與上調(diào)抗氧化酶的表達有關(guān)。小鼠乙酸UC模型雖能模擬人類UC，但具體機制并不完全一致，因此H2S能否作為一種抗氧化劑進入臨床用于治療UC還需進一步研究。