改良乙酰膽堿酯酶染色在快速病理診斷先天性巨結腸中的應用

董愉，楊詩聰，吳惠群，梁英杰

（中山大學附屬第一醫(yī)院病理科，廣州 510080）

先天性巨結腸是小兒外科常見病, 發(fā)病率在小兒消化道先天性畸形中位居第2位[1]。臨床診斷先天性巨結腸 ( Hirschsprung’s disease , HD)主要以病理診斷為依據，而手術中快速活體組織病理學檢查對HD的正確診斷率不是很理想[2]。HD直腸黏膜固有層腺體之間有增生的膽堿能纖維，乙酰膽堿酯酶染色可以將這些增生的膽堿能纖維顯示出來。因此，對直腸黏膜組織乙酰膽堿酯酶染色是HD病理診斷的主要檢查方法。本文對乙酰膽堿酯酶組織化學染色方法進行探討和改良，即將底物碘化乙酰硫代膽堿的濃度增加10倍，高濃度的底物加快滲透組織，縮短孵育染色時間, 使操作更加快速和簡單，便于手術中HD的快速病理診斷，為手術治療HD提供可靠的依據。

材料與方法

1 材料

臨床送檢直腸黏膜新鮮組織，OCT包埋劑包埋，用低溫恒冷切片機進行冰凍切片，厚度為6～8μm。陽性對照為大鼠舌肌6～8μm的冰凍切片。

2 試劑

30% H2O2水溶液，4℃保存；底物儲備液：先用1ml蒸餾水溶解碘化乙酰硫代膽堿50mg，然后依次加入0.1mol/L醋酸鹽緩沖液（pH5.5）6ml，2.9%枸櫞酸鈉水溶液1ml，0.75%硫酸銅水溶液1ml，0.28%四異丙基焦磷酰胺0.1ml，混合后放-20℃保存；0.17%鐵氰化鉀水溶液，4℃保存；孵育液：底物儲備液9ml加0.17%鐵氰化鉀水溶液1ml，使用前混合，37℃預熱；DAB溶液：DAB和含H2O2的緩沖液，4℃保存，用前1∶100稀釋。

3 染色方法

以傳統(tǒng)的亞鐵氰化銅法[3]為基礎并進行改良：①將直腸黏膜冰凍切片和陽性對照片放入預熱37℃的30% H2O2水溶液3min，蒸餾水稍洗；②入預熱37℃的孵育液孵育10～15min，蒸餾水稍洗；③滴加DAB溶液0.5min, DAB與孵育后形成的反應物結合,使反應產物顏色更深, 更穩(wěn)定而不容易褪色。蒸餾水稍洗；④Mayer’s蘇木精液復染細胞核0.5min，蒸餾水稍洗；⑤促藍液返藍0.1min，蒸餾水稍洗；⑥常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。另一組相同組織的連續(xù)切片按傳統(tǒng)的亞鐵氰化銅法進行染色。

結 果

1 改良法與傳統(tǒng)方法主要實驗步驟及時間的比較

與傳統(tǒng)方法比較，改良法多了H2O2處理的步驟，但孵育時間從60～120min縮短至10～15min，大大縮短了整個染色操作時間（表1）

2 改良法與傳統(tǒng)方法檢測結果的比較

表1 改良法與傳統(tǒng)方法主要實驗步驟及時間的比較Tab.1 Comparison of modified and conventional Karnovsky Roots methods on the main experimental procedure and time

先天性巨結腸癥的直腸黏膜固有層腺體之間可見增生的膽堿能纖維，乙酰膽堿酯酶陽性呈棕黑色；對照組織大鼠舌肌上的運動終板乙酰膽堿酯酶陽性，為棕黑色橢圓形或扁平小圓。正常直腸黏膜固有層腺體之間沒有增生的膽堿能纖維，乙酰膽堿酯酶染色為陰性。本改良法與傳統(tǒng)的亞鐵氰化銅法相比較染色特異性無明顯差異，傳統(tǒng)染色方法乙酰膽堿酯酶陽性呈棕色至深棕色（圖1）。

討 論

乙酰膽堿酯酶存在于膽堿能神經纖維，因此，乙酰膽堿酯酶組織化學染色是顯示膽堿能神經纖維常用而可靠的方法。手術中直腸組織冰凍切片HE染色常常難以診斷先天性巨結腸，但通過乙酰膽堿酯酶染色，在冰凍切片直腸黏膜的固有層中顯示出增生的膽堿能神經纖維即可作出診斷。Nakao 等學者對91例新生兒中乙酰膽堿酯酶染色診斷HD進行評價,特異性為100% ,敏感性為91%[4]。

乙酰膽堿酯酶組織化學染色常用的方法是亞鐵氰化銅法。傳統(tǒng)的亞鐵氰化銅染色方法，配制孵育液染色所需的各種試劑在4℃冰箱保存，染色前需要稱取底物，溶解底物后再將各種試劑依次混合配成孵育液，孵育液在配制和從4℃預熱到37℃都需要一定的時間。為了達到快速染色的目的，改良的方法是先分別配制好底物儲備液和鐵氰化鉀水溶液低溫保存，標本送檢前即可以將一次染色用量的底物儲備液和鐵氰化鉀水溶液分別在37℃恒溫箱預熱，染色前兩種試劑混合即馬上可以孵育組織切片。由于底物碘化乙酰硫代膽堿對組織的滲透性較差，傳統(tǒng)方法孵育液孵育組織切片時間較長，為60～120min。改良法將底物碘化乙酰硫代膽堿的濃度增加10倍，高濃度的底物可以加快滲透組織，孵育染色時間從60～ 120min縮短至10～15min。配制孵育液前先分別配制底物儲備液和鐵氰化鉀水溶液，是避免銅離子和鐵氰化鉀起反應形成沉淀物，降低銅離子的濃度而影響染色。

圖1.乙酰膽堿酯酶染色改良法與傳統(tǒng)法的比較。A，傳統(tǒng)法染色，先天性巨結腸癥；B，改良法染色，先天性巨結腸癥；C，改良法染色，陰性對照； D，改良法染色,陽性對照，箭，乙酰膽堿酯酶陽性；比例尺，50μmFig.1 Comparison of Modified method and conventional method on acetylcholinesterase histochemical staining.A, staining of Hirschsprung’s disease tissue using conventional method; B, staining of Hirschsprung’s disease tissue using modified method; C,modified method staining of negative control tissue; D, modified method staining of positive control tissue.Arrows pointed to acetylcholinesterase positive stain; scale bar, 50μm

乙酰膽堿酯酶陽性顯色是染色過程中，組織化學反應最終形成棕色的亞鐵氰化銅沉淀，但亞鐵氰化銅沉淀并非絕對不溶[5]。因此在孵育染色后用DAB（二氨基聯(lián)苯胺）處理, 目的是使陽性產物更加穩(wěn)定，顏色由棕色加深為棕黑色，不容易退色，更易于觀察。DAB為致癌物[6]，應避免接觸皮膚。孵育前都要用H2O2水溶液封閉組織細胞內的內源性過氧化物酶，防止非特異性染色。實際上內源性過氧化物酶對觀察膽堿能神經纖維的干擾很少，在操作過程中可以省去H2O2水溶液封閉這一步，節(jié)省操作時間。

在乙酰膽堿酯酶染色過程中，醋酸鹽緩沖液pH的變化，各種試劑配制和保存是否得當等多種因素都可以影響染色的結果。因此，每次染色都應該設有陽性和陰性對照片，防止假陽性和假陰性。乙酰膽堿酯酶主要存在于神經與肌肉接頭處[7]，因此常用大鼠舌肌組織作為陽性對照，用正?；蚍荋D的直腸黏膜冰凍切片作陰性對照?？深A先切取多張冰凍切片對照片放在-20℃冰箱保存。

經常規(guī)甲醛固定、脫水，石蠟包埋的組織，其中乙酰膽堿酯酶的活性全部消失，因此乙酰膽堿酯酶染色只能用新鮮組織的冰凍切片。直腸黏膜在取材切片時，應對直腸黏膜進行豎立包埋，切取黏膜腺體的橫切面，這樣可以更好地觀察在直腸黏膜固有層腺體之間乙酰膽堿酯酶陽性的神經纖維。應用免疫組化技術也能進行先天性巨結腸癥的病理診斷[8-10],但免疫組化染色需要1h以上，耗時長。

本改良法使乙酰膽堿酯酶染色操作更加快速和簡單，結果穩(wěn)定可靠，提供更快的手術中HD的病理診斷，對臨床醫(yī)生制定HD的治療方案具有十分重要的意義。

[1]王果，李振東.小兒肛腸外科學.鄭州：中原農民出版社，1999：469-470.

[2]Maia DM.The reliability of frozen section diagnosis in the pathologic evaluation of Hirschsprung’s disease.Am J Surg,2000, 24 (12)∶ 1675-1677.

[3]梁英杰，凌啟波，張威.臨床病理學技術.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：257.

[4]Nakao M, Suita S, Taguchi T, et al.Fourteen-year experience of acetylcholinesterase staining for rectal mucosal biopsy in neonatal Hirschsprung’s disease.J Pediatr Surg, 2001, 36∶1357-1363.

[5]陳嘯梅，周文郁，彭俊云，等.組織化學手冊.北京：人民衛(wèi)生出版社，1982：133.

[6]陳紅杏，封蘇平，黃蘭仙，等.病理科職業(yè)安全隱患分析與對策.中國公共衛(wèi)生管理，2013，29（5）：663.

[7]凌啟波.實用病理特殊染色和組化技術.廣東：廣東高等教育出版社，1989：289.

[8]殷敏智，張忠德，沈萍.免疫組織化學方法在先天性巨結腸診斷中的應用.實用兒科臨床雜志，2005，20（11）：1159.

[9]劉虎，徐兵.新生兒巨結腸診斷的現(xiàn)狀與進展.醫(yī)學綜述，2010，16（16）：2434.

[10]朱偉雄，李雪清，嚴麗霞.神經標記物在先天性巨結腸中的表達.實用醫(yī)學雜志，2014，30（13）：2316.