糖化終末產(chǎn)物對(duì)人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞中ChREBP表達(dá)的影響

陳寒蓓， 林　寧， 蘇　青

(上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院內(nèi)分泌科，上?！?00092)

蛋白質(zhì)、脂類或核酸等大分子物質(zhì)的游離氨基與還原糖的羰基在非酶促條件下，經(jīng)過縮合、重排、裂解、氧化后產(chǎn)生的一組穩(wěn)定終末產(chǎn)物，稱為糖化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)。隨著年齡增加，體內(nèi)的AGEs水平會(huì)緩慢增加。在糖尿病患者體內(nèi)，由于高血糖加速了AGEs的產(chǎn)生，使其大量蓄積[1-2]。AGEs可直接通過交聯(lián)影響蛋白質(zhì)功能[3]，而且還可以與細(xì)胞膜上特定的受體相結(jié)合，繼而影響靶細(xì)胞的功能。AGEs與糖尿病慢性并發(fā)癥、動(dòng)脈粥樣硬化、衰老等發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4]。近年來，研究[5]認(rèn)為，AGEs與腫瘤的形成相關(guān)。Tong等[6]發(fā)現(xiàn)，ChREBP在調(diào)節(jié)結(jié)腸癌細(xì)胞代謝和抑制p53的活性中發(fā)揮了重要的作用，其對(duì)于結(jié)腸癌細(xì)胞的高效率增殖起到了非常關(guān)鍵性的作用。前期工作[7]亦顯示，AGEs可誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激。本研究探討AGEs作用下人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞內(nèi)是否通過氧化應(yīng)激影響碳水化合物反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(carbohydrate responsive element binding protein, ChREBP)表達(dá)的變化，進(jìn)一步研究糖尿病易于罹患腫瘤的發(fā)病機(jī)制。

1　材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)材料

人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞株購(gòu)自美國(guó)ATCC公司；高糖和無糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶和胎牛血清均購(gòu)自德國(guó)Biochrom公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT reagent Kit)、RT-PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM)購(gòu)自日本TaKaRa公司；小鼠源Tubulin單克隆抗體N-乙酰半胱氨酸(NAC)、MTS試劑盒購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔源ChREBP多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Novus公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記山羊抗兔抗體、標(biāo)記山羊抗鼠抗體購(gòu)自中國(guó)碧云天公司。

SMART CELL CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；化學(xué)發(fā)光成像儀(Las 4000 mini)購(gòu)自美國(guó)GE公司；熒光定量PCR儀(AB 7500 fast)購(gòu)自美國(guó)ABI公司；蛋白電泳儀購(gòu)自中國(guó)天能公司；全波長(zhǎng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀購(gòu)自美國(guó)BioTek公司。

1.2　HCT116細(xì)胞培養(yǎng)

人結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116按5×106/孔的密度接種于10cm培養(yǎng)皿中，使用含有2mmol/L谷氨酰胺、10%熱失活的FBS、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的高糖(25mmol/L葡萄糖)DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，隔天傳代1次。

1.3　AGEs的制備和鑒定

0.5g BSA溶解于10mL 0.2mol/L PBS中，加入D-葡萄糖0.9g，0.22m濾膜以抽濾除菌，37℃避光孵育120d。剪取長(zhǎng)度約為15cm的透析袋，該透析袋的截留相對(duì)分子質(zhì)量為8000～14000；稱取8.00g NaHCO3、0.149g EDTA溶解于Milli-Q H2O中，測(cè)定其pH值為8.36；將透析袋置于上述配制溶液中煮沸10min，再將該透析袋置于Milli-Q H2O中煮沸5min，并用Milli-Q H2O充分沖洗透析袋。透析袋一頭用手術(shù)縫線扎緊后，將AGEs置于透析袋中，另一頭同樣扎緊后置于PBS中避光透析，4h后PBS換液1次，繼續(xù)透析過夜，24h后PBS換液，直至AGEs充分透析48h，以除去未結(jié)合的葡萄糖。以相同的方法去除D-葡萄糖以制備非糖化BSA作為對(duì)照。

AGEs的鑒定： 運(yùn)用熒光光譜掃描鑒定，熒光光譜掃描顯示BSA-AGEs的激發(fā)高峰位于360nm，發(fā)射高峰位于446nm。

1.4　提取細(xì)胞總mRNA和RT-PCR

HCT116細(xì)胞按1×106/孔接種于六孔板中，培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。換葡萄糖濃度為0mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組每孔加入200mg/L AGEs，對(duì)照組每孔加入200mg/L BSA，置37℃、含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞24h。

采用TRIzol試劑，提取細(xì)胞總mRNA，測(cè)定A260和A280檢測(cè)RNA的質(zhì)量和濃度。按反轉(zhuǎn)錄的試劑盒要求反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。根據(jù)Gene Bank中目的基因mRNA序列，用Premier 5.0設(shè)計(jì)針對(duì)人ChREBP-α、ChREBP-β、總ChREBP、ACC、TXNIP、SCD1、Pepck、G6Pase、PPARα和INHBE及管家基因β-Actin cDNA的特異性引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。引物應(yīng)滿足以下要求： 在模板cDNA的保守區(qū)內(nèi)；引物長(zhǎng)度為18～35bp；退火溫度控制在58～60℃；盡可能避免在3′端最后1個(gè)堿基為A；G-C含量控制在40%～60%；引物二聚體連續(xù)配對(duì)不超過3個(gè)，引物序列見表1。

表1　基因引物序列

PCR反應(yīng)體系： 10μL反應(yīng)體系，SYBR green Mix 5μL，10μmol/L上下游引物各0.2μL，cDNA 模板1μL，ROX Ⅱ 0.2μL，滅菌ddH2O 3.4μL。反應(yīng)條件為： 95℃ 30s(預(yù)變性)，95℃ 3s(變性)，64℃ 30s(退火)，60℃ 1min(延升)，變性、退火、延伸共30個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增產(chǎn)物以β-actin作為內(nèi)參比較相對(duì)定量。

1.5　Western印跡法檢測(cè)

HCT116細(xì)胞按1×106/孔接種于六孔板中培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。換葡萄糖濃度為0mmol/L或25mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)組每孔加入200mg/L AGEs，對(duì)照組每孔加入200mg/L BSA，在部分實(shí)驗(yàn)組中，在加入AGEs處理前先用NAC(100μmol/L)預(yù)培養(yǎng)30min。置37℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞24h。

提取處理過的HCT116細(xì)胞中的蛋白質(zhì)，用BCA法進(jìn)行蛋白定量，將定量后的蛋白樣品在100℃變性5min，迅速置于冰上。蛋白上樣后用SDS-PAGE電泳，電泳結(jié)束后馬上進(jìn)行轉(zhuǎn)PVDF膜，根據(jù)膜上的蛋白標(biāo)記條帶來確定轉(zhuǎn)膜是否成功，然后將剪去標(biāo)記條帶的膜用TBST洗滌1次后，放入封閉液中，在25℃搖床中輕搖2h。將上述PVDF膜置于含有適當(dāng)濃度一抗液中，4℃輕搖過夜。將與辣根過氧化物酶耦聯(lián)的二抗按1∶2000比例稀釋，再將上述漂洗過的膜置于其中并室溫平緩搖動(dòng)2h。用TBST液室溫漂洗3次，每次5min。用ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色，Bio-Rad凝膠成像儀檢測(cè)分析結(jié)果。根據(jù)熒光的能見度，選取合適的曝光時(shí)間；保存圖片，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.6　MTS比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將5×104/mL HCT116細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化。換葡萄糖濃度為0mmol/L的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組每孔加入200mg/L AGEs，對(duì)照組每孔加入200mg/L BSA，在部分實(shí)驗(yàn)組中，在加入AGEs處理前先用NAC(100μmol/L)預(yù)培養(yǎng)30min。置37℃、含5% CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育細(xì)胞24h。在96孔板中，每孔100μL培養(yǎng)基加20μl CellTiter 96?AQueous One Solution Reagent。在37℃、5% CO2的環(huán)境下孵育2h后，于490nm讀取吸光度值(A490)。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2　結(jié)　　果

2.1　AGEs刺激對(duì)ChREBP轉(zhuǎn)錄的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，AGEs刺激后，在葡萄糖濃度為0mmol/L的DMEM培養(yǎng)條件下，HCT116細(xì)胞的ChREBP-β和總ChREBP mRNA水平都有增加，分別為2.5(P<0.05)和1.3倍(P>0.05)，見圖1。

圖1　RT-PCR檢測(cè)AGEs刺激對(duì)HCT116細(xì)胞ChREBP mRNA轉(zhuǎn)錄的影響Fig.1　Effects of AGEs on ChREBP mRNA expression in HCT116 cells by RT-PCR與BSA組比較，*P<0.05

2.2　RT-AGEs刺激對(duì)ChREBP下游基因表達(dá)的影響

RT-PCR結(jié)果顯示，AGEs刺激后，在葡萄糖濃度為0mmol/L的DMEM培養(yǎng)條件下，HCT116細(xì)胞的ACC、TXNIP和SCD1的mRNA水平都有增加，分別為1.7、3.8和1.8倍(P<0.05)，而Pepck、G6Pase、PPARα和INHBE的mRNA水平都有降低，分別降至17.3%、23.5%、24.2%、26.0%(均P<0.01)，見圖2。

圖2　RT-PCR檢測(cè)AGEs刺激對(duì)HCT116細(xì)胞ChREBP下游基因轉(zhuǎn)錄的影響Fig.2　Effects of AGEs on target genes transcription of ChREBP in HCT116 cells by RT-PCR與BSA組比較，*P<0.05

2.3　AGEs誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)HCT116細(xì)胞中ChREBP表達(dá)的影響

Western印跡法結(jié)果顯示，在葡萄糖濃度為0mmol/L的DMEM培養(yǎng)條件下，AGEs能促進(jìn)ChREBP蛋白表達(dá)增加，但在AGEs加入前先用NAC孵育的細(xì)胞中，NAC能夠明顯降低AGEs誘導(dǎo)的ChREBP表達(dá)。同樣，葡萄糖濃度為25mmol/L的DMEM培養(yǎng)條件下，ChREBP表達(dá)明顯增加，然而此時(shí)AGEs不能進(jìn)一步促進(jìn)ChREBP表達(dá)增加，但在AGEs加入前先用NAC孵育的細(xì)胞中，NAC仍能夠降低細(xì)胞的ChREBP表達(dá)，見圖3。

圖3　AGEs誘導(dǎo)ROS對(duì)HCT116細(xì)胞ChREBP表達(dá)的影響Fig.3　Effects of ROS on ChREBP expression in AGEs-induced HCT116 cells

2.4　AGEs誘導(dǎo)氧化應(yīng)激對(duì)HCT116細(xì)胞增殖的影響

MTS結(jié)果顯示，在葡萄糖濃度為0mmol/L的DMEM培養(yǎng)條件下，AGEs能促進(jìn)HCT116細(xì)胞增殖，但在AGEs加入前先用NAC孵育的細(xì)胞中，NAC能夠明顯抑制AGEs誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(P<0.05)，見圖4。

圖4　ROS對(duì)AGEs誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞增殖的影響Fig.4　Effects of ROS on AGEs-induced HCT116 cells proliferation與AGEs組比較，*P<0.05；與對(duì)照組比較，**P<0.05

3　討　　論

近年來，隨著人類生活水平的提高以及生活方式的改變，2型糖尿病的患病率逐年攀升，2型糖尿病已成為公共衛(wèi)生問題。2013年，中國(guó)成年人糖尿病患病率為11.6%，而糖尿病前期的患病率為50.1%[8]。早在1960年，流行病學(xué)研究已提示糖尿病和腫瘤發(fā)生之間可能存在一定的相關(guān)性。糖尿病患者容易罹患的腫瘤包括直結(jié)腸癌、肝癌、胰腺癌、乳腺癌和膽囊癌等[9-13]。

1912年，法國(guó)科學(xué)家Maillard首次發(fā)現(xiàn)還原糖的羰基與含氨基的蛋白質(zhì)或脂質(zhì)，通過非酶促糖化作用形成不穩(wěn)定的Schiff堿，并經(jīng)過分子重排形成酮氨類化合物(Amadori products)，再經(jīng)過脫水形成不可逆的AGEs[14]。AGEs與衰老及糖尿病慢性并發(fā)癥(尤其是微血管并發(fā)癥)密切相關(guān)。有研究[15]認(rèn)為，AGEs還與腫瘤的形成相關(guān)。本研究前期工作[16]顯示，無論是用MTS比色法，還是細(xì)胞計(jì)數(shù)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的方法，AGEs刺激組與對(duì)照組相比較，可促進(jìn)HCT116細(xì)胞的增殖。

2001年，Yamashita等[17]發(fā)現(xiàn)了一種與碳水化合物反應(yīng)元件相結(jié)合的蛋白質(zhì)，命名為ChREBP。ChREBP在哺乳動(dòng)物的肝臟、脂肪及小腸等組織中均有較高的表達(dá)[18]。ChREBP作為轉(zhuǎn)錄因子直接激活多個(gè)參與糖酵解和脂肪合成基因的表達(dá)，對(duì)于調(diào)控體內(nèi)糖、脂肪代謝具有十分重要的作用。2012年，Herman等[19]發(fā)現(xiàn)了一種ChREBP的新型異構(gòu)體，稱為ChREBP-β。葡萄糖刺激ChREBP表達(dá)時(shí)首先誘導(dǎo)ChREBP-α的轉(zhuǎn)錄，其反式激活ChREBP-β的轉(zhuǎn)錄，而ChREBP-β是更有效的轉(zhuǎn)錄激活因子。Tong等[6]發(fā)現(xiàn)，ChREBP對(duì)于肝癌及結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖是必須的。抑制ChREBP的表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致脂肪酸的從頭合成，有氧糖酵解和核苷酸的生物合成明顯減少，從而抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，抑制ChREBP可使依賴p53的腫瘤減緩生長(zhǎng)。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，ChREBP在調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞代謝和抑制p53活性中發(fā)揮重要的作用，從而促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的增殖。ChREBP的表達(dá)受糖脂代謝途徑中間代謝產(chǎn)物如葡萄糖和脂肪酸的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，AGEs作為糖代謝的產(chǎn)物之一，經(jīng)其刺激后HCT116細(xì)胞中的ChREBP-β和總ChREBP mRNA水平都有增加，ChREBP-β作為更有效的轉(zhuǎn)錄激活因子，其mRNA水平增加最為明顯。RT-PCR結(jié)果顯示，AGEs刺激后，HCT116細(xì)胞中受ChREBP激活的下游靶基因ACC、TXNIP和SCD1的mRNA水平都有增加，而被ChREBP抑制的下游靶基因Pepck、G6Pase、PPARα和INHBE的mRNA水平都有降低。本研究提示AGEs通過上調(diào)ChREBP從而促進(jìn)了HCT116細(xì)胞的增殖。

在糖尿病患者體內(nèi)，由于高血糖加速了AGEs的產(chǎn)生，AGEs的形成過程中由于葡萄糖和中間產(chǎn)物自氧化產(chǎn)生ROS，進(jìn)一步促進(jìn)AGEs的生成，ROS的產(chǎn)生與AGEs的生成是相互促進(jìn)的[20]。前期工作顯示，AGEs也可以與靶細(xì)胞膜上的受體RAGE相結(jié)合，刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS，AGEs可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、胰島β細(xì)胞、胰腺星狀細(xì)胞和HCT116細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激[7,21-23]。本研究發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖濃度為0mmol/L 的DMEM培養(yǎng)條件下，AGEs刺激后增加HCT116細(xì)胞中ChREBP的表達(dá)，但在AGEs加入前先用NAC孵育的細(xì)胞中，AGEs刺激所致ChREBP表達(dá)增加被明顯抑制，AGEs刺激所致的HCT116細(xì)胞增殖也被明顯抑制。同樣，高糖處理所致ChREBP的表達(dá)增加亦能被NAC所抑制。因此本研究推測(cè)，AGEs和葡萄糖可能都是通過氧化應(yīng)激，增加轉(zhuǎn)錄因子ChREBP表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)，AGEs通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)來上調(diào)ChREBP的表達(dá)，從而增加結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖；提示AGEs-ROS-ChREBP通路可能為糖尿病患者惡性腫瘤發(fā)病率增高的原因之一，同時(shí)也預(yù)示通過強(qiáng)化降糖治療使血糖達(dá)標(biāo)，降低體內(nèi)AGEs的含量，可能對(duì)于預(yù)防糖尿病患者惡性腫瘤的發(fā)生具有重要的意義，并為延緩糖尿病合并腫瘤的發(fā)生及進(jìn)展開辟新的思路與途徑。