Microrna-34a靶向Sirt1調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡研究*

陳薊 劉弼 熊怡勝 黃雪晴

（暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院深圳市人民醫(yī)院骨科，廣東 深圳 518020）

在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis,OA）研究中，已有越來越多的miRNA被發(fā)現(xiàn)與關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有千絲萬縷的聯(lián)系，Microrna-34a（miR-34a）是其中之一[1]。已有研究[2]表明，miR-34a通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1期過渡到S期，有抗增殖作用，miR-34a同樣能由p53誘導(dǎo)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。Sirt1基因亦是已被證實(shí)在OA發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用[3]；然而miR-34a調(diào)控Sirt1在骨關(guān)節(jié)炎、軟骨細(xì)胞中的研究報(bào)道較少見。本實(shí)驗(yàn)研究在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞模型中，miR-34a對Sirt1的作用及其對Bcl-2的表達(dá)影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清(Hyclone)；DAPI染色試劑盒（Sigma）；Lipofectamine 2000、RT-PCR試劑盒（Invitrogen）；miR-34a mimic（RiboBio）；Sirt1抗體、GAPDH抗體（Santa Cruz）；Bcl-2抗體（Bioss）；低溫高速離心機(jī)（Eppendorf）；DNA擴(kuò)增儀（Biometra）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 C57BL/6J小鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的分離、純化、培養(yǎng)和刺激處理：無菌操作下取小鼠雙膝關(guān)節(jié)，磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffer saline,PBS）沖洗，剪取全部膝關(guān)節(jié)軟骨。在顯微鏡下去除關(guān)節(jié)囊周圍組織，并將軟骨組織與深層組織仔細(xì)分離。剪碎軟骨組織后用0.2%II型膠原酶消化4～6 h，離心去上清，培養(yǎng)基洗滌后再用含15%胎牛血清培養(yǎng)液分散培養(yǎng)。隨機(jī)分為兩組，正常對照組與IL-1β組，IL-1β終濃度為100 ng/ml，繼續(xù)培養(yǎng)，在加入IL-1β后24 h進(jìn)行觀察和檢測。

1.2.2 DAPI染色與流式細(xì)胞術(shù)觀察軟骨細(xì)胞凋亡：取第2代軟骨細(xì)胞，調(diào)整密度為2×105/ml，接種于6孔板進(jìn)行爬片。IL-1β組和對照組分別干預(yù)，24 h后按照DAPI染色試劑盒及AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒說明書操作，觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.2.3 熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證：分別構(gòu)建包含miR-34a種子序列結(jié)合位點(diǎn)野生型質(zhì)粒、包含種子序列突變位點(diǎn)的突變型質(zhì)粒（pmir-Glo-SIRT1-3’UTR WT和Mut），與miR-34a的mimics共轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后，測定螢光素酶活性，觀察miR-34a對野生型以及突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)的熒光素酶活力的影響。

1.2.4 RT-PCR檢測miR-34a和Sirt1 mRNA表達(dá)：根據(jù)試劑盒的說明提取軟骨細(xì)胞總RNA，包括miRNA。標(biāo)準(zhǔn)方案RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞中miR-34a和Sirt1 mRNA表達(dá)。

1.2.5 Western Blot檢測Sirt1、Bcl-2蛋白表達(dá)：根據(jù)IL-1β濃度（0 ng/ml、10 ng/ml、50 ng/ml、100 ng/ml）分為a、b、c、d組，細(xì)胞經(jīng)過處理后，提取總蛋白，并測定蛋白濃度，根據(jù)Western Blot實(shí)驗(yàn)步驟檢測軟骨細(xì)胞中Sirt1、Bcl-2的蛋白表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DAPI染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡結(jié)果

細(xì)胞接種于6孔板進(jìn)行細(xì)胞爬片，然后分為A組（對照組）、B組（實(shí)驗(yàn)組），用DAPI染色，于熒光顯微鏡下觀察并照相（圖1）。同時(shí)用AnnexinV-FITC/PI凋亡試劑盒檢測細(xì)胞凋亡（圖2）。

2.2 觀察miR-34 a對野生型以及突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí)的熒光素酶活力的影響，驗(yàn)證miR-34 a靶向Sirt 1

通過搜索miRDB以及TargetScan的序列分析，

圖1 DAPI染色檢測細(xì)胞凋亡（100×）

2.3 RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞中miR-34 a和Sirt 1 mRNA表達(dá)

在體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，給予100 ng/ml IL-1β刺激，然后RT-PCR檢測miR-34a（圖4A）和Sirt1 mRNA（圖4B）表達(dá)，與正常細(xì)胞對照組比較，IL-1β組miR-34a表達(dá)升高，Sirt1表達(dá)降低（P＜0.05）。這說明過表達(dá)miR-34a，導(dǎo)致Sirt1表達(dá)降低（圖4）。

2.4 WesternBlot實(shí)驗(yàn)檢測軟骨細(xì)胞中Sirt 1、Bcl- 2蛋白表達(dá)

發(fā)現(xiàn)Sirt1 3’UTR的746～752堿基可能是miR-34a的結(jié)合位點(diǎn)。同時(shí)將miR-34a的mimics與野生型Sirt1-Luc熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)與對照組比較，細(xì)胞熒光素酶活性顯著下降（P＜0.05），說明miR-34a能靶向作用Sirt1，并抑制螢光素酶的表達(dá)（圖3）。

在體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，根據(jù)IL-1β濃度（0 ng/ml、10 ng/ml、50ng/ml、100ng/ml）分為a、b、c、d組，與a組（對照組）比較，b、c、d組Sirt1、Bcl-2蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。這說明低表達(dá)Sirt1，Bcl-2表達(dá)同時(shí)亦降低（圖5）。

3 討論

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

圖3 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)

圖4 RT-PCR檢測軟骨細(xì)胞中miR-34a和Sirt1 mRNA表達(dá)

骨關(guān)節(jié)炎是一種退行性關(guān)節(jié)疾病，由多種因素引起，如衰老、肥胖、創(chuàng)傷等。許多文獻(xiàn)[4,5]將OA的發(fā)生發(fā)展機(jī)制歸因于軟骨細(xì)胞反應(yīng)性調(diào)節(jié)紊亂。這種紊亂造成合成代謝與分解代謝之間的失衡，具體表現(xiàn)為基質(zhì)降解酶類的產(chǎn)生和軟骨細(xì)胞的凋亡。

Sirt1是Sirtuin家族的一員，作為組蛋白脫乙?；敢雅c年齡相關(guān)的疾病聯(lián)系在一起，如II型糖尿病、老年癡呆癥、骨質(zhì)疏松癥等[6,7]。越來越多的證據(jù)表明，Sirt1在OA發(fā)生發(fā)展中起重要作用。有學(xué)者[3]研究發(fā)現(xiàn)，在軟骨細(xì)胞中，抑制Sirt1可以降低COL10A1和ADAMTS-5的表達(dá)，從而促進(jìn)OA進(jìn)程。同樣，抑制Sirt1可以通過線粒體-相關(guān)信號(hào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[8]。

在過去的幾年中，MicroRNA因其在軟骨細(xì)胞中的重要作用而越來越受到人們的關(guān)注。據(jù)報(bào)道[9]，在軟骨細(xì)胞中，調(diào)節(jié)miR-145靶向Smad3，可造成其下游靶基因的表達(dá)改變，從而引起IL-1β誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解。Jin等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-146a通過調(diào)節(jié)VEGF和TGF-β的信號(hào)通路參與人軟骨細(xì)胞凋亡與OA的進(jìn)程。

MicroRNA-34家族包括miR-34a、miR-34b、miR-34c。已有研究表明，miR-34a通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從G1過渡到S期具有抗增殖作用，miR-34a同樣能由p53誘導(dǎo)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯。miR-34a可以調(diào)控IL-1β誘導(dǎo)的COL2A1和iNOS表達(dá)，當(dāng)沉默miR-34a時(shí)，IL-1β誘導(dǎo)的鼠軟骨細(xì)胞凋亡明顯減少，同時(shí)可以阻止IL-1β誘導(dǎo)的II型膠原蛋白降解[2,11]。

Sirt1在OA發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用，同時(shí)miR-34a亦參與調(diào)節(jié)OA過程，那么miR-34a與Sirt1之間如何作用來調(diào)控OA的發(fā)生發(fā)展及其具體機(jī)制，值得進(jìn)一步深入研究。通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測及文獻(xiàn)搜索發(fā)現(xiàn)，Sirt1作為miR-34a的靶基因，在腫瘤細(xì)胞、肝臟、胰腺等細(xì)胞及組織器官中起重要作用[12,13]。然而miR-34a調(diào)控Sirt1在OA、軟骨細(xì)胞中的研究報(bào)道較少見。因此，在體外培養(yǎng)軟骨細(xì)胞，給予IL-1β刺激，發(fā)現(xiàn)miR-34a表達(dá)升高，Sirt1表達(dá)隨之降低。同時(shí)采用熒光素酶報(bào)告基因檢測驗(yàn)證miR-34a的靶基因Sirt1，發(fā)現(xiàn)將miR-34a的mimics與野生型Sirt1-Luc熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染軟骨細(xì)胞后，細(xì)胞熒光素酶活性顯著下降。表明miR-34a能靶向作用Sirt1，并抑制螢光素酶的表達(dá)。這說明過表達(dá)miR-34a降低Sirt1，可能是誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡加速OA進(jìn)程的重要原因。

圖5 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測軟骨細(xì)胞中Sirt1、Bcl-2蛋白表達(dá)

Bcl-2與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，其具有抑制細(xì)胞凋亡的作用。有學(xué)者[8]研究發(fā)現(xiàn)，激活Sirt1可以調(diào)控Bcl-2抑制軟骨細(xì)胞凋亡。本研究中，隨著IL-1β濃度逐漸增加，Sirt1、Bcl-2表達(dá)降低。說明低表達(dá)Sirt1，可以降低Bcl-2，從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。

綜上所述，在IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡模型中，miR-34a的表達(dá)增加，其可以靶向Sirt1進(jìn)而降低Bcl-2，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。既然，miR-34a靶向Sirt1誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡，那么沉默miR-34a，Sirt1表達(dá)增加，從而可以抑制軟骨細(xì)胞凋亡。這表明沉默miR-34a可能成為治療OA的新方法，這為研究防止OA進(jìn)程提供了新的靶點(diǎn)。然而，miR-34a靶向Sirt1調(diào)控軟骨細(xì)胞凋亡，是否還有其他通路或者分子受其調(diào)節(jié)，目前尚不明確。有學(xué)者[14]研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1可通過p53、NF-κB、Ku70和FOXOs等通路影響軟骨細(xì)胞凋亡，同時(shí)iNOS、COX-2以及MMP-13的表達(dá)亦發(fā)生改變[15]。是否miR-34a靶向Sirt1亦能參與這些調(diào)節(jié)過程，需要進(jìn)一步深入研究。

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