卡介苗對老年性癡呆模型小鼠學習記憶和腦內(nèi)Aβ的影響

張雨微，黃銳，張業(yè)貴，王薇，趙健

（皖南醫(yī)學院人體解剖學教研室，蕪湖 241002）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為漸進性記憶障礙、認知功能障礙、語言障礙等神經(jīng)精神癥狀。AD典型的病理特征包括腦內(nèi)神經(jīng)細胞外β-淀粉樣蛋白（Aβ）的沉積、神經(jīng)細胞內(nèi)tau蛋白過度磷酸化導致的神經(jīng)纖維纏結等[1]，其中Aβ沉積被認為是導致AD病理的首要因素，所有其他的病理特征都由于Aβ的生成和清除的不平衡所導致[2]。

卡介苗（Bacillus Calmette-Guérin, BCG）是一種減毒活菌疫苗，能有效預防結核性腦膜炎和血行播散性結核[3]。BCG也被廣泛用于非結核病的研究和治療。有文獻報道BCG可用做部分腫瘤的輔助治療，調(diào)節(jié)機體免疫系統(tǒng)[4]。同時，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變和自身免疫性病變中，如帕金森病和多發(fā)性硬化（MS），BCG 免疫也發(fā)揮有益的免疫調(diào)節(jié)作用[5]。另有文獻報道新生期接種卡介苗可以影響小鼠的行為，并伴隨突觸可塑性的加強及神經(jīng)發(fā)生的增強[6]，提示BCG作為一種非特異性免疫調(diào)節(jié)劑，能夠激活機體全身免疫系統(tǒng)。

本研究擬對C57BL/6小鼠采用D-半乳糖和亞硝酸鈉腹腔注射的方式來建立AD模型，并將其與卡介苗相結合，通過皮內(nèi)注射卡介苗，分別探究其對AD小鼠體重、行為學及腦內(nèi)Aβ的影響，為卡介苗在AD治療中的應用提供基礎。

材料與方法

1 實驗動物

12周齡的C57BL/6小鼠24只，雌雄各半，體重(18±2)g，由上海杰思捷實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2013-0006。動物飼養(yǎng)在皖南醫(yī)學院實驗動物中心，常溫、常濕飼養(yǎng)，動物自由攝取食物和飲水。

2 實驗試劑及儀器

D-半乳糖（MACKLIN 麥克林）；亞硝酸鈉（廣東光華化學廠有限公司）；Aβ酶聯(lián)免疫試劑盒（蘇州卡爾文）；小鼠抗Aβ42單克隆抗體（Invitrogen）；羊抗小鼠Alexa Fluor 555（Invitrogen）；Morris水迷宮及視頻分析系統(tǒng)（北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限公司）；DNM-9602酶標分析儀；冰凍切片機（Thermo HM 525NX）；激光共聚焦掃描顯微鏡。

3 動物分組及給藥

動物隨機分為生理鹽水對照組（NS）、AD模型組（AD）、卡介苗組（BCG），每組8只。采用文獻報道的造模方法，AD組和BCG組小鼠采用腹腔注射D-半乳糖（120mg/kg）和亞硝酸鈉（90mg/kg），NS組腹腔注射等體積生理鹽水（NS），每日1 次，連續(xù)8w。從造模開始，BCG組分別在0w、4w和8w按105CFU劑量通過皮內(nèi)注射給藥，NS組和AD組給予等體積生理鹽水。同時每4w記錄小鼠體重變化情況。

4 Morris水迷宮實驗（Morris-water Maze）

Morris水迷宮測試訓練小鼠在一個（22±2）℃恒溫、無毒白色、直徑為80cm的水池內(nèi)尋找到水下的隱藏平臺。實驗持續(xù)5d，包括定位航行（place navigation）和空間探索（spatial probe）兩個部分[7]。①定位航行階段：第1～4d測試時將隱藏平臺放在第一象限，小鼠分別從4個象限面朝池壁放入水池。當小鼠找到平臺并在平臺上保持1s后，系統(tǒng)自動停止記錄為逃避潛伏期。如果超過60s未找到平臺，則按照60s計算，同時將小鼠手動放置在平臺上學習30s。②空間探索階段：第5d撤除隱藏平臺，小鼠從之前放置平臺的對側(cè)象限面朝池壁放入水中，在沒有平臺的水迷宮設備中尋找記憶中的平臺，游泳時間為60s。統(tǒng)計小鼠穿過平臺原先位點的次數(shù)、目標象限的游泳時間和路程占總時間和總路程的百分比。

5 小鼠腦內(nèi)Aβ蛋白的ELISA檢測

行為學實驗結束后第2d，小鼠深度麻醉后通過心臟直接用冷生理鹽水灌注，取半腦提取蛋白組織檢測Aβ水平[8]。采用ELISA試劑盒對Aβ蛋白進行檢測，主要步驟為：加入被檢樣品200μL/孔，37℃水浴2h，PBST洗滌3次，拍干后加入羊抗小鼠IgG HRP，37℃水浴1h，再用PBST洗滌拍干，加入TMB顯色液，避光10～15min，加入終止液，30min內(nèi)用酶聯(lián)免疫檢測儀記錄在490nm波長讀數(shù)觀察結果，并根據(jù)標準曲線計算出對應的濃度。

6 免疫熒光染色

通過冷生理鹽水灌注后的小鼠取半腦浸泡在4%的多聚甲醛中充分固定，依次浸泡于10%、20%、30%梯度濃度的蔗糖溶液中平衡后放置于冰凍切片機，自冠狀面切成40μm厚的漂片[9]。將選好的腦片用0.01mol/L PBS漂洗3次，用含0.25% Triton X-100的1% BSA于37℃水浴封閉30min，用小鼠抗Aβ42單克隆抗體（1∶400）孵育2h后4℃過夜，PBS漂洗3次后用羊抗小鼠Alexa Fluor 555（1∶400）孵育2h，再漂洗3次，將腦片裱于防脫載玻片上，用甘油/PBS（1∶1）封片劑封片，激光共聚焦掃描顯微鏡觀察、拍照[10]。

7 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)進行雙盲統(tǒng)計分析，采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行分析處理。數(shù)據(jù)通過單因素方差分析進行統(tǒng)計，所有結果都表示為±s，P＜ 0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 卡介苗處理改善阿爾茨海默病模型小鼠體重

每4周記錄各組小鼠體重變化情況，結果顯示，與NS組小鼠相比，AD組在給藥4w后增重較少，而經(jīng)過BCG處理的小鼠，體重增重顯著高于AD組（表1）。

表1 三組小鼠體重（g）比較Tab.1 Comparison of mouse body weight (g) among three experimental groups

2 BCG處理改善阿爾茨海默病模型小鼠學習記憶功能

在定位航行實驗中，各組小鼠隨著訓練天數(shù)增加，逃避潛伏期逐漸縮短。在第3、4d，AD組小鼠的逃避潛伏期較NS組顯著延長，而BCG組小鼠逃避潛伏期較AD組顯著縮短（圖1A）。在第5d的空間探索實驗中，AD組小鼠在目標象限游泳的時間和路程的百分比顯著低于對照組，而BCG的處理改善了這種情況（圖1B），顯著優(yōu)于AD組；同時，小鼠第5d穿虛擬平臺次數(shù)也呈現(xiàn)出一致的結果（圖1C）。這些結果提示通過BCG的處理，能改善的AD小鼠的認知功能，緩解疾病進程。

圖1 三組小鼠學習記憶能力的水迷宮檢測比較。A，定位航行階段逃避潛伏期；B，空間探索階段目標象限時間和路程的百分比；C，空間探索階段小鼠穿虛擬平臺的次數(shù)；*與NS對照組比較，0.01＜P＜0.05；#，與AD組比較，0.01＜P＜0.05Fig.1 Comparison of Morris water maze test results among three experimental groups.A, escape latency of location and navigation; B, percentage of time and total path length spent in target quadrant; C, number of crossing virtual platform.*, 0.01＜P＜0.05, compared with control group; #,0.01＜P＜0.05, compared with AD group

3 BCG處理降低阿爾茨海默病模型小鼠腦內(nèi)Aβ水平和斑塊沉積

通過ELISA和免疫熒光染色分別檢測小鼠腦內(nèi)Aβ蛋白和斑塊含量顯示，在NS對照組小鼠腦內(nèi)未檢測到Aβ蛋白，AD模型小鼠腦內(nèi)可檢測到高水平Aβ蛋白和斑塊的沉積，而經(jīng)BCG處理后的AD模型小鼠腦內(nèi)Aβ含量顯著下降（表2），海馬和皮質(zhì)區(qū)域Aβ斑塊的沉積也減少（圖2）。

表2 三組小鼠腦內(nèi)Aβ蛋白含量比較Tab.2 Comparison of brain Aβ content among three experimental groups

討 論

阿爾茲海默癥是一組病因未明的退行性腦變性疾病，其腦內(nèi)最主要的兩大病理特征是細胞外多種形式的Aβ蛋白斑塊沉積和細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結（NTFs），以及過度磷酸化的tau蛋白，其中Aβ為AD的早期關鍵性的發(fā)病原理[2]。

D-半乳糖是一種二醛糖，在醛糖還原酶的作用下生成半乳糖醇和H2O2。過量的氧自由基在動物體內(nèi)可與細胞中的脂質(zhì)、蛋白和核酸產(chǎn)生非酶糖基化、氧化應激-自由基損傷作用等一系列病理改變。研究表明[11]，小鼠持續(xù)腹腔注射D-半乳糖和亞硝酸鈉后，可出現(xiàn)明顯認知障礙。因此，本研究采用D-半乳糖和亞硝酸鈉處理C57BL/6小鼠，以制備老年性癡呆模型小鼠。

卡介苗（BCG）是一種減毒活菌疫苗。有文獻報道，BCG除被廣泛用于預防結核病外，還可以用于非結核病的研究和治療當中，如部分惡性腫瘤和CNS退行性病變等[4]。另一方面，有研究表明新生期接種卡介苗可以提高小鼠的認知功能，并伴隨突觸可塑性的加強及神經(jīng)發(fā)生的增加[6]。這促使我們進一步探究，給老年性癡呆模型的小鼠接種BCG對AD病理的改變及行為的影響。

在本研究中，C57BL/6小鼠經(jīng)D-半乳糖和亞硝酸鈉連續(xù)處理8w后，與對照組小鼠相比，表現(xiàn)出明顯的體重增加緩慢、認知功能下降，同時腦內(nèi)可檢測到Aβ斑塊的沉積。經(jīng)過BCG多次處理后，這些病理變化得到了顯著的改善。表現(xiàn)為BCG處理組的小鼠體重增幅接近對照組小鼠，而其在水迷宮實驗中的定位航行階段比AD組小鼠表現(xiàn)出較短的逃避潛伏期，空間探索階段在目標象限的游泳時間和距離的百分比均顯著高于AD組，穿平臺次數(shù)也顯著上升，反映出其學習記憶功能得到改善，同時，BCG處理后的AD小鼠腦內(nèi)的Aβ蛋白和斑塊含量顯著下降。

研究發(fā)現(xiàn)，AD患者在70歲以后體重下降的速度要遠高于其它同齡人，而這項發(fā)現(xiàn)與之前的一系列研究提供了豐富的證據(jù)[12]，證明體重檢測管理在AD患者的治療過程中具有非常重要的意義。在分析了大量癡呆患者的BMI指數(shù)后，研究人員發(fā)現(xiàn)，攜帶癡呆相關基因APOEε4變異基因的人群70歲以后BMI的下降速度會明顯提高，即在中老年階段，體重過輕者的癡呆發(fā)生風險增高，而體重是一項十分容易檢測的身體指標[13]。在本研究中，我們持續(xù)監(jiān)控各組小鼠體重的變化情況，發(fā)現(xiàn)連續(xù)注射D-半乳糖和亞硝酸鈉的AD模型組小鼠體重增幅較生理鹽水處理組小鼠緩慢，而經(jīng)過卡介苗處理后，其體重增幅顯著升高。這反映了AD組小鼠癡呆風險較高，經(jīng)卡介苗處理可降低這種風險程度。

圖2 免疫熒光檢測BCG處理的AD模型小鼠腦內(nèi)海馬和皮質(zhì)的Aβ斑塊。比例尺，100μmFig.2 Immunofluorescent detection of Aβ plaques in hippocampus and cortex of AD mice with or without BCG treatment.Scale bar, 100μm

Morris水迷宮（MWM）用于檢測嚙齒類動物開放視覺末梢的海馬依賴性空間學習和記憶能力，研究與空間學習記憶相關的腦區(qū)功能評價，在AD研究中的應用非常普遍[14]。測試程序主要包括定位航行試驗和空間探索試驗兩個部分。其中定位航行試驗反映了小鼠的學習能力，空間探索試驗反映了小鼠的記憶能力。結果顯示，AD組在定位航行階段的逃避潛伏期長于對照組，而BCG處理組顯著縮短了這一差距，表明BCG可以改善AD小鼠的學習能力。同時，在空間探索階段，BCG處理的AD小鼠在目標象限游泳的時間和路程的百分比也顯著上升，改善了AD小鼠的記憶能力。這說明BCG可以提高老年癡呆型小鼠的認知功能。

Aβ是大腦皮質(zhì)老年斑的主要成分，可溶性二聚體可以有效削弱突觸結構和功能，是最小的突觸毒性物質(zhì)，也是引起AD的重要物質(zhì)[15]。Aβ42聚集形成難溶的低聚物，在神經(jīng)元間隙沉積，構成老年斑。Aβ纖維，可促使細胞外自由基生成，破壞細胞膜功能，損傷細胞器、細胞膜和細胞骨架，引起細胞凋亡，進而引起AD患者的認知障礙等[16]?！癆β級聯(lián)假說”認為，Aβ在AD發(fā)病過程中發(fā)揮核心作用，是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，引起一系列神經(jīng)毒性反應，導致神經(jīng)細胞功能紊亂和死亡，從而引發(fā)癡呆[17]。因此，對AD小鼠腦內(nèi)毒性蛋白Aβ的清除成為改善老年性癡呆進程的重要途徑。在本研究中，我們檢測了小鼠海馬和皮質(zhì)區(qū)的Aβ蛋白，同時用免疫熒光對腦內(nèi)Aβ斑塊進行染色，結果顯示，經(jīng)過BCG處理后的AD小鼠腦內(nèi)Aβ蛋白和斑塊的含量均顯著下降，因而抑制了其神經(jīng)毒性，其可能是通過抑制Aβ的生成或增強Aβ的清除的途徑，減緩AD小鼠的病理改變進程。

綜合以上結果，我們認為BCG非特異性地刺激了AD小鼠機體的免疫系統(tǒng)，進而與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生作用，誘導了AD小鼠腦內(nèi)Aβ的清除，緩解了其腦內(nèi)的神經(jīng)毒性和AD的發(fā)病進程，致使神經(jīng)系統(tǒng)功能得到恢復，認知功能得到改善，并使AD小鼠的體征指標趨于正常對照組。這促使我們在下一步的研究工作中進一步探究其可能發(fā)揮的機制，包括神經(jīng)細胞等結構的變化情況及在信號通路上蛋白的改變[18]，為AD更加安全、有效的免疫治療提供實驗依據(jù)和理論基礎。

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