趨化因子CCL2對(duì)STEMI患者殘余血小板活化的影響

曹禹，于淼，喬銳，童芳念，程茗慧，李春輝，劉丹

急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是嚴(yán)重威脅人類健康并影響人類生存的主要疾病之一[1]。AMI是在冠脈粥樣硬化不穩(wěn)定斑塊破裂的基礎(chǔ)上繼發(fā)了血栓形成，導(dǎo)致冠脈變窄甚至完全閉塞引起的心肌缺血甚至壞死。炎癥反應(yīng)及血小板的聚集和激活在冠脈血栓形成過程中扮演著重要角色[2]。目前，AMI的主要治療策略是經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入(percutaneous coronary intervention，PCI)治療及圍術(shù)期開始的長(zhǎng)期雙聯(lián)抗血小板治療。氯吡格雷和阿司匹林是常用的抗血小板藥物，主要作用是抑制血小板ADP受體和血栓素A2的生成，在一定程度上緩解患者的臨床癥狀并改善患者預(yù)后，但仍有部分患者再次發(fā)生缺血性事件，部分原因歸咎于氯吡格雷抵抗[3]。

新型抗血小板藥物替格瑞洛(商品名：倍林達(dá))為非前體藥，不需要肝臟代謝，具有可與P2Y12 ADP受體可逆性結(jié)合，抑制血小板作用較強(qiáng)，可降低急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)患者不良心血管事件風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)勢(shì)。心血管臨床醫(yī)生及相關(guān)臨床研究人員在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)認(rèn)為ACS患者服用替格瑞洛后不會(huì)發(fā)生殘余血小板高反應(yīng)，且可以完全改善患者因服用氯吡格雷帶來的不良后果。但是，隨著研究的不斷深入，諸多研究證實(shí)ACS患者即使服用替格瑞洛，仍然不能避免血栓事件的發(fā)生[4-5]，說明仍有一定程度的殘余血小板聚集和活化。因此，尋找參與殘余血小板聚集和活化的關(guān)鍵調(diào)控分子至關(guān)重要。

趨化因子CCL2在動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和ACS的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用[6-9]。CCL2通過與其特異性受體CCR2結(jié)合而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，可以趨化血液循環(huán)中的單核細(xì)胞至動(dòng)脈粥樣病變區(qū)域[10-11]。本研究探討CCL2對(duì)STEMI患者服用替格瑞洛后殘余血小板活化的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 連續(xù)入選自2015年4－9月沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院CCU收治的STEMI患者80例。入選患者均為漢族，年齡35～75歲，均有持續(xù)30min以上的典型胸痛，發(fā)病時(shí)間＜12h；心電圖顯示ST段呈弓背向上型抬高及動(dòng)態(tài)演變過程；冠脈造影顯示冠脈左前降支、左回旋支及右冠狀動(dòng)脈中有1處或多處血管狹窄程度超過75%。排除近期患有嚴(yán)重肝腎疾病、血液系統(tǒng)疾病、腫瘤性疾病、先天性心臟病、心臟瓣膜疾病、自身免疫病、活動(dòng)性炎性疾病、血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定、嚴(yán)重心衰等疾病及既往行PCI或冠狀動(dòng)脈搭橋手術(shù)的患者。本研究經(jīng)沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，入選的研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2 臨床資料采集 詳細(xì)記錄入選患者的入院時(shí)間、年齡、性別等一般情況；冠心病的常見危險(xiǎn)因素：吸煙史、糖尿病病史、高血壓病史；實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果：空腹血糖(fasting plasma glucose，F(xiàn)PG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、甘油三酯(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、腦尿鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)、肌酸激酶同工酶(creatine kinase isoenzyme，CK-MB)和肌鈣蛋白T(Troponin T，TnT)等。

1.3 樣本采集及分組 入選的80例患者均服用180mg替格瑞洛，300mg阿司匹林腸溶片(商品名：拜阿司匹林)，隨后進(jìn)行PCI治療，術(shù)中應(yīng)用肝素或比伐蘆定抗凝，均未應(yīng)用替羅非班等ⅡbⅢa受體拮抗藥。術(shù)后規(guī)律服用90mg替格瑞洛，2次/d，100mg阿司匹林腸溶片，1次/d。連續(xù)抽取80例服用替格瑞洛患者的靜脈血，采血時(shí)間點(diǎn)為服藥后

2、4、6h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)用含EDTA的真空抗凝管采集3ml靜脈血，用含枸櫞酸鈉的真空抗凝管采集3ml靜脈血。按照文獻(xiàn)[12]報(bào)道，根據(jù)光比濁法檢測(cè)的殘余血小板聚集率(residual platelet aggregation rate，RPA)數(shù)值不同將患者分為兩組，RPA≥59%為殘余血小板高反應(yīng)組(高反應(yīng)組)，RPA＜59%為殘余血小板正常反應(yīng)組(正常反應(yīng)組)。

1.4 ELISA檢測(cè)血漿CCL2水平 制備CCL2標(biāo)準(zhǔn)品，每孔先加入50μl稀釋液RD1-83，再加入200μl標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，室溫孵育2h；棄去液體，加入400μl沖洗緩沖液，洗3次后拍干；加入200μl CCL2結(jié)合溶液，室溫孵育2h；加入200μl底物溶液，避光孵育30min；加入50μl終止液，在酶標(biāo)儀上檢測(cè)。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)公式計(jì)算出每個(gè)待測(cè)樣品的濃度。

1.5 光比濁法檢測(cè)ADP誘導(dǎo)的人RPA值 采用含枸櫞酸鈉的真空抗凝管采集人靜脈血3ml，室溫下800r/min離心10min，上清為富含血小板血漿(platelet-rich plasma，PRP)。將PRP移至新的EP管，余下的血標(biāo)本于室溫下3000r/min離心10min，上清為貧血小板血漿(platelet-poor plasma，PPP)。打開光比濁檢測(cè)儀(光透射儀)，取250μl PPP加入到血小板反應(yīng)杯中，再將血小板反應(yīng)杯插入檢測(cè)儀的檢測(cè)孔中調(diào)零。取225μl PRP加入血小板反應(yīng)杯中，放入磁珠，將帶有磁珠的血小板反應(yīng)杯插入檢測(cè)儀的檢測(cè)孔中。將25μl ADP(20μmol/L)作為血小板誘導(dǎo)劑迅速加入檢測(cè)孔，37℃條件下1000r/min開始檢測(cè)，電腦顯示血小板聚集率情況，共記錄10min。待反應(yīng)結(jié)束后，記錄人RPA最大值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；兩組分類變量的比較采用χ2檢驗(yàn)；患者RPA值與血漿CCL2濃度之間的關(guān)系應(yīng)用Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者臨床基線資料及RPA比較 服藥后2、4、6h時(shí)間點(diǎn)正常反應(yīng)組患者分別為45例、57例、66例，高反應(yīng)組患者分別為35例、23例、14例，殘余血小板高反應(yīng)比例分別為43.8%、28.8%、17.5%。服藥后各時(shí)間點(diǎn)，兩組臨床基線資料比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。各時(shí)間點(diǎn)高反應(yīng)組的RPA值均明顯高于正常反應(yīng)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000，表1)。

2.2 患者血漿中CCL2濃度的差異及其與RPA的相關(guān)性

2.2.1 兩組患者血漿CCL2濃度比較 服藥后2、4、6h，高反應(yīng)組患者血漿CCL2濃度分別為209.72±84.09、195.54±63.66、184.29±56.74pg/ml，明顯高于正常反應(yīng)組(分別為167.52±36.92、160.63±42.31、152.43±42.48pg/ml)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01、P＜0.01、P＜0.05，圖1)。

2.2.2 患者RPA值與血漿中CCL2濃度的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，服藥后2、4、6h，患者RPA值與血漿CCL2濃度均存在線性關(guān)系(r=0.474、r=0.622、r=0.425，P＜0.01，圖2)。

表1 兩組各時(shí)間點(diǎn)服用替格瑞洛的STEMI患者基線資料及血小板聚集率比較Tab. 1 Comparison of the baseline data and platelet aggregation rate at different time points after taking ticagrelor in two groups

圖1 服用替格瑞洛后不同時(shí)間點(diǎn)兩組血漿CCL2濃度比較Fig. 1 Comparison of the plasma CCL2 concentration at different time points after taking ticagrelor in two group(ELISA)

3 討 論

圖2 不同時(shí)間點(diǎn)患者RPA與血漿CCL2濃度的相關(guān)性分析Fig. 2 The correlation of RPA and plasma CCL2 concentration at different time points

血小板沒有細(xì)胞核，但其內(nèi)部含有多種細(xì)胞器及散在分布的顆粒成分，具有完整的轉(zhuǎn)錄組并可以翻譯蛋白質(zhì)。血小板在止血、傷口愈合、炎癥反應(yīng)、血栓形成及器官移植排斥等生理及病理過程中均發(fā)揮著重要作用[13]。血小板是構(gòu)架血管炎癥和血栓形成之間必不可少的成分。當(dāng)血管內(nèi)皮損傷并且內(nèi)皮下膠原暴露后，血小板與受損的內(nèi)皮及暴露的膠原結(jié)合，促使血小板迅速發(fā)生活化，釋放血小板顆粒內(nèi)的細(xì)胞因子、趨化因子等成分，這些顆粒分泌物進(jìn)一步促進(jìn)血小板的活化和聚集，形成正反饋；同時(shí)，這些顆粒分泌物還能與血小板膜上的G蛋白偶聯(lián)受體結(jié)合，誘導(dǎo)血小板內(nèi)第二波激活信號(hào)，進(jìn)而促使血小板顆粒分泌增加[14]。血小板活化、聚集和顆粒分泌在AS等炎癥性疾病中至關(guān)重要，主要表現(xiàn)為血小板與趨化因子共同作用并參與AS等炎癥性疾病的發(fā)生發(fā)展[15]。AS斑塊破裂后血小板黏附、聚集和激活不僅在冠脈血栓形成中發(fā)揮重要作用，在斑塊破裂處形成的血管阻塞中也同樣起作用，是缺血性疾病如AMI的主要病理基礎(chǔ)[16]。每個(gè)個(gè)體的血小板反應(yīng)性不盡相同，其發(fā)生心血管終點(diǎn)事件的概率和嚴(yán)重程度也不盡相同，具有血小板高反應(yīng)性的個(gè)體更容易發(fā)生血小板聚集及激活，發(fā)生缺血性事件的概率也要明顯高于血小板反應(yīng)正常的個(gè)體[17]。因此，明確與血小板高反應(yīng)相關(guān)的信號(hào)分子至關(guān)重要。

近年來，隨著人們生活方式的改變，心血管疾病患者日益增多，AMI是嚴(yán)重威脅人類健康的常見的重大疾病之一。AMI發(fā)病急，發(fā)病率和病死率呈持續(xù)升高趨勢(shì)，其中冠脈粥樣硬化病變部位的炎癥反應(yīng)及粥樣硬化斑塊的破裂發(fā)揮著關(guān)鍵作用[18]。積極抗血小板治療是目前主要的治療手段之一，然而，由于大部分抗血小板藥物作用機(jī)制單一，無法完全拮抗血小板，引起殘余血小板的再次活化和聚集，導(dǎo)致一部分患者發(fā)生主要心腦血管不良事件。RAPID研究[19]報(bào)道了25例STEMI患者服用180mg負(fù)荷劑量的替格瑞洛后，2h和4h的殘余血小板高反應(yīng)比例分別為60%和35%。RAPID2研究[20]報(bào)道即使增加替格瑞洛負(fù)荷劑量至360mg，25例STEMI患者服藥后2h的殘余血小板高反應(yīng)比例仍有32%。本研究發(fā)現(xiàn)，80例服用替格瑞洛的STEMI患者，應(yīng)用光比濁法檢測(cè)患者服藥后2、4、6h的RPA值，均有一定比例的殘余血小板高反應(yīng)?？梢?，探尋發(fā)生殘余血小板高反應(yīng)的原因或者發(fā)現(xiàn)調(diào)控血小板聚集和活化的關(guān)鍵因子尤為重要。

趨化因子CCL2除了可趨化血液循環(huán)中的單核細(xì)胞至AS損傷部位，還可以作為始動(dòng)因子誘導(dǎo)其他炎癥因子和組織因子的產(chǎn)生和釋放，促使AS的進(jìn)展以及不穩(wěn)定斑塊破裂所致的血栓形成[21]。本課題組前期應(yīng)用熒光定量PCR、Western blotting、免疫組織化學(xué)等方法檢測(cè)經(jīng)導(dǎo)管抽吸獲得的STEMI患者冠脈血栓組織中CCL2和CCR2的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)無論在RNA或是蛋白水平，其表達(dá)均增高，且免疫熒光染色觀察發(fā)現(xiàn)CCL2和CCR2均可以與血小板標(biāo)記物CD62p共定位，提示CCL2/CCR2可能通過對(duì)血小板的調(diào)控參與冠脈血栓形成。本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)，STEMI患者服用氯吡格雷4～6h后，通過光比濁法檢測(cè)患者RPA，高反應(yīng)組患者血漿中CCL2的濃度明顯高于正常反應(yīng)組，而且RPA與血漿中的CCL2濃度存在線性相關(guān)[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，80例服用替格瑞洛的STEMI患者服藥后2、4、6h，高反應(yīng)組患者血漿中CCL2的濃度仍明顯高于正常反應(yīng)組，而且各時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的RPA值與血漿中CCL2濃度之間均存在線性關(guān)系。然而，按照患者服藥后不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)的RPA值分組，高反應(yīng)組患者臨床基線資料中各項(xiàng)指標(biāo)均與正常反應(yīng)組患者相匹配，與各時(shí)間點(diǎn)應(yīng)用光比濁法檢測(cè)的RPA值及血漿中CCL2濃度均無相關(guān)性，說明RPA值與血漿中CCL2表達(dá)水平的相關(guān)性未受基線指標(biāo)等因素的干擾，提示CCL2可能參與了殘余血小板的活化和聚集。

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