煙曲霉對肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞通透性的影響及可能機(jī)制

宋　珺， 韓　菁， 孫　越， 施偉民

(上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院皮膚科，上?！?00080)

侵襲性肺曲霉病(invasive pulmonary aspergillosis, IPA)是煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus, AF)侵入免疫受損宿主所導(dǎo)致的一種高致死率的嚴(yán)重感染性疾病[1-3]。該病的病理表現(xiàn)為急性廣泛出血性壞死性肺炎、膿腫或由上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞組成的肉芽腫，還表現(xiàn)為曲霉菌在肺組織內(nèi)增殖并侵入血管，導(dǎo)致壞死性血管炎、血栓和菌栓性出血，并可經(jīng)血行播散，甚至全身多器官受累，預(yù)后極差[1-3]。

煙曲霉是一種通過空氣傳播的腐生條件致病真菌，廣泛存在于自然界，其孢子直徑很小,可被動吸入呼吸道進(jìn)入人體從而引起肺部感染，引起炎癥因子釋放激發(fā)免疫反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)IPA[4-7]。呼吸道黏膜通常是由氣道上皮細(xì)胞、間質(zhì)成纖維細(xì)胞和肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞(pulmonary microvascular endothelial cells, PMVECs)組成一個功能單位，參與疾病的病理生理過程。PMVECs是肺臟內(nèi)含量最為豐富的細(xì)胞之一，其通過細(xì)胞間的相互作用以及與細(xì)胞外基質(zhì)連接構(gòu)成肺微循環(huán)交換血管的最內(nèi)層，具備代謝活躍和功能復(fù)雜的特點[8-10]。PMVECs參與肺內(nèi)多種生理功能的調(diào)節(jié)，如微血管緊張性的維持、宿主自身防御反應(yīng)以及血管生成等，其功能和結(jié)構(gòu)的完整性對于維持正常肺生理功能至關(guān)重要[8-10]。在肺部炎癥反應(yīng)過程中，PMVECs是病毒、細(xì)菌、真菌、炎癥因子等首先攻擊的效應(yīng)細(xì)胞之一，其維持的結(jié)構(gòu)和功能屏障被破壞以及由此造成的細(xì)胞通透性增加為肺部多種疾病的病理基礎(chǔ)之一[8-10]。

目前，尚未有研究報導(dǎo)煙曲霉對PMVECs通透性的影響。本研究考察了煙曲霉對PMVECs通透性的影響，并對其可能機(jī)制進(jìn)行了探討。

1　材料與方法

1.1　材料

人PMVECs(HPMVECs)購于美國加利福尼亞州圣地亞哥ScienCell研究實驗室；煙曲霉菌株(AF 293)購于中國普通微生物菌種保藏管理中心；吐溫80購自生工生物工程(上海)股份有限公司；胎牛血清、DMEM、胰蛋白酶等細(xì)胞培養(yǎng)試劑購自賽默飛世爾公司；激光共聚焦掃描顯微鏡(Leica TCS SP5)購自Leica公司；跨膜電阻儀購自Millipore公司。

1.2　煙曲霉菌孢子懸液制備

取AF293煙曲霉菌菌株接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3d，0.1%吐溫80的生理鹽水10mL沖洗培養(yǎng)基表面，收集煙曲霉菌孢子懸液，8層無菌紗布(高壓滅菌)過濾，含0.1%吐溫80的PBS液清洗，后轉(zhuǎn)入離心管中，1000r/min，離心10min，棄去上清液，煙曲霉孢子重懸于含0.1%吐溫80的PBS液中，計數(shù)孢子數(shù)量，再將煙曲霉孢子懸液離心(1000r/min)10min，孢子重懸于PBS中，調(diào)整孢子濃度為5×107cfu/mL，備用。

1.3　細(xì)胞培養(yǎng)

HPMVECs的培養(yǎng)參照以前的研究[11]，培養(yǎng)液為專用內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液。HPMVECs達(dá)90%培養(yǎng)皿底壁后，棄舊培養(yǎng)液，適量PBS清洗，加入適度預(yù)熱的胰酶，置于37℃培養(yǎng)箱消化，加入培養(yǎng)液終止消化，移液器輕輕吹打，待細(xì)胞全部吹打下來后，收集HPMVECs懸液，于15mL離心管中離心5min(離心半徑30cm，1000r/min)，培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度后置于孵箱(37℃、5% CO2飽和濕度)中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。于傳代培養(yǎng)第5代(細(xì)胞達(dá)90%底壁)后，HPMVECs被給予煙曲霉菌孢子處理。

1.4　細(xì)胞處理以及激光共聚焦掃描顯微鏡檢測

HPMVECs被胰酶消化后，培養(yǎng)液重懸，取細(xì)胞懸液滴到的細(xì)胞爬片(鋪于培養(yǎng)孔板中)上，30min后，添加培養(yǎng)液，置于孵箱(37℃、5% CO2飽和濕度)中培養(yǎng)6h，然后用煙曲霉菌孢子刺激HPMVECs，PBS清洗，多聚甲醛(4%)于室溫固定1.5h，PBS清洗，與羅丹明-鬼筆環(huán)肽孵育(室溫)30min，取出細(xì)胞爬片，PBS漂洗，用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色，PBS漂洗，后封片劑封片(有細(xì)胞一面對著載玻片)，用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察并拍照。使用Image J測量熒光強(qiáng)度。

1.5　細(xì)胞跨膜電阻測定

細(xì)胞跨膜電阻值(transepithelial electrical resist-ance, TER)反映溶質(zhì)離子電流的強(qiáng)弱，與細(xì)胞通透性呈反比，可用于反映細(xì)胞通透性。將HPMVECs接種于基質(zhì)膠包被的Transwell小室，上、下室分別加入250、750μL培養(yǎng)液，HPMVECs達(dá)單層融合后，設(shè)置空白對照組(Con)、AF處理組(AF,MOI： 1∶8)、TNF-α(20ng/mL)處理組(TNF-α)、AF+SB203580(20μmol/L)處理組(AF+SB203580)、AF+Y27632(20μmol/L)處理組(AF+Y27632)以及AF+LY317615(10μmol/L)處理組(AF+LY317615)，其中TNF-α組為陽性對照組。將跨膜電阻測定儀調(diào)至歐姆檔，2個電極分別于置于Transwell小室表面和下室固定位置，于4、8、16、24h測量各組電阻，并測未接種HPMVECs的小室的電阻，每室重復(fù)3次，計算公式為TER=(測得電阻值-空白電阻值)×Transwell小室的底面積，單位為： Ωcm2。

1.6　統(tǒng)計學(xué)處理

2　結(jié)　　果

2.1　激光共聚焦掃描顯微鏡觀檢測HPMVECs

羅丹明-鬼筆環(huán)肽與胞質(zhì)內(nèi)肌動蛋白(F-actin)結(jié)合而發(fā)紅光，DAPI與細(xì)胞核結(jié)合發(fā)藍(lán)光。激光共聚焦掃描顯微鏡顯示，HPMVECs與煙曲霉共培養(yǎng)至8h，與對照組相比較，煙曲霉組HPMVECs數(shù)量減少，細(xì)胞F-actin明顯減少，應(yīng)力纖維排列紊亂或部分消失，細(xì)胞間的連接縫隙增大或中斷，見圖1。細(xì)胞F-actin反映細(xì)胞骨架的改變，進(jìn)而反映細(xì)胞的通透性，對F-actin染色熒光強(qiáng)度的統(tǒng)計學(xué)分析顯示，AF處理后F-actin染色的熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.01)，表明AF處理后引起HPMVECs的通透性增加，見圖2。

圖1　激光共聚焦掃描顯微鏡檢測HPMVECsFig.1　Detection of human pulmonary microvascular endothelial cells with confocal laser scanning microscopy

圖2　煙曲霉處理對HPMVECs F-actin表達(dá)的影響Fig.2　Effect of Aspergillus fumigatus on F-actin in human pulmonary microvascular endothelial cells與對照組比較,#P<0.01

2.2　細(xì)胞跨膜電阻的檢測

在4h時，空白對照組、AF組、TNF-α陽性對照組、AF+SB203580組、AF+Y27632組以及AF+LY317615組各組間跨膜電阻值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；8h時，與空白對照組比較，AF組和TNF-α組的跨膜電阻值均出現(xiàn)顯著下降(P<0.01)，與AF組比較，AF+SB203580組、AF+Y27632組以及AF+LY317615組的跨膜電阻值均顯著上升(P<0.05)，上述改變一直持續(xù)到24h，見圖3。

圖3　HPMVECs跨膜電阻的檢測Fig.3　Detection of transepithelial electrical resistance in human pulmonary microvascular endothelial cells與對照組比較，#P<0.01,；與煙曲霉組比較，*P<0.05；Con： 對照，SB： SB203580，Y： Y27632，LY： LY317615，AF： 煙曲霉，TER： 內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞跨膜電阻；A、B、C、D分別為試驗后4、8、16、24h

3　討　　論

細(xì)胞骨架在維持細(xì)胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的完整性方面起著重要作用，負(fù)責(zé)執(zhí)行和協(xié)助完成多種細(xì)胞功能。微絲是細(xì)胞骨架的組成成分，微絲主要由F-actin等組成，具可收縮性的特點。當(dāng)細(xì)胞受到異常刺激時，F(xiàn)-actin會發(fā)生重組和再分布，細(xì)胞中央出現(xiàn)大量呈束狀密集排列的應(yīng)力纖維，導(dǎo)致細(xì)胞中心張力增高，加速細(xì)胞收縮，引起凋亡壞死，最終導(dǎo)致細(xì)胞通透性增高。TER是評價緊密連接蛋白完整性的指標(biāo)之一，常用于反映細(xì)胞通透性。一般而言，微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性與細(xì)胞跨膜電阻的變化成反比，即細(xì)胞跨膜電阻升高則細(xì)胞通透性降低，細(xì)胞跨膜電阻降低則細(xì)胞通透性升高。因此，TER的測量可反映微血管內(nèi)皮細(xì)胞的通透性。本研究觀察到，煙曲霉處理后PMVECs F-actin染色的熒光強(qiáng)度顯著下降(P<0.01)，煙曲霉處理組也出現(xiàn)細(xì)胞跨膜電阻值的顯著下降(P<0.01)。以上結(jié)果表明，煙曲霉感染PMVECs導(dǎo)致其通透性升高。

本研究進(jìn)一步探討了煙曲霉致PMVECs通透性升高的機(jī)制。與單獨煙曲霉處理組比較，SB203580(20μmol/L, p38 MAPK抑制劑)干預(yù)組、Y27632(20μmol/L, ROCK抑制劑)干預(yù)組以及LY317615(10μmol/L,蛋白激酶C抑制劑)干預(yù)組的跨膜電阻值均顯著上升(P<0.05)。有絲分裂原激活的蛋白激酶(mitogen activated protein kinases, MAPK)信號通路是真核細(xì)胞內(nèi)最普遍的信號調(diào)節(jié)機(jī)制之一。MAPK信號通路參與調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架的聚合及穩(wěn)定性，并且影響相關(guān)的細(xì)胞活動，如細(xì)胞分裂、細(xì)胞黏附、遷移等。迄今為止，在哺乳動物內(nèi)已發(fā)現(xiàn)多種MAPK家族亞群，如細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)通路、c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)通路，p38 MAPK通路等。有研究[12]表明，p38 MAPK通路激活后引起微絲重排及相關(guān)細(xì)胞形態(tài)的改變，p38 MAPK激酶還可通過影響微絲的完整性及穩(wěn)定性調(diào)節(jié)細(xì)胞的凋亡或再分化等[13]。本研究結(jié)果表明，p38 MAPK信號通路可能參與煙曲霉致PMVECs通透性的改變，也提示p38 MAPK有可能成為煙曲霉感染的潛在治療靶點之一。ROCK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族成員，是小G蛋白家族成員Rho A的下游靶效應(yīng)分子。Rho A/ROCK信號通路是體內(nèi)普遍存在的一條信號通路，此通路可能通過一個復(fù)雜的磷酸化/脫磷酸化級聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)微絲骨架的聚合，控制微血管內(nèi)皮細(xì)胞的諸多生物學(xué)行為，是內(nèi)皮功能調(diào)節(jié)的重要信號分子[14-15]。本研究結(jié)果也表明，ROCK信號通路可能參與煙曲霉致PMVECs通透性的改變，據(jù)此推測，ROCK信號通路可能是煙曲霉感染介導(dǎo)的PMVECs功能損傷的重要調(diào)控靶位之一。本研究還表明，PKC信號通路可能參與煙曲霉致PMVECs通透性的改變。蛋白激酶C(PKC)也屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，是細(xì)胞內(nèi)的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，它的激活是導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂的關(guān)鍵因素之一[16-17]。關(guān)于血管內(nèi)皮屏障功能障礙的研究顯示，肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)磷酸化可引起細(xì)胞骨架重組。肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)和Rho激酶對MLC磷酸化水平的調(diào)節(jié)作用在細(xì)胞骨架重組起重要作用，而PKC也是MLCK的上游激活分子之一。據(jù)此推測，PKC通路通過維持MLC磷酸化水平，從而促發(fā)肌動-肌球蛋白絲收縮，進(jìn)而引起內(nèi)皮細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)和收縮狀態(tài)的改變，最終導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性的改變。因此，PKC通路可能是介導(dǎo)煙曲霉改變HPMVECs通透性的信號途徑之一。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，煙曲霉處理致PMVECs通透性增加，其機(jī)制可能涉及p38 MAPK、ROCK激酶以及蛋白激酶C通路，有必要開展進(jìn)一步的深入研究以揭示更加精確的機(jī)制。