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    氯喹通過(guò)Akt/PI3K和PKC信號(hào)通路促進(jìn)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)

    2018-07-11 09:44:00宋冠軍
    關(guān)鍵詞:氯喹細(xì)胞膜顯微鏡

    宋冠軍,趙 平,周 琦

    (中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,湖北 武漢 430074)

    二型糖尿病是一種非胰島素依賴性的糖尿病?,F(xiàn)在90%以上的糖尿病都是二型糖尿病[1]。對(duì)于二型糖尿病的治療,注射胰島素并不能很好的控制病情,甚至可能使病情加重,因此,尋找能從根本上治療二型糖尿病的藥物就更為重要。

    許多味道苦的物質(zhì)都體現(xiàn)了其較好的抗糖作用[2]。例如苦瓜[3],小檗堿[4],這些苦物質(zhì)通常都可以用來(lái)清熱降火。作為苦物質(zhì)的代表——氯喹,最初是用來(lái)治療瘧疾的藥物。隨著研究的深入,它的許多其他的作用也不斷被科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)。早在1991年時(shí),就有科學(xué)家指出,氯喹可以增加胰島素的作用來(lái)促進(jìn)葡萄糖的攝取,但其具體的作用機(jī)制目前仍不清楚。

    GLUT4是在骨骼肌葡萄糖代謝中一個(gè)非常重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體[5],在本研究中,我們主要以GLUT4作為藥物研究的一個(gè)靶點(diǎn),研究氯喹對(duì)L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)位的影響并嘗試進(jìn)一步研究它的作用機(jī)理。

    1 材料與方法

    1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

    穩(wěn)定表達(dá)轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白IRAP-mOrange的L6細(xì)胞:IRAP-mOrange-L6。

    1.2 抗體及阻斷劑

    Wortmannin(Sigma),G?6983(EMD Millipore),F(xiàn)luo-4 AM(Camarillo,CA,USA)。

    1.3 細(xì)胞生理溶液

    PSS生理鹽溶液(含2mM的Ca2+)(mM):135 NaCl,5 KCl,1 MgCl2,2 CaCl2,10 HEPES,10 glucose,用NaOH調(diào)PH=7.4。

    1.4 實(shí)驗(yàn)方法

    1.4.1 利用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)L6細(xì)胞GLUT4轉(zhuǎn)位

    之前有研究證明,受胰島素調(diào)節(jié)的氨基肽酶IRAP和GLUT4蛋白存在高度共定位關(guān)系,同時(shí),許多實(shí)驗(yàn)已證明IRAP能夠作為一種報(bào)告分子反映GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)狀況。借助這一機(jī)理,通過(guò)L6細(xì)胞質(zhì)膜上IRAP-mOrange熒光強(qiáng)度的動(dòng)態(tài)變化,我們能夠間接地檢測(cè)GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位的變化,首先,我們將IRAP-mOrange-L6細(xì)胞接種在無(wú)菌蓋玻片上,放回于培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)使其貼壁。然后用不含血清的α-MEM培養(yǎng)液饑餓細(xì)胞2 h,再用配好的PSS溶液清洗。之后,將細(xì)胞放在激光掃描共聚焦顯微鏡下,加入1 mM氯喹,在555 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀測(cè)IRAP-mOrang熒光的變化。加藥后,每5分鐘拍一張照片共拍5個(gè)循環(huán),一直拍照記錄到加藥后的30 min。記錄數(shù)據(jù)并利用Origin軟件進(jìn)行分析。

    1.4.2 利用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)L6細(xì)胞內(nèi)的Ca2+水平

    饑餓細(xì)胞之前的步驟同檢測(cè)IRAP相同。用PSS溶液洗掉沒有血清的α-MEM培養(yǎng)液后。利用2 mM的Fluo-4 AM在室溫下避光孵育L6細(xì)胞20 min,將細(xì)胞內(nèi)鈣離子標(biāo)記上綠色熒光,接下來(lái)用溫浴后的PSS溶液將Fluo-4 AM洗去,在激光共聚焦顯微鏡下,在488 nm激發(fā)波長(zhǎng)下觀察L6細(xì)胞中綠色熒光強(qiáng)度的變化。記錄數(shù)據(jù)并分析,繪制折線圖反映細(xì)胞中Fluo-4的熒光強(qiáng)度變化。

    2 結(jié) 果

    2.1 氯喹促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)上膜

    我們通過(guò)檢測(cè)L6細(xì)胞中IRAP紅色熒光蛋白(IRAP-mOrange)來(lái)反映GLUT4在細(xì)胞膜上的定位。隨著氯喹的加入,可以觀察到L6細(xì)胞膜上的紅色熒光越來(lái)越明顯(圖2.1A)。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)加入1mM的氯喹后L6細(xì)胞膜上的熒光強(qiáng)度與加藥前相比顯著升高(圖2.1B)。

    圖2 .1 氯喹促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

    (A)通過(guò)confocal觀察在L6細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)的IRAP紅色熒光蛋白,隨著氯喹的加入,IRAP在細(xì)胞膜上的熒光強(qiáng)度明顯的增強(qiáng)。圖中比例尺=50 μm。(B)對(duì)L6細(xì)胞膜上的IRAP-mOrange熒光強(qiáng)度進(jìn)行統(tǒng)計(jì),發(fā)現(xiàn)在加入1mM的氯喹后的30 min內(nèi),L6細(xì)胞膜上的IRAP-mOrange熒光強(qiáng)度保持顯著的增強(qiáng)。

    2.2 氯喹可以通過(guò)Akt/PI3K信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

    我們利用Akt/PI3K阻斷劑wortmannin(100 nM)作用細(xì)胞30 min,我們發(fā)現(xiàn)wortmannin對(duì)氯喹引起的Ca2+的增加起到了一定的抑制作用(圖2.2下),但具體的作用機(jī)制還有待我們進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)和探討。另外,wortmannin抑制了L6細(xì)胞中氯喹刺激的IRAP熒光強(qiáng)度的增加(圖2.2上)。這證明氯喹確實(shí)可以通過(guò)Akt通路來(lái)刺激GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而促進(jìn)葡萄糖的吸收。

    圖2 .2 PI3K的抑制劑可以阻斷氯喹刺激的GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

    wortmannin抑制了GLUT4到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)(上)。同時(shí),wortmannin也明顯的降低了氯喹刺激的Ca2+的升高(下)。***:P<0.001。該實(shí)驗(yàn)證明Akt/PI3K確實(shí)參與了氯喹刺激的GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)。

    2.3 氯喹可以通過(guò)PKC信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

    接下來(lái),我們用PKC的抑制劑G?6983(10 μM)作用L6細(xì)胞30 min后,加入1mM氯喹之后用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測(cè)L6細(xì)胞中IRAP-mOrange的熒光強(qiáng)度。結(jié)果表明G?6983顯著抑制了氯喹引起的GLUT4的轉(zhuǎn)位(圖2.3上);同時(shí),G?6983對(duì)氯喹引起的Ca2+的增加沒有影響(圖2.3下)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)證明PKC參與了氯喹誘導(dǎo)的GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)。

    圖2 .3 PKC抑制劑作用會(huì)抑制氯喹刺激的GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)

    與正常細(xì)胞相比,G?6983明顯的抑制了GLUT4到細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)(上);然而卻沒有減少氯喹刺激的L6細(xì)胞內(nèi)Ca2+的增加(下)。***:P<0.001。

    3 討 論

    有報(bào)道稱氯喹可以增強(qiáng)胰島素抵抗病人中葡萄糖的攝取[6]。然而,對(duì)于氯喹抗糖機(jī)制以及其相對(duì)應(yīng)的機(jī)制仍不清楚。本課題就針對(duì)氯喹在治療二型糖尿病方面的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了研究。

    實(shí)驗(yàn)中,我們發(fā)現(xiàn)氯喹可以促進(jìn)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)上膜,為了進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。我們分別用wortmannin和G?6983處理L6細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)wortmannin能抑制氯喹引起的GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)的增加和胞內(nèi)Ca2+的增加,而G?6983顯著抑制了氯喹引起的GLUT4的轉(zhuǎn)位,但對(duì)氯喹引起的Ca2+的增加沒影響。證明氯喹是通過(guò)Akt/PI3K和PKC信號(hào)通路增強(qiáng)L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)運(yùn)。同時(shí),氯喹能通過(guò)Akt/PI3K信號(hào)通路促進(jìn)胞內(nèi)Ca2+的增加,結(jié)合之前報(bào)道,氯喹誘導(dǎo)的胞內(nèi)Ca2+的增加能促進(jìn)L6細(xì)胞內(nèi)GLUT4與細(xì)胞質(zhì)膜的融合[7]。這些結(jié)果說(shuō)明氯喹可能開發(fā)為一種新的潛在的降血糖藥物。當(dāng)然,我們的研究也存在著不足。我們目前缺乏氯喹在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)上的數(shù)據(jù)。未來(lái)我們將通過(guò)獲得不同類型的二型糖尿病小鼠,直接觀測(cè)藥物對(duì)其血糖以及生命活動(dòng)的影響,從而進(jìn)一步確認(rèn)氯喹的可靠性與安全性。

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