磷脂酶D1對胰腺癌細胞增殖的影響

饒倩雯， 王　菲， 宋美怡， 楊長青

(同濟大學附屬同濟醫(yī)院消化內(nèi)科，上?！?00065)

胰腺癌是一種復雜的、具有遺傳傾向性、致死率很高的疾病。手術是胰腺癌治療的最佳選擇，但診斷明確時，大部分已經(jīng)為晚期，喪失手術機會；因此，胰腺癌的5年生存率不足8%。目前，胰腺癌仍舊缺乏有效的治療措施，迫切需要深入探索其分子發(fā)病機制[1-3]。磷脂酶D(phospholipase D, PLD)能水解磷脂酰膽堿生成磷脂酸和膽堿。磷脂酰膽堿是細胞膜的主要脂類成分。磷脂酸可以影響多種生理功能，包括細胞增殖[4-6]、遷移和侵襲[7-10]等。目前人類已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并克隆出2種PLD同工酶，即PLD1和PLD2。研究發(fā)現(xiàn)，抑制PLD1能抑制肝癌細胞的增殖、細胞周期進展、遷移和侵襲[11]。但是PLD1在胰腺癌中的作用尚不清楚，因此本研究擬探索PLD1在胰腺癌中的作用。

1　材料和方法

1.1　試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基購自Corning公司；胎牛血清購自HyClone公司；0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司；PBS購自凱基生物技術股份有限公司；PLD抑制劑FIPI(3600/10)、PLD1抑制劑VU 0155069(3575/10)、PLD2抑制劑VU0364739(4171/10)購自Tocris公司；PI購自Sigma公司；PLD1過表達質(zhì)粒(#45268)購自Addgene公司；PLD1 siRNA、對照siRNA、EdU染色試劑盒購自廣州銳博公司；CCK-8試劑盒購自同仁化學研究所；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SBYR Green Mix購自TaKaRa公司，PCR引物購自生工生物工程(上海)股份有限公司；無水乙醇購自國藥集團；LipofectamineTM2000購自Invitrogen公司。

1.2　細胞培養(yǎng)

胰腺癌細胞(Capan-2)購自中國科學院細胞庫。Capan-2細胞用含10%胎牛血清和1%的青霉素-鏈霉素的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)箱(Thermo)條件為37℃、5% CO2，細胞經(jīng)檢測無支原體污染。

1.3　細胞加藥處理

將Capan-2細胞按需接種在6孔板或96孔板中。用DMSO配置PLD抑制劑FIPI、PLD1抑制劑VU 0155069、PLD2抑制劑VU0364739儲存液，濃度分別為500、100、100μmol/L，用不含血清的培養(yǎng)液稀釋3種儲液至終濃度分別為500、100、100nmol/L的藥液，對照組加入等濃度的DMSO，繼續(xù)培養(yǎng)24h后進行后續(xù)實驗。

1.4　PLD1過表達質(zhì)粒和PLD1 siRNA轉(zhuǎn)染

使用LipofectamineTM2000向Capan-2細胞轉(zhuǎn)染PLD1過表達質(zhì)?；騊LD1 siRNA。PLD1過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染濃度為1.6μg/mL。PLD1 siRNA轉(zhuǎn)染濃度為100nmol/L。在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6h后換液，轉(zhuǎn)染48h后收細胞。

1.5　細胞增殖活力檢測(CCK-8法)

取Capan-2細胞1.5×105個/mL，接種在96孔板中，細胞處理終點每孔加入10μL CCK-8試劑，輕輕搖勻后放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)2h。之后用酶標儀(Bio-Rad)檢測，讀取波長為450nm處的吸光度值(A450)，計算細胞活力。

1.6　細胞增殖檢測(EdU熒光染色法)

取對數(shù)生長期Capan-2細胞，以1.5×105個/mL的密度將細胞接種在96孔板中，進行相應處理，實驗終點前6h加入5-乙炔基-2-脫氧尿苷(5-ethynyl-2′-deoxyuridine, EdU)孵育，結(jié)束后用4%多聚甲醛固定30min，甘氨酸中和多聚甲醛后用0.5% Triton X-100破膜15min。之后每孔加入配制好的1×Apollo染色反應液，室溫避光孵育30min，PBS清洗后每孔加入1×Hoechst33342反應液30min，PBS清洗后于倒置熒光顯微鏡下觀察并采集圖像。使用軟件Image J統(tǒng)計EdU陽性細胞數(shù)量和DAPI標記的細胞數(shù)量，兩者比值即為增殖率。

1.7　細胞周期的測定(流式細胞儀)

Capan-2細胞以1.5×105個/mL的密度將細胞接種在6孔板中，進行相應處理，實驗終點棄培養(yǎng)基后胰酶消化收集細胞懸液，離心半徑3cm，1200r/min，離心5min，用PBS輕輕吹打重懸細胞，逐滴滴入預冷的無水乙醇，邊滴邊輕輕震蕩，之后置于-20℃冰箱固定過夜。次日取出細胞，加入培養(yǎng)基后，離心半徑3cm，1000r/min，離心5min后取細胞沉淀，PBS清洗后根據(jù)細胞量每管加適量染液(1ml 染液由2μL Triton X-100、20μg PI和200μg RNaseA配制而成)，避光15min后使用流式細胞儀(Beckman)進行周期檢測，每個樣品收集檢測10000個細胞，采用Flow Jo軟件進行統(tǒng)計。

1.8　熒光定量PCR

使用TRIzol法提取細胞中總RNA。之后再用Bio-Rad cDNA合成試劑盒合成cDNA。熒光定量PCR反應體系為SYBR?Green 4.5μL，PCR正向引物(5nmol/L)1μL，PCR反向引物(5nmol/L) 1μL，去核酸酶水2.5μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1μL。反應條件為95℃ 3min預變性，95℃ 15s,60℃ 30s，72℃ 30s，經(jīng)歷40個循環(huán)，使用熒光定量PCR儀進行檢測。運用2-ΔΔCt進行計算相對表達量。內(nèi)參GAPDH正向引物為5′-GGGGCTCTC-CAGAACATCATCC-3′，反向引物為5′-ACGCCTG-CTTCACCACCTCTT-3′；PLD1正向引物為5′-GAGCCACGGGTAAATACCT-CT-3′，反向引物為5′-CCGCGTGTCCAGATTTTCT-ATG-3′。

1.9　統(tǒng)計學處理

2　結(jié)　　果

2.1　抑制PLD1活性對胰腺癌細胞增殖的影響

CCK-8法結(jié)果顯示，PLD抑制劑組和PLD1抑制組Capan-2細胞活力均明顯下降(P值分別為0.004、0.044)，而PLD2抑制劑組細胞活力沒有顯著變化(P=0.945)；并且PLD抑制劑組和PLD1抑制劑組細胞活力沒有顯著性差異(P=0.072)，見圖1。推測抑制PLD活性可以降低胰腺癌細胞活力，該作用主要是通過抑制PLD1，而不是抑制PLD2。

圖1　PLD、PLD1、PLD2抑制劑處理后Capan-2細胞活力Fig.1　The cell viability of Capan-2 cells treated with the PLD, PLD1 and PLD2 inhibitor與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；n=9

EdU熒光染色法結(jié)果顯示，PLD抑制劑組和PLD1抑制劑組的EdU陽性細胞比例均顯著減少(P值分別為0.002、0.017)，即細胞增殖率均顯著降低；并且PLD抑制劑組和PLD1抑制劑組沒有顯著差異(P=0.98)，見圖2。這說明抑制PLD1的活性可以顯著降低胰腺癌細胞的增殖能力。

流式細胞術檢測結(jié)果顯示，PLD抑制劑和PLD1抑制劑處理后處于S期的細胞比例均顯著減少(P值分別為0.0001、0.0009)，但這2組G1期的細胞都明顯增多(P值分別為0.00001、0.0004)，見圖3。這說明PLD抑制劑和PLD1抑制劑可以使Capan-2細胞更多地停滯在G1期，阻止其進入S期，即DNA合成期，從而影響細胞增殖。

圖2　PLD、PLD1抑制劑處理后Capan-2細胞增殖情況Fig.2　The proliferation of Capan-2 cells treated with PLD and PLD1 inhibitor與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

圖3　PLD、PLD1抑制劑處理Capan-2細胞周期變化Fig.3　The change of cell cycle of Capan-2 cells treated with PLD and PLD1 inhibitor與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；n=5

2.2　抑制PLD1表達對胰腺癌細胞增殖的影響

熒光定量PCR證實，轉(zhuǎn)染PLD1 siRNA后，PLD1的mRNA表達量顯著降低(P=0.016)，見圖4；CCK-8法檢測結(jié)果顯示，敲低PLD1后細胞活力降低(P=0.000)，見圖5；EdU熒光染色發(fā)現(xiàn)，PLD1-siRNA組的EdU陽性細胞比例與對照組相比顯著降低(P=0.002)，見圖6；流式細胞術檢測結(jié)果顯示，抑制PLD1組G1期細胞明顯增多(P=0.004)，S期細胞顯著減少(P=0.002)，見圖7。

圖4　轉(zhuǎn)染PLD1 siRNA后PLD1 mRNA相對表達量Fig.4　The relative quantitative expression of PLD1 mRNA in Capan-2 cells transfected with PLD1 siRNA與對照組相比，*P<0.05；n=4

圖5　PLD1 siRNA處理后Capan-2細胞活力Fig.5　The cell viability of Capan-2 cells treated with PLD1 siRNA與對照組相比，**P<0.01；n=7

圖6　PLD1 siRNA處理后Capan-2細胞增殖情況Fig.6　The proliferation of Capan-2 cells treated with PLD1 siRNA與對照組相比，**P<0.01；n=6

圖7　PLD1 siRNA處理后Capan-2細胞周期變化Fig.7　The change of cell cycle of Capan-2 cells treated with PLD1 siRNA與對照組相比，**P<0.01；n=5

2.3　過表達PLD1對胰腺癌細胞增殖的影響

熒光定量PCR證實，轉(zhuǎn)染PLD1過表達質(zhì)粒后，PLD1的表達量顯著上調(diào)(P=0.0014)，見圖8；CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn)，PLD1過表達組細胞活力明顯增強(P=0.004)，見圖9；EdU熒光染色法顯示，過表達PLD1后EdU陽性細胞比例增加(P=0.002)，見圖10；流式細胞術檢測提示，PLD1過表達組G1期細胞明顯減少(P=0.0004)，而S期細胞顯著增多(P=0.035)；PLD1過表達能促進細胞從G1進入S期，進而影響胰腺癌細胞的增殖，見圖11。

圖8　轉(zhuǎn)染PLD1過表達質(zhì)粒后PLD1 mRNA相對表達量Fig.8　The relative quantitative expression of PLD1 mRNA in Capan-2 cells transfected with PLD1 plasmid與對照組相比，**P<0.01；n=6

圖9　轉(zhuǎn)染PLD1過表達質(zhì)粒后Capan-2細胞活力Fig.9　The cell viability of Capan-2 cells after transfected with the PLD1 plasmid與對照組相比，**P<0.01；n=7

圖10　轉(zhuǎn)染PLD1過表達質(zhì)粒后Capan-2細胞增殖情況Fig.10　The proliferation of Capan-2 cells after transfected with the PLD1 plasmid與對照組相比，**P<0.01

圖11　轉(zhuǎn)染PLD1過表達質(zhì)粒后Capan-2細胞周期變化Fig.11　The change of cell cycle of Capan-2 cells after transfected with the PLD1 plasmid與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；n=5

3　討　　論

近年來，胰腺癌發(fā)病率明顯升高。目前，胰腺癌治療的主要措施是手術及術后放、化療，但早期的診斷及手術切除率均較低。據(jù)統(tǒng)計，只有20%的患者適合手術切除治療，且即使病灶切除，患者仍多死于腫瘤的復發(fā)或轉(zhuǎn)移，預后極差。因此，新的治療靶點的揭示已經(jīng)成為當務之急[3,12]。

研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，作為一類磷酸二酯酶，PLD廣泛分布在哺乳動物多種組織中，包括大腦、小腦、心臟、肺、肝、脾、胃、胰腺、腸等。PLD及其代謝產(chǎn)物磷脂酸可以調(diào)控細胞內(nèi)許多生理生化活動，比如PLD激活磷酯酰肌醇二磷酸PIP2、ARF和Rho，GTP酶是肌動蛋白重組和膜運輸?shù)闹匾{(diào)節(jié)因子，并且Rho和ARF亞家族成員在PLD激活中起著關鍵作用。PLD作為ARF的下游效應物，介導高爾基體囊泡的出芽，從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體膜的轉(zhuǎn)導，并從跨高爾基體網(wǎng)絡釋放新生分泌囊泡。同時，PLD也被證明是脂肪細胞、肥大細胞、血小板和胰腺β細胞胞吐途徑的重要組成部分[15]。

PLD在腫瘤等疾病的發(fā)病中也發(fā)揮著重要作用，并且其在腫瘤中的作用及分子機制的研究已非常廣泛，已證實PLD在肝癌[11]，胃癌[16]，腎癌[17-18]，前列腺癌[19]，乳腺癌[20]等腫瘤中發(fā)揮著關鍵的作用。研究[21-24]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)的PLD激活可以導致mTOR及其下游靶基因的活化，包括和細胞生長、遷移和侵襲相關的重要信號分子S6激酶1(S6K1)或真核起始因子4E結(jié)合蛋白-1(4E-BP1)等。研究[25-26]也表明PLD能夠激活Akt達到控制膠質(zhì)母細胞瘤細胞生存信號以及控制EL4淋巴瘤細胞的遷移和侵襲的作用。另外前期研究發(fā)現(xiàn)PLD1對肝癌的調(diào)控作用是通過其下游靶基因AKT/mTOR實現(xiàn)的[11]。有學者指出瑞巴派特誘導的PLD的下調(diào)能夠抑制胃癌細胞的炎癥反應和細胞增殖，雷公藤內(nèi)酯可以通過抑制PLD的表達，達到抑制乳腺癌細胞的增殖。但是PLD在胰腺癌中的作用目前尚未完全闡明。

本研究同時抑制PLD1和PLD2，發(fā)現(xiàn)抑制PLD對于胰腺癌細胞增殖的作用主要是通過其同工酶中的PLD1產(chǎn)生的，而不是PLD2。隨后外源性的增加/抑制PLD1的表達，明確了PLD1參與胰腺癌細胞的增殖，同時敲低PLD1的表達對于胰腺癌細胞的增殖具有抑制作用。說明PLD1可以促進胰腺癌細胞的增殖，而干擾PLD1的表達可以作為胰腺癌的潛在治療策略。但仍然需要進一步在細胞水平進行增殖、遷移和侵襲以及其分子機制的研究，以進一步明確PLD1與胰腺癌的關系；需要在動物體內(nèi)研究PLD1對于胰腺癌的治療價值，深入挖掘其價值，對于改善胰腺癌患者的治療方案及預后具有重要意義。