巢脾多糖片處方工藝優(yōu)化及質(zhì)量分析

時菲菲，陳 倩，殷 玲

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

巢脾是由蜜蜂筑造的雙面布滿巢房的脾狀蠟質(zhì)結(jié)構(gòu)，是蜜蜂用于棲息、繁衍后代、貯存食物的場所[1-3]，經(jīng)過數(shù)代蜜蜂的繁衍生息，堆積了大量的繭衣并殘留較多蜂產(chǎn)品，使得巢脾成分變得較為復(fù)雜。蜜蜂巢脾是一種民間傳統(tǒng)動物藥，可用于治療鼻炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮膚病等多種疾病。巢脾多糖是蜜蜂巢脾中分離提取得到的多糖組分，與其他來源的多糖一樣，在機體中可參與多種生命活動，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、降血糖、降血脂、抗氧化和抗衰老等多種藥理作用[4-6]。由于多糖是一類天然產(chǎn)物，具有多種生物活性，同時無毒副作用，使得多糖越來越多地應(yīng)用于藥物和保健食品等方面，因此，對多糖的開發(fā)研究變成當今的一大研究熱點。目前，對于巢脾多糖的研究報道較少，對于巢脾多糖制劑的研究報道尚處于空白階段。該研究是在筆者所在課題組開展的巢脾多糖提取工藝研究及脫蛋白工藝研究基礎(chǔ)上[7]，通過多指標設(shè)計綜合評分法篩選優(yōu)化巢脾多糖片劑處方及工藝條件，以期開發(fā)和利用巢脾這一豐富動物藥資源，一方面為提高巢脾多糖療效提供理論基礎(chǔ)，另一方面為進一步開發(fā)利用巢脾多糖提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 藥品與儀器設(shè)備

無水磷酸氫鈣（上海恒信化學(xué)試劑有限公司，藥用級）；交聯(lián)聚維酮（安徽山河藥用輔料股份有限公司，藥用級）；PVPK30（安徽山河藥用輔料股份有限公司，藥用級）；硬脂酸鎂（江西益普生藥業(yè)有限公司，藥用級）；巢脾多糖（自提）。所用化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

JB/T 5374-1991電子天平 [梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司]；標準檢驗篩（浙江上虞市道墟張興紗篩廠）；TDP-1.5單沖壓片機 （泰州市金泰制藥機械有限公司）；CS-3脆碎度測試儀（天津創(chuàng)興電子設(shè)備有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 制備工藝：巢脾多糖片的制備工藝采用濕法制粒壓片法。取干燥后的主藥與輔料研細后分別過80目篩，按處方量稱取各成分后混勻，加入90%乙醇制軟材，過16目篩制粒，制得的顆粒置于60℃真空干燥箱中干燥，控制干顆粒水分含量低于2%，干顆粒過30目篩整粒，加入潤滑劑，混合均勻，壓片，即得。

1.2.2 輔料篩選：片劑制備需要用到填充劑、崩解劑、黏合劑及潤滑劑等輔料，而輔料種類繁多，輔料篩選首先應(yīng)考慮的因素是所用輔料不影響主藥含量的定量分析。該研究采用硫酸—苯酚法測定巢脾多糖的含量[8]。選取常用輔料，采取硫酸—苯酚法進行處理，并于490 nm波長處進行紫外吸收檢查。

1.2.3 正交試驗優(yōu)化處方及工藝：為進一步篩選確定各種輔料的使用比例，采用正交試驗優(yōu)化無水磷酸氫鈣、交聯(lián)聚維酮、PVPK30、壓片壓力等最佳用量及最佳制備工藝條件。選用L9（34）正交試驗水平表進行優(yōu)化試驗的設(shè)計，以無水磷酸氫鈣用量（A）、交聯(lián)聚維酮用量（B）、PVPK30 用量（C）、壓片壓力（D）為考查因素，每個因素設(shè)計3個水平，因素水平表見表1。以崩解時限、硬度及脆碎度為考查指標，對多糖片的制備質(zhì)量進行綜合評定。巢脾多糖片質(zhì)量評分標準見表2。

表1 L9（34）正交試驗因素水平表

表2 巢脾多糖片質(zhì)量評分標準

1.2.4 最佳工藝驗證：以正交試驗優(yōu)選出的最佳處方工藝條件，按“1.2.1”項下方法平行制備3批巢脾多糖片，分別按照《中國藥典》（2015年版）收錄的方法對崩解時限、硬度、脆碎度及片重差異進行檢查。

1.2.5 樣品含量測定

1.2.5.1 標準曲線的制備：分別精密吸取1.02 mg/mL 的葡萄糖溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 置于25 mL容量瓶中，加水補至1.0 mL，精密加入5%苯酚溶液1 mL，濃硫酸 5 mL，搖勻，靜置 10 min，以相應(yīng)的試劑為空白對照，在490 nm波長處檢測。

1.2.5.2 精密度試驗：精密稱取樣品粉末0.500 g置于100 mL容量瓶中，加純化水溶解并定容，搖勻，精密量取1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.5.1”項下方法測定吸光度，連續(xù)測定6次。

1.2.5.3 穩(wěn)定性試驗：精密稱取樣品粉末0.500 g置于100 mL容量瓶中，加純化水溶解并定容，搖勻，精密量取1 mL，置于25 mL容量瓶中，按“1.2.5.1”項下方法分別于 0、0.5、1、2、4、6、12 h 測定吸光度。

1.2.5.4 重復(fù)性試驗：平行稱取樣品粉末6份，每份0.005 g，按“1.2.5.2”項下方法處理，微孔濾膜過濾，于490 nm處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算多糖含量。

1.2.5.5 加樣回收率試驗：精密稱取樣品粉末0.500 g置于100 mL容量瓶中，加純化水定容，搖勻，平行6次精密量取該溶液1 mL，置25 mL容量瓶中，分別加入1.02 mg/mL的葡萄糖溶液0.2、0.2、0.3、0.3、0.4、0.4 mL，按“1.2.5.1”項下方法測定吸光度。

1.2.5.6 樣品含量測定：取3批巢脾多糖片樣品每批各20片，研細成粉末，精密稱取樣品粉末每批0.500 g，置100 mL容量瓶中，每批樣品平行3份，加純化水溶解定容，搖勻，精密量取1 mL，置25 mL容量瓶中定容，按“1.2.5.1”項下方法測定吸光度。

1.2.6 體外溶出度試驗：取制備好的3批巢脾多糖片樣品，按《中國藥典》（2015年版）規(guī)定的體外溶出度檢查方法的槳法進行檢查，水浴溫度控制在 （37±0.5）℃， 溶出介質(zhì)為：0.1 mol/L HCl溶液900 mL，轉(zhuǎn)速 100 r/min。 分別于 5、10、15、20、30、45 min取樣5 mL，并補充5 mL同溫度新鮮0.1 mol/L HCl溶液。樣品經(jīng)微孔濾膜過濾，按“1.2.5.6”項下方法檢查含量，計算累積溶出度，繪制體外溶出度曲線。

表3 正交試驗結(jié)果

表4 方差分析結(jié)果

2 結(jié)果與分析

2.1 輔料篩選

經(jīng)紫外吸收檢查，無水磷酸氫鈣、交聯(lián)聚維酮、PVPK30、硬脂酸鎂無紫外吸收，對巢脾多糖含量測定無影響，可用于巢脾多糖片劑的制備，以上4種輔料分別作為填充劑、崩解劑、黏合劑、潤滑劑，另外經(jīng)過預(yù)試驗選擇90%乙醇作為潤濕劑。

2.2 正交試驗

正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。由表3和表4可知，4個因素的影響大小順序依次為B＞D＞A＞C，即崩解劑用量＞壓片壓力＞填充劑用量＞黏合劑用量。最佳處方工藝條件為A3B3C1D2，即巢脾多糖22%，無水磷酸氫鈣52%，交聯(lián)聚維酮10%，15%PVPK30-90%乙醇15%，硬脂酸鎂1%，壓片壓力4.2 N。鑒于對巢脾多糖片的質(zhì)量影響程度不同，綜合評定中，崩解時限占總評的50%，硬度占30%，脆碎度占20%。

2.3 含量測定

2.3.1 標準曲線的制備：標準曲線溶液在490 nm波長處檢測，以葡萄糖溶液濃度（μg/mL）為橫坐標，吸光度（A）為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y=0.00043x+0.0164，相關(guān)系數(shù) r為 0.99921，線性關(guān)系在204～1020 μg/mL良好，符合分析要求。

2.3.2 精密度試驗：精密度試驗溶液在490 nm波長處測定吸光度，連續(xù)測定6次，以回歸曲線計算出RSD值為0.496%，說明精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗：穩(wěn)定性試驗溶液分別于0、0.5、1、2、4、6、12 h 在 490 nm 波長處測定吸光度，以回歸曲線計算出RSD值為1.40%，說明樣品在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗：重復(fù)性試驗溶液在490 nm波長處測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算多糖含量，以回歸曲線計算出RSD為0.76%，說明該測定方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗：加樣回收率試驗溶液分別在490 nm波長處測定吸光度，計算得到平均回收率為99.85%，RSD為1.60%，表明該方法有較好的加樣回收率。

2.4 最佳工藝驗證

對3批巢脾多糖片樣品進行質(zhì)量檢查，結(jié)果見表5。由表5可知，崩解時限、硬度、脆碎度及片重差異均合格，說明優(yōu)化結(jié)果較好，工藝穩(wěn)定。

表5 最佳工藝驗證試驗結(jié)果

表6 樣品累積溶出度測定結(jié)果

2.5 巢脾多糖片含量檢查

按照巢脾多糖片含量檢查方法對3批樣品進行含量檢查，結(jié)果顯示，3批樣品平均含量分別為97.9%、98.2%、97.1%。

2.6 累積溶出度

取制備的3批巢脾多糖片樣品分別按上述方法進行累積溶出度測定并記錄490 nm波長處的吸光度，計算累積溶出度，結(jié)果見表6；繪制溶出曲線，3批樣品溶出曲線見圖1。結(jié)果表明，3批樣品10 min累積溶出度均可達到90%以上。

圖1 累積溶出度曲線

3 討論

試驗前期首先對輔料進行了篩選，為避免輔料對巢脾多糖含量測定的影響[9]，對多種輔料采用硫酸—苯酚法處理，選取了對含量測定無影響的幾種輔料。該試驗中通過正交設(shè)計及綜合評分法得出最佳處方組成及工藝條件，由以上處方工藝條件制備了3批巢脾多糖片樣品，并對樣品進行質(zhì)量考查，結(jié)果均合格，說明建立的多指標綜合評分法是可行的。

由于主藥巢脾多糖黏性較大，導(dǎo)致崩解溶出較困難，因此，崩解劑的種類、用量、制粒工藝成為關(guān)鍵。近幾年國家對藥品質(zhì)量要求不斷提升，累積溶出度對于口服固體制劑愈加成為一個重要的考查指標[10]，一方面對制劑處方設(shè)計及制備工藝有良好的指導(dǎo)作用，另一方面可以模擬口服固體制劑體內(nèi)的釋藥過程。該試驗選取對含量測定無影響的交聯(lián)聚維酮作為崩解劑，采用濕法制粒工藝制備，對制備的3批樣品進行累積溶出度考查，結(jié)果表明，3批樣品10 min內(nèi)累積溶出度均達到90%以上，說明處方組成及工藝條件均合理。

我國是養(yǎng)蜂大國，每年淘汰的巢脾數(shù)量巨大，巢脾多糖片的開發(fā)可以很好地利用這一動物藥材資源，有益于產(chǎn)品的推廣應(yīng)用，提高產(chǎn)品附加值，帶來經(jīng)濟價值及社會效益，同時對促進巢脾的研究利用具有積極意義。

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