儀器法檢測(cè)堿性磷酸酶的測(cè)量不確定度的評(píng)估

李 磊，劉 暢，李升和，寧康健，姜錦鵬

（安徽科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部豬肉質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 鳳陽 233100）

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）可以通過水解磷酸單酯，從而去掉核酸、蛋白質(zhì)、生物堿等底物分子中的磷酸基團(tuán)，同時(shí)生成自由基。ALP廣泛存在于組織與體液中，又以骨組織、肝臟、乳腺等分布濃度最高，是一組同工酶而非單一酶。當(dāng)上述組織器官出現(xiàn)病變時(shí)，ALP的活性顯著增強(qiáng)，因此，通過測(cè)量血清中的ALP值，可有效反映相關(guān)臟器組織的狀態(tài)。ALP的檢測(cè)是臨床重要的檢測(cè)項(xiàng)目，對(duì)于診斷相關(guān)臟器的病變狀態(tài)具有重要的作用。

測(cè)量不確定度作為與測(cè)量結(jié)果相聯(lián)系的重要參數(shù)，可表征被測(cè)量值的分散性，具有合理性。近年來，測(cè)量不確定度的應(yīng)用場(chǎng)景不斷增加，在越來越多的正式場(chǎng)合中替代相對(duì)偏差（SD）來表述結(jié)果的可信程度。越來越多的研究人員認(rèn)為測(cè)量結(jié)果中應(yīng)附有不確定度的說明，這樣的結(jié)果才是完整且有意義的，不確定度在一定程度上決定了測(cè)量結(jié)果的可信程度。根據(jù)ISO 15189的相關(guān)要求，承擔(dān)臨床檢測(cè)任務(wù)的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)該對(duì)臨床檢測(cè)結(jié)果的測(cè)量不確定度進(jìn)行評(píng)估。

該研究依據(jù)計(jì)量技術(shù)規(guī)范JJF 1059.1—2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》的相關(guān)要求，以ALP檢測(cè)為例，對(duì)全自動(dòng)血清生化分析儀檢測(cè)血清中ALP的檢測(cè)結(jié)果不確定度進(jìn)行評(píng)定，探討在檢測(cè)過程中測(cè)量不確定度的評(píng)定過程，熟悉測(cè)量不確定度在儀器法檢測(cè)血清學(xué)指標(biāo)中的應(yīng)用，以期找到合理的表征儀器法檢測(cè)結(jié)果不確定度的評(píng)定模式。

表1 CV內(nèi)數(shù)據(jù)結(jié)果

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

全自動(dòng)血液生化分析儀 （深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司）；ALP測(cè)定試劑盒 （批號(hào)：140317001）；常規(guī)生化復(fù)合校準(zhǔn)品 （批號(hào)：150117001，標(biāo)定濃度為212 U/L）；常規(guī)生化復(fù)合定值質(zhì)控品（批號(hào)：050217002，標(biāo)定濃度為77.8U/L）；質(zhì)控血清由筆者所在實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 測(cè)定過程

試驗(yàn)過程中，按照儀器使用說明書對(duì)儀器進(jìn)行維護(hù)和保養(yǎng)，確保儀器的性能狀態(tài)良好；以儀器使用說明書及項(xiàng)目的SOP進(jìn)行檢測(cè)，質(zhì)控規(guī)則選擇westgard多規(guī)則。

1.3 檢測(cè)方法

全自動(dòng)血液生化分析儀對(duì)于ALP測(cè)定主要采用AMP緩沖液法。該方法的檢測(cè)原理如反應(yīng)方程式所示：

磷酸對(duì)硝基酚+對(duì)硝基酚+磷酸鹽

該反應(yīng)生成的對(duì)硝基酚可引起405 nm處吸光度上升，其變化速率與ALP的活性成正比。因此，可用下式計(jì)算ALP濃度。

ΔA/min=ΔA/min樣本管/校準(zhǔn)管-ΔA/min空白管

1.4 測(cè)量不確定度來源分析

對(duì)不確定度進(jìn)行分析時(shí)，仍是從人員、設(shè)備、材料、方法及環(huán)境進(jìn)行分析。由于使用全自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備，并且根據(jù)檢測(cè)方法的原理，影響吸光度變化率值的主要因素是檢測(cè)體系中的質(zhì)控品的定值。根據(jù)儀器操作規(guī)程，上式中的樣本管可以是樣品或質(zhì)控品。最終所測(cè)得的ΔA/min不確定度由以下分量組成：①批內(nèi)精密度引入的不確定度分量CV內(nèi)；②批間精密度引入的不確定度分量CV間；③偏倚（正確度）引入的不確定度分量CVbias。其中CV內(nèi)、CV間、CVbias需要通過檢測(cè)獲取，計(jì)算公式如下：

（1）方法學(xué)偏倚帶來的不確定度：

式中▽為相對(duì)差值平均值為測(cè)定次數(shù)，ai%為測(cè)定值與已知定值的相對(duì)偏差；xi為質(zhì)控血清實(shí)驗(yàn)室測(cè)定值，xs為質(zhì)控血清的已知定值；SD為相對(duì)差值標(biāo)準(zhǔn)差

（2）合成不確定度：

（3）擴(kuò)展不確定度：U=kuc，取 95%置信水平時(shí)，k=2，U=2uc。

2 結(jié)果與分析

2.1 評(píng)定測(cè)量不確定度分量

2.1.1 CV內(nèi)測(cè)定結(jié)果：單日內(nèi)，對(duì)質(zhì)控品重復(fù)測(cè)定30次，對(duì)所得ALP質(zhì)控結(jié)果計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，其變異系數(shù)即為CV內(nèi)，具體數(shù)據(jù)結(jié)果見表1。

2.1.2 CV間測(cè)定結(jié)果：整理收集2016年1月—2017年9月期間的質(zhì)控品質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析ALP質(zhì)控結(jié)果，計(jì)算SD和CV，該CV即為CV間，結(jié)果見表2。

表2 CV間數(shù)據(jù)結(jié)果

2.1.3 CVbias測(cè)定結(jié)果：單日內(nèi)重復(fù)測(cè)定質(zhì)控樣本血清，連續(xù)測(cè)定5次，通過質(zhì)控樣本血清的已知定值來計(jì)算CVbias，具體數(shù)據(jù)結(jié)果見表3。

表3 CVbias數(shù)據(jù)結(jié)果

2.2 合成不確定度及拓展不確定度

根據(jù)上述結(jié)果得到的CV內(nèi)、CV間與CVbias，按照下式可計(jì)算出合成不確定度uc及相對(duì)拓展不確定度U：

當(dāng)置信區(qū)間為 95%時(shí)，k=2，則 U=kuc=2×5.89%=11.78%。

2.3 檢驗(yàn)結(jié)果表達(dá)

質(zhì)控樣本血清測(cè)量均值為94.83 U/L，則uc=94.83×6.12%=5.59 U/L；U=2×5.80=11.18 U/L；ALP含量測(cè)定結(jié)果：（94.83±11.18）U/L（k=2）。

3 討論

近年來，隨著實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可制度的大力推廣，不確定度的概念及應(yīng)用不斷普及，越來越多的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室及檢測(cè)人員對(duì)于不確定度的認(rèn)知更加全面，在臨床相關(guān)領(lǐng)域的應(yīng)用不斷加大。同一檢測(cè)項(xiàng)目在不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果互認(rèn)對(duì)于實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)一致化和標(biāo)準(zhǔn)化至關(guān)重要，這也是實(shí)驗(yàn)室認(rèn)可及循證檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的基本要求。

作為一項(xiàng)系統(tǒng)性的工作，檢測(cè)工作涉及多個(gè)環(huán)節(jié)[1]，檢測(cè)結(jié)果的不確定度來源廣泛，人、物、設(shè)備、方法、環(huán)境等各方面都是產(chǎn)生不確定度的因素，而這些環(huán)節(jié)產(chǎn)生的不確定度分量的大小并不一致，因此，需要對(duì)這些不確定度在分析之后進(jìn)行計(jì)算，最終形成合成不確定度[2-3]。測(cè)量不確定度的應(yīng)用對(duì)于將實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果控制在一個(gè)合理范圍內(nèi)具有重要作用[4]。通過對(duì)人員、機(jī)器、材料、方法、環(huán)境等方面進(jìn)行分析[5-8]，對(duì)檢測(cè)過程中的各環(huán)節(jié)所形成的不確定度的分量進(jìn)行確定，并計(jì)算uc及U。通過研究不確定度分量對(duì)uc貢獻(xiàn)的大小，不僅可以確定影響檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的主要因素，更可以有針對(duì)性地進(jìn)行控制并改善相關(guān)因素，實(shí)現(xiàn)檢驗(yàn)工作的持續(xù)改進(jìn)[9]，從而提高檢測(cè)質(zhì)量，保證實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)的可信度。

該研究以測(cè)量不確定度相關(guān)規(guī)范為基礎(chǔ)[10-11]，以血清中ALP含量檢測(cè)為研究指標(biāo)，對(duì)全自動(dòng)血液生化分析儀的測(cè)量不確定度進(jìn)行了研究，通過開展試驗(yàn)，計(jì)算、整理、分析、試驗(yàn)數(shù)據(jù)，確定CV內(nèi)、CV間、CVbias等指標(biāo)的不確定度大小，最終獲得uc及U，為判斷相關(guān)動(dòng)物的生理狀態(tài)以及計(jì)算其他指標(biāo)提供值得借鑒的思路。

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