紅景天苷對力竭大鼠心肌收縮力的影響

齊江莉，李泱，解亞楠，曹雪濱

適當負荷運動可促使心臟發(fā)生重塑，表現(xiàn)為心肌毛細血管密度增加，心肌纖維增粗，心肌收縮力增強，心功能儲備充足[1-3]。然而，超負荷運動，如力竭運動，超出了人類和動物的生理極限，可破壞機體穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致機體多臟器產(chǎn)生過度應(yīng)激反應(yīng)，進而出現(xiàn)損傷及功能異常[4]。近年來，在軍事訓(xùn)練及競技比賽中，運動性心臟損傷呈增加的趨勢[5]。因此，研究力竭運動引起心臟損傷的機制及其防治措施具有重要的臨床意義[6]。根據(jù)藥理學(xué)及臨床療效觀察，紅景天苷(salidroside，Sal)作為紅景天的有效成分之一，對心血管具有很強的保護作用，可以改善心肌缺血，減少心肌缺血梗死面積，改善心功能，對冠心病、心力衰竭、高血壓等均有輔助治療作用[7-9]。但是，紅景天苷對力竭運動后心肌細胞收縮力的影響及其機制尚缺乏研究。本研究建立力竭運動大鼠模型，觀察力竭運動對心肌收縮力的影響，同時探討紅景天苷防治力竭運動心臟損傷的作用及機制，旨在為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑 99%紅景天苷粉劑購自上海英軒生化試劑有限公司，Ⅱ膠原酶、胰蛋白酶、4-羥乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)購自美國Sigma公司；乙二醇四乙酸(EGTA)購自美國Fluka Biochemika公司；其他試劑均為分析純。Tyrode液(mmol/L)：NaCl 135、KCl 5.4、CaCl21.0、MgCl21.0、NaH2PO40.33、HEPES 10、葡萄糖10，用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.3；無鈣Tyrode液為Tyrode液中不加CaCl2。細胞保護液(KB液，mmol/L)：KOH 110，牛磺酸(Taurine)10，L-谷氨酸(L-Glutamic acid)70，KCl 25，KH2PO410，EGTA 5，HEPES 5，葡萄糖10，用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.4。

1.2 主要儀器 Langendorff灌流裝置、可視化單細胞動緣探測系統(tǒng)(美國IonOptix)、電子刺激器(SEN27103，美國IonOptix)、激光掃描共聚焦顯微鏡(SP5，德國Leica)。

1.3 實驗動物分組、給藥及造模 健康雄性清潔級SD大鼠40只，體重120～150g，由斯貝福生物技術(shù)有限公司提供(許可證號：SCXK 2016-0002)。實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，然后將大鼠隨機分為4組：對照組，力竭組(REE)，紅景天苷A、B組(Sal-A、Sal-B)，每組10只。Sal-A組、Sal-B組分別腹腔注射紅景天苷溶液15、30mg/(kg·d)，連續(xù)2周；對照組、REE組給予等體積0.9% NaCl注射液，連續(xù)2周。給藥完成后，對照組不做任何運動，REE組、Sal-A組、Sal-B組進行反復(fù)力竭游泳運動。

依據(jù)Thomas實驗的方法[10]，通過力竭游泳運動建立運動性心臟損傷動物模型。選擇高70cm，最大直徑55cm的塑料圓桶作為大鼠游泳槽，水深55cm以上，內(nèi)壁光滑，水溫33±2℃。大鼠尾部負重3%負荷。每次運動后，迅速用干毛巾擦除水分，電暖風(fēng)機吹干動物皮毛，置于籠中休息。每次游泳時間不少于6h，較短時間出現(xiàn)力竭表現(xiàn)的大鼠，可將其撈出休息5～10min，隨后放入水中繼續(xù)游泳，直至?xí)r間達6h以上。力竭游泳運動共進行14d，1次/d，每周休息1d，于最后一次力竭游泳運動后2h腹腔注射肝素150U/100g，20min后10%水合氯醛1ml/100g麻醉，然后將大鼠仰臥位固定于實驗臺上，迅速開胸取出心臟分離心肌細胞。力竭標準：大鼠連續(xù)3次沉入水底，每次超過10s，不能自主浮上水面；同時觀察大鼠身體狀況，當出現(xiàn)協(xié)調(diào)運動喪失、放在平面上無法完成翻正反射時即從水中撈出。

1.4 ELISA法檢測心肌損傷標志物水平 按照ELISA試劑盒說明檢測各組大鼠血清中肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、肌鈣蛋白I(TnI)水平，酶標儀檢測450nm處吸光度(OD)值。

1.5 大鼠單個心室肌細胞分離 上述各組大鼠，經(jīng)10%水合氯醛(2ml/kg)腹腔注射麻醉，迅速取出心臟，在37℃和通氧條件下行Langendorff灌流。用無鈣Tyrode's液(流速8ml/min)灌流3～5min，用含Ⅱ型膠原酶30mg、胰蛋白酶5mg的無鈣Tyrode's液50ml灌流15～18min進行消化，剪碎后置入細胞保護液(KB液)中并吹打使細胞脫落，并于4℃保存，1h后進行實驗。

1.6 IonOptix單細胞動緣探測系統(tǒng)同步監(jiān)測心肌細胞鈣瞬變和收縮 將心肌細胞與Ca2+熒光染料FLUO-4于10ml離心管中混勻，在避光條件下?lián)u床孵育20min，棄上清，重新加入KB液，洗去細胞外多余的鈣熒光指示劑。利用IonOptix系統(tǒng)檢測熒光染料所發(fā)出的信號以反映收縮過程中Ca2+濃度的變化。取適量的心肌細胞置于IonOptix系統(tǒng)的浴槽內(nèi)，采用正常臺式液以1.5ml/min的速度灌流。設(shè)置電場刺激為電壓15V，頻率1Hz。實驗開始前，首先轉(zhuǎn)換低倍物鏡以選定視野中邊界分明、橫紋清楚、收縮協(xié)調(diào)的心肌細胞作為記錄對象，然后轉(zhuǎn)換高倍鏡，將選定的細胞于視野中放大。給予刺激后若細胞收縮穩(wěn)定，則開始同步記錄鈣瞬變和細胞收縮。兩者通過照相系統(tǒng)將光信號呈現(xiàn)于顯示器，并由計算機系統(tǒng)采集及記錄。

1.7 激光共聚焦顯微鏡線掃描成像技術(shù)記錄心肌細胞自發(fā)性鈣火花及肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+含量 鈣火花：熒光指示劑處理細胞同鈣瞬變和收縮的檢測。不同之處是上機前將細胞移至層粘連蛋白(laminin)貼壁處理過的細胞皿中，細胞外液為含鈣臺式液。將熒光指示劑孵育完畢的心肌細胞置于顯微鏡載物臺，選取視野中橫紋清楚、收縮穩(wěn)定的桿狀細胞作為記錄對象。共聚焦顯微鏡以線掃描(xt)成像，在線掃描之前需采用平面(xyt)掃描得到細胞的范圍，隨后調(diào)節(jié)選取熒光指示劑分布均勻的平面，然后將掃描線置于選定平面的中央，轉(zhuǎn)換成線掃描方式，同時刺激細胞記錄心肌細胞鈣火花。肌質(zhì)網(wǎng)鈣容量：咖啡因(caffeine)可以激動蘭尼堿受體(ryanodine receptor，RyR)，使其開放，選用濃度為20mmol/L的咖啡因作用于RyR，以確保肌質(zhì)網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum，SR)內(nèi)的鈣全部清空。心肌細胞負載染料完成后置于浴槽內(nèi)，選取橫紋清楚、邊界清晰的桿狀細胞，待其收縮穩(wěn)定后，于其旁邊給予咖啡因以刺激RyR，RyR完全處于開放狀態(tài)后引起肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣迅速全部釋放，此時鈣瞬變峰值達到最大，可以反映肌質(zhì)網(wǎng)鈣容量。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間進一步兩兩比較用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌損傷標志物水平檢測 REE組TnI、CK和CK-MB水平均高于對照組，給予Sal后，TnI、CK和CK-MB水平均下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，且Sal-B組較Sal-A組下降更為明顯(P＜0.05，表1)。

表1 4組大鼠心肌損傷標志物水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of heart injury serum markers between the four groups (±s, n=10)

表1 4組大鼠心肌損傷標志物水平比較(±s，n=10)Tab.1 Comparison of heart injury serum markers between the four groups (±s, n=10)

REE. Exhaustive group; Sal-A. Salidroside A group; Sal-B.Salidroside B group. Same as below. CK.Creatine kinase; CK-MB.Creatine kinase isoenzyme; TnI. Troponin I. (1)P＜0.01 compared with control group; (2)P＜0.01 compared with REE group; (3)P＜0.05 compared with Sal-A group

Group CK(ng/ml) CK-MB(ng/ml) TnI(pg/ml)Control 27.23±2.11 12.07±0.35 85.13±20.33 REE 41.32±1.56(1) 14.87±0.62(1) 147.64±10.24(1)Sal-A 37.03±2.35(2) 13.68±0.33(2) 121.37±21.68(2)Sal-B 35.67±2.74(2)(3) 13.03±0.25(2)(3) 111.71±16.39(2)(3)

2.2 紅景天苷對反復(fù)力竭大鼠心肌細胞收縮及鈣瞬變的影響 在對照組細胞中，鈣瞬變的平均幅度(ΔF/F0)為2.78±0.12，且細胞收縮最大幅度百分比為9.72%±0.22%。反復(fù)力竭運動后，大鼠心肌細胞鈣瞬變及最大收縮幅度分別降低41%和45%(P＜0.01)；與REE組相比，Sal-A、Sal-B組細胞收縮和鈣瞬變的振幅均增加，細胞收縮幅度增加了25%和54%，而鈣瞬變增加了20%和38%；與Sal-A相比，Sal-B組鈣瞬變及最大收縮幅度增加更明顯(P＜0.01，圖1、2)。

圖1 各組大鼠心肌細胞收縮幅度的比較Fig.1 Comparison of contraction amplitude of myocardial cells in each group

圖2 各組大鼠心肌細胞鈣瞬變的比較Fig.2 Comparison of calcium transient in rats' myocardial cells in each group

2.3 紅景天苷對反復(fù)力竭大鼠心肌細胞鈣火花及肌質(zhì)網(wǎng)鈣容量的影響 對照組大鼠心肌細胞鈣火花的發(fā)生頻率為1.70±0.10/(100μm·s)，大鼠經(jīng)過反復(fù)力竭游泳運動后，心肌細胞的鈣火花頻率增加了1.5倍(P＜0.01)。Sal-A、Sal-B組鈣火花頻率分別為3.20±0.10、2.60±0.30/(100μm·s)，與REE組相比均明顯降低(P＜0.01)，且Sal-B組較Sal-A組降低更明顯(P＜0.01，圖3)。REE組咖啡因誘導(dǎo)的鈣瞬變，即肌質(zhì)網(wǎng)鈣庫含量(2.51%±0.10%)與對照組(3.97%±0.20%)相比明顯降低(P＜0.01)；Sal-A、Sal-B組肌質(zhì)網(wǎng)鈣庫含量(分別為3.06%±0.15%、3.30%±0.17%)與REE組相比明顯升高，且Sal-B組升高更為明顯(P＜0.01，圖4)。

圖3 各組大鼠心肌細胞舒張期鈣火花的比較Fig. 3 Comparison of calcium sparks during diastolic phase of myocardial cells in each group

圖4 各組大鼠心肌細胞肌質(zhì)網(wǎng)鈣庫含量的比較Fig. 4 Comparison of sarcoplasmic reticulum calcium pool contents of rats' myocardial cells in each group

3 討 論

早期研究認為，力竭運動引起的心臟損傷與心律失常有關(guān)，超負荷運動致心律失常一直是運動醫(yī)學(xué)、軍事醫(yī)學(xué)領(lǐng)域關(guān)注的問題。已有確切研究證據(jù)證實，力竭運動可引起竇房結(jié)功能障礙、心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)異常、折返激動等心臟病理狀態(tài)，從而導(dǎo)致竇性心律不齊、期前收縮、房顫等多種心律失常[11-14]。但近年來的研究發(fā)現(xiàn)，超負荷運動也會出現(xiàn)心力衰竭型心臟損傷[15]。心力衰竭是指心肌細胞收縮力減弱，導(dǎo)致心臟泵血功能障礙，超聲檢查提示左心室射血分數(shù)降低。心臟收縮功能的減退對力竭運動引起心臟損傷的機制提供了新的研究方向。心肌收縮力減弱的發(fā)生與心肌細胞內(nèi)Ca2+循環(huán)的異常密切相關(guān)[16]。因此深入研究心肌細胞收縮過程中的Ca2+循環(huán)對闡明力竭運動引起心衰型心臟損傷具有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，力竭組大鼠心肌細胞收縮過程中鈣瞬變峰值降低，收縮力減弱。眾所周知，在心肌細胞收縮過程中，鈣誘導(dǎo)鈣釋放(Ca2+induced Ca2+release，CICR)引起胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度瞬間明顯增加，即鈣瞬變，胞質(zhì)內(nèi)瞬時增加的高濃度Ca2+與肌鈣蛋白結(jié)合，通過肌絲滑行引起心肌收縮[17]。故鈣瞬變與心肌細胞收縮直接相關(guān)，鈣瞬變峰值的高低決定了心肌細胞收縮力的強弱。另一方面，本研究通過激光共聚焦顯微鏡線掃描成像技術(shù)記錄了心肌細胞舒張期產(chǎn)生的鈣火花頻率及肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，力竭大鼠心肌細胞舒張期鈣火花頻率增加，相應(yīng)的肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+含量減少。首先，Ca2+在舒張期通過許多局部短暫的Ca2+釋放事件漏出肌質(zhì)網(wǎng)，即所謂的“鈣火花”。過度的Ca2+由肌質(zhì)網(wǎng)漏至胞質(zhì)，可導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)的Ca2+含量降低，此外，在CICR過程中肌質(zhì)網(wǎng)為鈣瞬變提供了約92%的Ca2+[18]，故肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+含量對鈣瞬變起決定性作用。雖然肌質(zhì)網(wǎng)鈣泵(sarcoplasmicreticulum Ca2+-ATPases，SERCA2a)功能受損和鈉鈣離子交換體(Na+/Ca2+exchanger，NCX)活性增強也被認為是肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+負載降低的原因[19]，但最新研究指出，舒張期肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+通過RyR2病理性泄漏是影響心力衰竭中鈣穩(wěn)態(tài)的主要原因[20]。綜合上述結(jié)果，心肌舒張期Ca2+泄漏導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+儲備量不足，直接影響收縮期鈣瞬變的能力，使鈣瞬變峰值下降，最終導(dǎo)致心肌細胞收縮力減弱。Belevych等[21]也指出，自發(fā)性鈣火花介導(dǎo)的舒張期肌質(zhì)網(wǎng)Ca2+泄漏，對肌質(zhì)網(wǎng)鈣含量有很重要的影響。此外，Santiago等[22]在研究心力衰竭時發(fā)現(xiàn)，大鼠心肌細胞在舒張期Ca2+泄漏增多，肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+含量降低，故認為舒張期Ca2+泄漏是心肌收縮力減弱的關(guān)鍵。本實驗心肌細胞舒張期Ca2+過度泄漏導(dǎo)致心肌收縮力減弱的現(xiàn)象與其他學(xué)者對心衰動物模型鈣穩(wěn)態(tài)失衡的研究結(jié)果一致[23-24]。

隨著中藥現(xiàn)代化進程的不斷推進，越來越多的中藥及其復(fù)方被應(yīng)用于力竭心臟損傷的保護研究中。本研究發(fā)現(xiàn)，紅景天苷可抑制力竭大鼠心肌細胞舒張期過度的Ca2+以鈣火花的形式自肌質(zhì)網(wǎng)漏至胞質(zhì)，從而抑制舒張期肌質(zhì)網(wǎng)內(nèi)Ca2+含量減少，最終導(dǎo)致鈣瞬變增強，心肌收縮力增強。本研究表明，紅景天苷能改善力竭運動引起的心肌細胞收縮力減弱，其機制可能與細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的調(diào)控有關(guān)。多項研究表明，紅景天苷可通過抗炎、抗氧化應(yīng)激、抗凋亡等多種途徑對心臟損傷發(fā)揮保護作用[25-26]。Zhu等[27]研究證實，紅景天苷對急性心肌缺血和心臟缺血/再灌注損傷有良好的保護作用，可以改善心肌缺血，減少心肌缺血梗死面積。Zou等[7]指出，紅景天苷可能通過抑制舒張期肌質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)儲鈣的釋放來抑制鈣超載的發(fā)生，對細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)具有調(diào)節(jié)作用。

力竭運動作為應(yīng)激原之一，其造成的心肌損傷不僅是部隊戰(zhàn)斗力下降和非戰(zhàn)斗性減員的重要原因之一，而且是運動醫(yī)學(xué)所面臨的重大難題。因此，有必要對力竭運動導(dǎo)致的心肌損傷進行細致深入的研究，以進一步揭示內(nèi)在機制，為力竭運動應(yīng)激的防治提供新方法。紅景天苷作為中草藥，對心血管的保護具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑干預(yù)等優(yōu)勢[8,28]，本研究結(jié)果為紅景天苷改善力竭運動造成的心肌收縮力減弱提供了科學(xué)依據(jù)，為紅景天苷的臨床應(yīng)用推廣提供了參考。

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