血清hsa-miR-486-5p在乳腺癌早期診斷中的價(jià)值

安學(xué)鳳， 李姝君， 俞作仁， 韓　晶

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院乳腺外科，上?！?00120; 2. 同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化研究中心，上?！?00120;3. 大連醫(yī)科大學(xué)，大連　116023)

乳腺癌是全球女性癌癥死亡的主要原因之一。2012年，調(diào)查發(fā)現(xiàn)乳腺癌占所有癌癥病例數(shù)的25%，且15%的女性死于乳腺癌[1]。乳腺癌的早期診斷可以使患者獲得更好的手術(shù)和治療的時(shí)機(jī)，并有效延長(zhǎng)患者的生命[2]。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)microRNA(miRNA)與腫瘤的發(fā)展、轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)、復(fù)發(fā)以及對(duì)放化療藥物的抗性具有密切關(guān)系[3-4]，其在乳腺癌患者血液中的差異性表達(dá)還可以成為早期乳腺癌檢測(cè)的生物標(biāo)志物[5]。但目前大多數(shù)相關(guān)研究均局限于正常人群和乳腺癌人群，并沒(méi)有將兩者的中間階段(非典型增生人群)納入研究。本研究對(duì)乳腺正常、非典型增生、原位癌、浸潤(rùn)癌4個(gè)階段患者的組織和血液樣本分別進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序和RT-qPCR實(shí)時(shí)定量檢測(cè)，以得到與乳腺癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的特異性miRNA，并對(duì)其診斷早期乳腺癌的可行性進(jìn)行分析研究，從而得到更能準(zhǔn)確診斷早期乳腺癌的特異性血清miRNA。

1　材料與方法

1.1　一般資料

收集2016年11月至2017年7月，在同濟(jì)大學(xué)附屬東方醫(yī)院治療的4例乳腺組織樣本和96例血液樣本。其中正常組織取自乳腺良性病變周?chē)M織。乳腺組織樣本(1cm×1cm)均經(jīng)過(guò)病理活檢確診，分別是： 乳腺正常組織、乳腺非典型增生組織、乳腺原位癌組織和乳腺浸潤(rùn)性癌組織。組織樣本收取后立即放入EP管置于-80℃冰箱凍存直至送出進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序。

本研究中96例血液樣本，包括從東方醫(yī)院健康體檢中心招募的24例30歲以上女性志愿者的正常對(duì)照血液樣本、10例非典型增生患者血液樣本、22例原位癌患者血液樣本、40例浸潤(rùn)癌患者血液樣本。本研究收集的血液標(biāo)本患者年齡均在30歲以上且乳腺腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分期(TNM)為早期，包括乳腺原位癌、乳腺浸潤(rùn)性癌I、II期。術(shù)前獲得乳腺疾病患者的血液樣本，排除具有以下特征的患者： (1) 收集血清前接受化療和(或)放療;(2) 同時(shí)(或)先前診斷具有其他癌癥者?？刂平】抵驹刚叩臉?biāo)準(zhǔn)包括過(guò)去半年內(nèi)無(wú)任何癌癥或住院史。本研究由我院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

將患者的靜脈血收集到含有EDTA的Vacuette血清凝塊活化劑無(wú)凝膠管中，將其在冰上保存15～30min，隨后在4℃離心(離心半徑16cm，3000r/min，離心5min)沉淀血細(xì)胞，后將上清液分裝在不含RNA的2mL試管中，各500μL，儲(chǔ)存于-80℃直至進(jìn)一步使用。

1.2　RNA的提取與反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)實(shí)驗(yàn)方案，使用TRIzol LS試劑(英杰生命科技有限公司)從200μL血清中提取RNA，溶解于10μL焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的水中，用于反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。通過(guò)NanoDrop 2000(賽默飛世爾科技有限公司)對(duì)RNA濃度進(jìn)行定量檢測(cè)。RNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)如下進(jìn)行： 在8μL DEPC水中溶解500ng RNA，在室溫下用DNase和DNase緩沖液(默金斯生物技術(shù)有限公司)純化15min，進(jìn)而加DNase 反應(yīng)終止劑(默金斯生物技術(shù)有限公司)置于70℃水浴箱中5min，終止前面反應(yīng)。然后添加至終體積為14μL轉(zhuǎn)錄混合物，進(jìn)行下列操作： 37℃水浴箱90min和95℃水浴箱5min。合成的cDNA保存在-80℃冰箱中。

1.3　目標(biāo)miRNA的選擇

根據(jù)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程： 正常(H1)、非典型增生(H10)、原位癌(H17)、浸潤(rùn)癌(H18)，收集了各階段1例患者的乳腺組織。將收集4個(gè)階段組織的EP管放入干冰盒中，送到基因測(cè)序公司進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序。

1.4　實(shí)驗(yàn)內(nèi)參選擇的理論依據(jù)

研究[6-7]證明，miR-16在乳腺癌病變組織及病變周?chē)＝M織中表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，正常對(duì)照組血液樣本及乳腺癌患者血液樣本中均穩(wěn)定表達(dá)且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可以成為相關(guān)研究的內(nèi)參。

1.5　RT-qPCR的實(shí)時(shí)定量檢測(cè)方法

使用SYBR Green熒光染料(默金斯生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行RT-qPCR定量檢測(cè)miRNA，在Quant Studio 6 Flex實(shí)時(shí)定量分析PCR系統(tǒng)上進(jìn)行分析。在含有1μL cDNA，0.5mmol/L引物和1× SYBR Green的終體積為10μL中進(jìn)行反應(yīng)。PCR條件如下： 首先在95℃變性10min，隨后是95℃ 15s和60℃ 60s各40個(gè)循環(huán)，在此期間獲得熒光。熔解曲線從60～95℃獲得。使用以下公式計(jì)算倍數(shù)變化： RQ=2-ΔΔCt，其中ΔΔCt=(CtmiRNA-CtmiR16)疾病組-(CtmiRNA-CtmiR16)對(duì)照組平均值。Ct值>38則認(rèn)為是不可能的擴(kuò)增并棄掉。

1.6　目標(biāo)miRNA在血清分析時(shí)的分組

由于高通量測(cè)序的組織樣本較少且來(lái)自不同個(gè)體，所得結(jié)果具有一定的不準(zhǔn)確性和個(gè)體差異性的偏倚可能，因此應(yīng)用大量血清樣本進(jìn)行目標(biāo)miRNA在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中變化趨勢(shì)的驗(yàn)證，以得到較為準(zhǔn)確的結(jié)果。應(yīng)用公式計(jì)算出目標(biāo)miRNA的RQ值。每種目標(biāo)miRNA的RQ值分為正常組、非典型增生組、原位癌組和浸潤(rùn)癌組，進(jìn)行獨(dú)立樣本Kruskal-Wallist檢驗(yàn)。

對(duì)在組織和血清中變化趨勢(shì)相似的miRNA的RQ值進(jìn)一步分組，正常組和早期乳腺癌組(原位癌，Ⅰ期、Ⅱ期浸潤(rùn)癌)并進(jìn)行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析使用SPSS 20.0軟件，進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)、Mann-WhitneyU檢驗(yàn)和Kruskal-Wallist檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)　　果

2.1　miR-16作為內(nèi)參的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

miR-16在正常對(duì)照組、非典型增生組、原位癌組和浸潤(rùn)癌組中的Ct值的中位數(shù)(范圍)分別是： 23.78(21.98～25.95)、24.1(21.79～26.25)、23.21(21.81～26.14)和23.4(21.58～26.25)，Kruskal-Wallist檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。因此，miR-16可以作為本研究的內(nèi)參。

2.2　目標(biāo)miRNA的選擇確定

將乳腺癌發(fā)生發(fā)展的4個(gè)階段組織送去基因測(cè)序公司進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序，并對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，得到隨疾病進(jìn)展呈明顯遞減表達(dá)的6種miRNAs(hsa-miR-144-5p、hsa-miR-451a、hsa-miR-486-5p、mir-132-x、mir-486-x、mir-6510-y)，見(jiàn)圖2。其中mir-132-x、mir-486-x、mir-6510-y為鼠源性miRNA，因此不納入研究。最終確定研究目標(biāo)為hsa-miR-144-5p(miR-144)、hsa-miR-451a(miR-451a)和hsa-miR-486-5p(miR-486)。

圖1　miR-16在4組中的Ct值Fig.1　The value of miR-16 in healthy control,atypical hyperplasia, carcinoma in situ and invasive breast cancer groups

圖2　miRNA高通量測(cè)序分析結(jié)果熱圖Fig.2　The heat map of miRNA high-throughput sequencing analysisH1為乳腺正常組織，H10為乳腺非典型增生組織，H17為乳腺原位癌組織，H18為乳腺浸潤(rùn)性癌組織

2.3　目標(biāo)miRNA在血清中的表達(dá)

將高通量測(cè)序所得的目標(biāo)miRNA(miR-144、miR-451a和miR-486)進(jìn)行血清RT-qPCR的檢測(cè)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示miR-144和miR-451a差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且表達(dá)趨勢(shì)無(wú)規(guī)律(P>0.05)，僅miR-486差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。miR-486在4個(gè)階段患者血清中的表達(dá)不僅有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，同時(shí)其表達(dá)的趨勢(shì)與高通量測(cè)序結(jié)果相近即隨疾病的進(jìn)展逐漸降低，見(jiàn)圖3。因此，miR-486與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展具有密切相關(guān)性。

圖3　血清miR-486在4組中的表達(dá)Fig.3　Comparison of miR-486 expression levels in four groups

2.4　血清miR-486診斷早期乳腺癌的可行性分析

與正常對(duì)照組相比，早期乳腺癌組血清miR-486的檢測(cè)分析結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)圖4A。繪制ROC曲線檢驗(yàn)所得統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性結(jié)果的準(zhǔn)確性，分析結(jié)果顯示： cut-off值為0.528，AUC值為81.2%，95%CI為0.707～0.917，靈敏度和特異度分別為62.5%和90.3%，見(jiàn)圖4B。以上結(jié)果顯示，血清miR-486可以準(zhǔn)確地診斷早期乳腺癌并具有較高的靈敏度和特異度。

圖4　血清miR-486診斷早期乳腺癌的可行性Fig.4　The feasibility of serum miR-486 in diagnosing early-stage breast cancerA： 血清miR-486在健康組與早期乳腺癌組中的表達(dá); B： 診斷早期乳腺癌的ROC曲線圖

2.5　miR-486在乳腺癌不同亞型中的表達(dá)

臨床上根據(jù)雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)、人表皮生長(zhǎng)因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2, Her2)、人表皮生長(zhǎng)因子受體(epithelial growth factor receptor, EGFR)以及Ki67將乳腺癌分為4個(gè)亞型，見(jiàn)表1。本研究將miR-486的RQ值分為L(zhǎng)uminal A組、Luminal B組、Her2過(guò)表達(dá)組以及基底型組并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以便檢測(cè)miR-486與乳腺癌亞型之間的關(guān)系，結(jié)果顯示各組之間并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)，見(jiàn)圖5。

表1　乳腺癌臨床分子分型

圖5　血清miR-486在乳腺癌4種亞型中的表達(dá)Fig.5　The expression of serum miR-486 in different breast cancer subtypes patients

3　討　　論

乳腺癌目前公認(rèn)的發(fā)病機(jī)制為“多階段發(fā)展模式學(xué)說(shuō)”，即乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程是： 乳腺正常組織、乳腺非典型增生、乳腺原位癌、乳腺浸潤(rùn)性癌[8]，而此發(fā)展過(guò)程的機(jī)制目前尚不明確。雖然乳腺非典型增生是從正常組織到惡性改變的中間階段，是由量變到質(zhì)變的關(guān)鍵點(diǎn)，但從治療上來(lái)說(shuō)，非典型增生只需要局部手術(shù)、術(shù)后隨訪即可；早期乳腺癌和中晚期乳腺癌患者在治療上也存在較大的差異性，前者的手術(shù)范圍更小且可以根據(jù)患者情況選擇性進(jìn)行保乳手術(shù)，并且總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期延長(zhǎng)，患者的生活質(zhì)量更高。因此，乳腺癌早期甚至其癌前病變的診斷具有重要的臨床意義。

miRNA是一種與腫瘤特異性表達(dá)相關(guān)的非編碼小RNA，有19～25個(gè)核苷酸序列，通過(guò)靶向mRNA的3′非翻譯區(qū)(3′UTR)導(dǎo)致mRNA降解或抑制其翻譯來(lái)調(diào)節(jié)基因表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，某些特定的miRNA可以從癌癥組織中釋放進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，并且在目前尚未明確的機(jī)制下被保護(hù)免于內(nèi)源性RNA酶水解，進(jìn)而在血液中可以穩(wěn)定地表達(dá)，是診斷癌癥的潛在生物標(biāo)志物[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，多種血清miRNAs在正常人群與乳腺癌患者血清或組織中表達(dá)存在差異性，可作為診斷早期乳腺癌的生物標(biāo)志物[10-12]。然而，目前幾乎所有與血清miRNA診斷早期乳腺癌相關(guān)的研究均局限于正常人群和乳腺癌人群，并沒(méi)有將血清miRNA與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程緊密相連而進(jìn)行研究。因此，實(shí)驗(yàn)所得的早期乳腺癌診斷相關(guān)的血清miRNA較為廣泛，不具有特異性。

本試是首個(gè)將乳腺癌發(fā)生發(fā)展的4個(gè)階段(正常、非典型增生、原位癌、浸潤(rùn)癌)均納入為研究對(duì)象的研究。其中，由于乳腺非典型增生的發(fā)病率低(3%～4%)[13]，影像學(xué)診斷無(wú)法與乳腺良性腫瘤區(qū)分，造成多數(shù)患者在就診時(shí)已發(fā)展到乳腺癌階段；因此，臨床樣本的收集較困難，僅獲得10例血液樣本。通過(guò)對(duì)4個(gè)階段組織進(jìn)行miRNA高通量測(cè)序和對(duì)24例正常、10例非典型增生、22例原位癌以及40例早期乳腺癌患者血清進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)分析，最后獲得miR-486與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展最為密切的證據(jù)。雖然RT-qPCR的分析結(jié)果顯示，血清miR-486在正常對(duì)照組與其在乳腺非典型增生組的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),但仍可以看出其在組織和血液中均隨疾病進(jìn)展呈明顯下降變化趨勢(shì)。此外，對(duì)miR-486在正常人群和早期乳腺癌患者(原位癌Ⅰ、Ⅱ期)血清表達(dá)量的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示，其在早期乳腺癌患者血清中呈顯著低表達(dá)并與正常對(duì)照差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，而在不同分子分型乳腺癌中的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；ROC曲線分析結(jié)果顯示，AUC值為81.2%(95%CI=0.707～0.917)，以及其診斷早期乳腺癌的靈敏度和特異度分別高達(dá)62.5%和90.3%。過(guò)表達(dá)的miR-486可通過(guò)靶向癌基因PIM-1顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)G0/G1停滯并促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡[14]。在MCF-7乳腺癌細(xì)胞中，miR-486的高表達(dá)可以有效調(diào)節(jié)Smad2，抑制上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)的發(fā)生，進(jìn)而達(dá)到降低乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移和侵襲的能力[15]。因此推斷，miR-486在乳腺癌中可能發(fā)揮著抑癌基因的作用，不僅可以作為診斷早期乳腺癌的生物標(biāo)志物，還可能成為治療乳腺癌的一個(gè)新靶點(diǎn)。

關(guān)于miR-486在其他腫瘤的功能，研究[16]表明： miR-486通過(guò)靶向胰島素生長(zhǎng)因子(insulin growth factor, IGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的成分，包括IGF1、IGF1受體(IGF1R)和磷酸肌醇-3-激酶，調(diào)節(jié)亞基1(alpha)等，在非小細(xì)胞肺癌中發(fā)揮著抑癌基因的作用；同時(shí)ANK1的甲基化可以降低miR-486在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)[17]，其在血清中的低表達(dá)可以作為非小細(xì)胞肺癌的診斷標(biāo)志物[18]；過(guò)表達(dá)的miR-486可以通過(guò)靶向PIK3R1和刺激磷脂酰肌醇3-激酶-AKT活化抑制肝細(xì)胞癌的進(jìn)展[19]，并增加肝細(xì)胞癌對(duì)于化療藥物的敏感性[20]；同樣，miR-486也可以抑制結(jié)直腸癌[21]、骨癌[22-23]和食管癌[24]細(xì)胞的增殖、遷移和浸潤(rùn)。值得注意的是： miR-486在慢性粒細(xì)胞白血病中卻呈上調(diào)狀態(tài)，通過(guò)抑制miR-486的表達(dá)可以有效減緩慢性粒細(xì)胞白血病祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和促進(jìn)癌細(xì)胞的凋亡[25]；在前列腺癌中，miR-486通過(guò)直接靶向多種負(fù)調(diào)控因子(PTEN/P13K/Akt/，F(xiàn)OXO)驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)展[26]。由此可見(jiàn)，miR-486在不同腫瘤中發(fā)揮著差異性的作用(抑癌作用或促癌作用)，可以為癌癥的特異性診斷和治療提供新思路。

本研究還具有一定的不足之處： 組織及血液樣本的收集還需要進(jìn)一步的完善，并應(yīng)加強(qiáng)乳腺非典型增生樣本量的收集。接下來(lái)的研究則會(huì)收集大量組織及血液樣本進(jìn)行RT-qPCR，以進(jìn)一步驗(yàn)證分析結(jié)果，并對(duì)miR-486在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制進(jìn)行研究。

綜上所述，miR-486在乳腺癌發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中呈逐漸下調(diào)趨勢(shì)，并且其在早期乳腺癌患者的血清中呈顯著的低表達(dá)，可以作為特異性診斷早期乳腺癌的生物標(biāo)志物。