酶解法制備臭鱖魚蛋白水解液

王翠 吳倩 殷婷婷 徐芹芹 伍亞華

摘 要：該文以水解度為考察指標，采用中性酶對臭鱖魚肉糜進行了蛋白質(zhì)水解，然后對影響水解反應(yīng)的因素如酶的添加量、酶解溫度、pH和液固比進行了研究，確定了最佳工藝條件。結(jié)果表明，中性酶水解臭鱖魚蛋白質(zhì)的最佳條件為液固比（g：mL）為4 [∶]1，酶的添加量為3000U/g，pH6.0，水解溫度35℃。該條件下酶解時間3h，臭鱖魚肉蛋白質(zhì)的水解度為32.9%。

關(guān)鍵詞：臭鱖魚；酶解；水解度

中圖分類號 TS254.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2018）03-04-0071-3

Abstract：The degree of hydrolysis （DH） as the index of investigation，the protein hydrolysis of smelly mandarin fish was carried out by neutral enzyme，technologic parameters influencing reaction including enzyme amount， temperature， pH and liquid-solid ratio were studied using enzyme hydrolysis.The optimum technologic condition was confirmed. Result showed that the best conditions were determined as follows： liquid-solid ratio 3：1， enzyme dose 2400 U/g， pH 6.0， hydrolysis temperature 35℃ and hydrolysis time 3h. These conditions gave a hydrolysis degree of smelly mandarin fish of 32.9% .

Key words： Smelly manarin fish；Enzymatic hydrolysis；Degree of hydrolysis

臭鱖魚（smelly manarin fish），又名腌鮮鱖魚，是新鮮鱖魚發(fā)酵后的產(chǎn)物，生“臭”熟香[1]，是最具代表性的徽菜之一。臭鱖魚不但營養(yǎng)價值高，而且口感和風味獨特[2]。目前關(guān)于臭鱖魚的研究較少，多為初加工及微生物發(fā)酵，而在精深加工方面的報道較少。

蛋白質(zhì)水解后的產(chǎn)物中含有大量的多肽，實驗表明，很多多肽具有良好的生物活性，如抗氧化性。目前，如何利用不同的蛋白資源開發(fā)功能多肽已成為研究熱點之一[3]。為此，本文以臭鱖魚為研究對象，以蛋白水解度為考察指標，采用酶解法制備臭鱖魚蛋白水解液，以期為臭鱖魚的精深加工提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 新鮮鱖魚，市購，去除內(nèi)臟，洗凈，臭豆腐均勻抹滿全身，裝入食品袋，冰箱冷藏7d，絞碎成魚肉糜后備用。酸性蛋白酶（5萬U/g）、堿性蛋白酶（10萬U/g），無錫酶制劑廠；中性蛋白酶（5萬U/g）、木瓜蛋白酶（80萬U/g），南寧龐博生物工程有限公司。

1.1.2 主要設(shè)備 FA2204B電子分析天平，上海越平科技科技有限公司；PB-10pH計，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；多功能食品粉碎機，上海海菱電器有限公司；DK-S28型電子恒溫水浴鍋，上海精宏實驗設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蛋白質(zhì)酶解液的制備工藝 稱取一定魚肉肉糜，異丙醇脫脂后，按比例加入一定量的去離子水，加熱至某一的溫度，調(diào)節(jié)pH值，加酶，攪拌，恒溫條件下水解一定時間，轉(zhuǎn)移至沸水中對酶滅活10min，離心過濾，取上清液，即為水解液。

1.2.2 蛋白水解度DH的測定 具體見參考文獻[4]。計算公式如下：

[DH（%）=A1-A0A×100]

式中：A1為水解液中游離氨基態(tài)氮的含量；A0為水解前樣液中氨基態(tài)氮的含量；A為魚肉糜中總氮的含量。

原料蛋白液中總氮含量檢測方法為凱氏定氮法，游離氨基態(tài)氮含量測定為甲醛滴定法[5]。

2 結(jié)果與分析

2.1 水解酶的選擇 在預(yù)實驗的基礎(chǔ)之上，選擇酸性蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶以及木瓜蛋白酶作為蛋白質(zhì)水解酶，結(jié)合這幾種酶的最適工作范圍，魚肉糜與去離子水的液固比（g：mL）為3：1，45℃、酶的添加量為3000U/g，在適宜的pH條件下，水解3h，考察魚肉蛋白水解度，結(jié)果見表1。由表1可知，這4種蛋白酶對臭鱖魚肉糜的水解效果差別很大，其中，中性蛋白酶的水解效果最好，水解度可達31.1%，酸性蛋白酶次之，堿性蛋白酶的水解效果最差。因此，選擇中性蛋白酶作為臭鱖魚的蛋白水解酶進行單因素實驗，從而最終確定最佳水解條件。

2.2 單因素實驗 確定中性蛋白酶作為水解酶，分別研究酶的添加量、水解溫度、pH、水解時間、液固比對水解效果的影響。

2.2.1 酶的添加量對水解效果的影響 魚肉糜與去離子水的液固比（g：mL）為3[∶]1，45℃、pH7.0的條件下，改變酶的添加量，水解3h后，臭鱖魚肉糜水解結(jié)果如表2所示。由表2可知，隨著中性蛋白酶添加量的增加，臭鱖魚肉糜水解度也隨之增加。當酶的添加量為1500U/g時，水解度為17.1%，酶的添加量增加為3000U/g時，水解度快速增加到31.1%，此后，隨著酶的添加量進一步增加，蛋白水解度增加趨緩。這可能是由于反應(yīng)底物與水解酶的結(jié)合基本飽和的原因[6]。綜合考慮，確定酶的添加量為3000U/g。

2.2.2 溫度對水解效果的影響 魚肉糜與去離子水的液固比（g：mL）為3[∶]1，酶的添加量為3000U/g，pH7.0的條件下，改變水解溫度，水解3h后，臭鱖魚肉糜水解結(jié)果如表3所示。由表3可知，在較低范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，臭鱖魚肉糜水解度也隨之增加。當溫度升高到45℃時，水解度為31.3%，此后，隨著溫度進一步上升，水解度反而下降。這是因為溫度對酶催化活性的影響很大，在適溫度范圍內(nèi)，酶活性強，酶促反應(yīng)速度大。因為酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，所以當溫度升高到一定值后，酶的活性就要鈍化，甚至完全失活。因此確定水解溫度為45℃。

2.2.3 pH對水解效果的影響 魚肉糜與去離子水的液固比（g：mL）為3∶1，酶的添加量為3000U/g，水解溫度為45℃的條件下，改變pH，水解3h后，臭鱖魚肉糜水解結(jié)果如表4所示。由表4可知，pH對水解反應(yīng)影響很大，當pH為5時，水解度為30.3%，當pH為7時，水解度升高到最大值31.1%，此后，隨著pH進一步增加，水解度快速下降。這是因為pH不但可以改變蛋白酶的構(gòu)象，還會改變酶與反應(yīng)底物之間的相互作用，導(dǎo)致酶對反應(yīng)底物的催化反應(yīng)收到影響。因此確定pH為7.0。

2.2.4 水解時間對水解效果的影響 魚肉糜與去離子水的液固比（g：mL）為3∶1，酶的添加量為3000U/g，水解溫度為45℃的條件下，pH7.0，改變水解時間，臭鱖魚肉糜水解結(jié)果如表5所示。由表5可知，在較短的時間內(nèi)，水解時間對水解度的影響較大，隨著水解時間的延長，蛋白質(zhì)水解度增加，當水解時間為3h時，水解度為30.9%，此后，隨著水解時間的進一步延長，水解度增加緩慢。綜合考慮，確定水解時間為3h。

2.2.5 液固比對水解效果的影響 酶的添加量為3000U/g，水解溫度為45℃，pH7.0的條件下，改變魚肉糜與去離子水的液固比（g：mL），水解3h，臭鱖魚肉糜水解結(jié)果如表6所示。由表6可知，在較低的范圍內(nèi)，隨著液固比的增加，蛋白質(zhì)水解度也隨之增加，液固比增加到3：1時，水解度為30.9%。當液固比進一步增加，則水解度降低。這是因為液固比過低，反應(yīng)底物溶解不夠，酶在體系中的擴散能力降低，過量的底物可能通過分子間的作用力與酶形成穩(wěn)定的中間產(chǎn)物，抑制了酶與底物的結(jié)合，導(dǎo)致蛋白水解度降低[7]。液固比過高，盡管可以增加反應(yīng)底物的溶解度，但酶的濃度也會降低，酶與反應(yīng)底物結(jié)合困難，水解度降低。因此選擇液固比為3[∶]1。

2.3 酶的水解反應(yīng)條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選擇酶的添加量、溫度、pH以及液固比進行四因素三水平L9（34）正交試驗，具體因素水平見表7。具體實驗結(jié)果見表8。

由極差分析可知，中性酶水解臭鱖魚蛋白質(zhì)的正交試驗中，各因素影響主次順序為：D（液固比）>B（溫度）>A（酶的添加量）>C（pH），最佳工藝條件為D3B1A2C1。驗證實驗結(jié)果顯示，在液固比（g：mL）為4∶1、中性酶的添加量為3000U/g、pH6.0、35℃條件下，水解3h后，臭鱖魚肉蛋白質(zhì)水解度為32.9%，優(yōu)于其他實驗結(jié)果。

3 結(jié)論

采用酶解法對臭鱖魚肉糜進行蛋白質(zhì)水解，選用中性酶，在液固比（g：mL）為4∶1、酶的添加量為3000U/g、pH6.0、35℃條件下，水解3h后，臭鱖魚肉蛋白質(zhì)水解度可達32.9%。

參考文獻

[1]宋亞瓊，閆曉明，丁之恩，等.基于模糊數(shù)學的臭鱖魚的感官評定[J].中國釀造，2015，34（5）：123-126.

[2]羅靚芷，武俊瑞，劉佳藝，等.臭鱖魚中優(yōu)良乳酸菌的分離篩選與鑒定[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39（10）：132-136.

[3]何健南.蛋白質(zhì)水解物提高乳化體系穩(wěn)定性的研究進展[J].黑龍江農(nóng)業(yè)科學，2015（12）：177-181.

[4]厲望，靳挺，武玉學.帶魚蛋白酶解條件優(yōu)化及酶解物抗氧性能[J].食品科學，2013，34（9）：234-239.

[5]郭興風.蛋白質(zhì)水解度的測定[J].中國油脂，2000，25（6）：176-177.

[6]鄭寶東.食品酶學[M].南京：東南大學出版社，2006：89-90.

[7]周曉云.酶技術(shù)[M].北京：石油工業(yè)出版社，1995：21-22.

（責編：張宏民）