羅紅霉素抑制COPD大鼠炎性介質(zhì)釋放對(duì)糖皮質(zhì)激素抵抗的影響

張 松,黃 茂

0 引言

慢性阻塞性肺疾病(Chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種以呼吸道氣流受限為主要特征的肺部疾病，其病死率及死亡率均較高，且呈逐年上升趨勢[1-2]。COPD本質(zhì)上屬于氣道慢性炎癥性疾病，故治療以抗炎為主。糖皮質(zhì)激素抗炎作用強(qiáng)大，在COPD治療中有著廣泛應(yīng)用。然而，臨床觀察顯示，部分患者即便采取大劑量糖皮質(zhì)激素治療，效果也極不明顯，提示患者體內(nèi)可能存在某種機(jī)制，引起機(jī)體對(duì)糖皮質(zhì)激素的敏感性降低，即為糖皮質(zhì)激素抵抗[3-5]。糖皮質(zhì)激素與糖皮質(zhì)激素受體(Glucocorticoid receptor，GR)結(jié)合后方發(fā)揮抗炎作用，近年研究發(fā)現(xiàn)，GRα型受體是糖皮質(zhì)激素發(fā)揮效應(yīng)的主要受體，而GRβ型受體則是內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素效應(yīng)的拮抗因子，激素抵抗型哮喘患者GRα表達(dá)下調(diào)、GRβ上調(diào)，因此，推測 GRα/GRβ失衡是造成COPD患者糖皮質(zhì)激素抵抗的重要原因[6-7]。羅紅霉素是新一代的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，臨床公認(rèn)其在COPD治療中可發(fā)揮良好的抗炎作用，然而關(guān)于其是否能夠逆轉(zhuǎn)糖皮質(zhì)激素抵抗，國內(nèi)尚未見相關(guān)報(bào)道[8]。本研究旨在探討羅紅霉素抑制COPD大鼠炎性介質(zhì)釋放對(duì)糖皮質(zhì)激素抵抗的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性裸大鼠40只，體重18～22 g，月齡4～6個(gè)月，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，動(dòng)物編號(hào)：SCXK(滬)2015-0002；飼養(yǎng)于我院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室SPF環(huán)境中，溫度(24±2)℃，濕度30%～60%，常規(guī)自由飲食，每天日照12 h，通風(fēng)良好。實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方式符合動(dòng)物倫理要求。

1.2 藥物與試劑 羅紅霉素(江蘇云陽集團(tuán)藥業(yè)有限公司)，ELISA檢測試劑盒(武漢轉(zhuǎn)導(dǎo)生物實(shí)驗(yàn)室)，兔抗大鼠GRα多克隆抗體、GRβ多克隆抗體(北京維亞生物技術(shù)有限公司)，RT-PCR試劑盒[賽默飛世爾科技(中國)有限公司]，GRα、GRβ引物(北京博大泰克公司)，通用型SP免疫組化試劑盒(上海信裕生物科技有限公司)，DAB顯色試劑盒(上海威奧生物科技有限公司)，蘇木精(美國Sigma-Aldrich公司)，伊紅(上海撫生生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 試驗(yàn)分組 飼養(yǎng)1周后，選取30只環(huán)境適應(yīng)良好的大鼠，對(duì)大鼠進(jìn)行編號(hào)，并采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組，即空白組、模型組、羅紅霉素組，每組10只。

1.3.2 建立模型 模型組與羅紅霉素組：分別于第1、31、61天由氣管灌注0.2 ml 1.0 g/L的脂多糖溶液，并于2～30 d、32～60 d、62～90 d等3個(gè)時(shí)間段內(nèi)將大鼠置于60 L玻璃熏咽箱中被動(dòng)吸煙，6 h/d。空白組：不予以建模(以0.2 ml生理鹽水與新鮮空氣處理)。

1.3.3 干預(yù) 模型組：由第91天起予以生理鹽水灌胃，2 ml/次，1次/d，連續(xù)30 d。羅紅霉素組：由第91天起予以羅紅霉素灌胃，劑量為30 mg/kg，1次/d，連續(xù)30 d?？瞻捉M正常飼養(yǎng)，不予處理。30 d后，行大鼠解剖處理，采集大鼠腹主動(dòng)脈血2 ml，靜置、離心取血清；分離大鼠右肺前葉，留取肺組織。

1.3.4 炎癥因子檢測 采用ELISA試劑盒檢測血清白細(xì)胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒進(jìn)行操作。

1.3.5 肺組織觀察 取適量肺組織，經(jīng)固定、包埋、切片等處理，并予以HE染色后，采用光學(xué)顯微鏡觀察大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)變化。

1.3.6 肺組織GRα、GRβ mRNA表達(dá)水平測定 采用RT-PCR法進(jìn)行檢測。取肺組織，適當(dāng)研磨，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。GRα上游引物、下游引物分別為5′-TCCAAAGCCGTTTCACTG-3′、5′-CAAGAGGTCAAAGGTGCT-3′；GRβ上游引物、下游引物分別為5′-TGGTTTCCTGTTCGCTCT-3′、5′-TGGTTTCCTGTTCGCTCT-3′；GAPDH上游引物、下游引物分別為5′-GTTCAACGGCACAGTCAA-3′、5′-CAGATCCACAA

CGGATACA-3′；GRα、GRβ、GAPDH擴(kuò)增片段為348、266、571 bp。PCR擴(kuò)增：取反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 ml，上游引物1 μl，下游引物1 μl，10×Easy Tag Buffer(含Mg2+)5 μl，dNTPs 4 μl，Easy Tag DNA Polymerase 0.5 μl，加ddH2O至50 μl。擴(kuò)增完成后行瓊脂糖凝膠電泳，經(jīng)EB染色，紫外線投射儀下對(duì)電泳條帶進(jìn)行觀察。GRα、GRβ mRNA表達(dá)水平以目的條帶與GAPDH灰度值之比進(jìn)行描述。

1.3.7 肺組織GRα、GRβ蛋白表達(dá)水平測定 取肺組織，加入組織蛋白裂解液，裂解后采集上清液，采用Brad-ford法進(jìn)行測定。取蛋白樣品，依次行制膠、上樣、電泳分離、脫水等處理。分別加兔抗大鼠GRα多克隆抗體、GRβ多克隆抗體、二抗進(jìn)行孵育，三種抗體稀釋比例分別為1∶1 000、1∶1 000、1∶4 000。ECL發(fā)光，經(jīng)凝膠成像儀進(jìn)行成像，直至膠片透明，掃描后，采用Bandscan5.0軟件分析灰度。

2 結(jié)果

2.1 三組肺組織病理形態(tài)學(xué)特征 空白組：支氣管黏膜上皮細(xì)胞完整，無明顯炎性細(xì)胞浸潤，肺泡結(jié)構(gòu)連續(xù)、緊湊，肺泡壁完整，肺泡腔正常、未見擴(kuò)大，且無明顯炎性細(xì)胞滲出(圖1A)。模型組：支氣管黏膜上皮細(xì)胞有明顯脫落，管壁存在大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁顯著變薄，肺泡明顯擴(kuò)張，管腔聚集有大量炎性滲出物(圖1B)。羅紅霉素組：支氣管黏膜上皮細(xì)胞有少許脫落，管壁有少量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡輕度擴(kuò)張，管腔內(nèi)存在少量炎性滲出物(圖1C)。

2.2 組間血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平比較 與空白組比較，模型組血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，羅紅霉素組血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明顯降低(P<0.05)。見表1。

2.3 組間肺組織GRα、GRβ mRNA及蛋白水平比較 與空白組比較，模型組肺組織GRα mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，GRβ mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)。與模型組比較，羅紅霉素組GRα mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，GRβ mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表2。

3 討論

COPD為一種以氣流受限為特征的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，發(fā)病率及死亡率均較高，嚴(yán)重威脅人類健康[9]。被動(dòng)吸煙是建立COPD模型的常用方法[10]，維持30周以上的被動(dòng)吸煙便可實(shí)現(xiàn)COPD模型成功建立，但為減少實(shí)驗(yàn)等待時(shí)間，節(jié)省實(shí)驗(yàn)費(fèi)用，目前常在被動(dòng)吸煙基礎(chǔ)上聯(lián)用其他方法進(jìn)行建模[11-12]。本研究采用被動(dòng)吸煙聯(lián)合氣管灌注脂多糖的方式進(jìn)行COPD大鼠模型的建立，結(jié)果顯示，以空白組為對(duì)照，模型組支氣管黏膜上皮細(xì)胞有明顯脫落，管壁存在大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡壁顯著變薄，肺泡明顯擴(kuò)張，管腔聚集有大量炎性滲出物，且模型組大鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)特征與人類COPD的病理形態(tài)學(xué)改變相符，提示建模成功。呼吸道慢性炎癥是COPD發(fā)生的核心機(jī)制[13]。IL-8是細(xì)胞趨化因子家族的重要成員，在中性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞聚集和活化中發(fā)揮著重要作用；TNF-α是重要促炎因子，可刺激巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞釋放大量炎性因子；MCP-1參與巨噬細(xì)胞的聚集和活化，增加炎性細(xì)胞浸潤。上述3種炎性介質(zhì)均被證實(shí)參與了COPD的發(fā)生發(fā)展，與患者預(yù)后密切相關(guān)[14-16]。本研究中，與空白組比較，模型組血清TNF-α表達(dá)明顯增高，肺組織GRα mRNA及蛋白表達(dá)降低，肺組織GRβmRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，驗(yàn)證了GRα/GRβ失衡是COPD發(fā)生的重要機(jī)制。

圖1 三組大鼠肺組織HE染色(400×)

組別只數(shù)IL-8TNF-αMCP-1空白組10153.54±18.69139.12±18.24113.47±16.72模型組10258.98±27.43*244.69±35.61*244.56±29.41*羅紅霉素組10196.84±21.54#182.36±27.13#152.46±23.26#

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

表2 組間肺組織GRα、GRβ mRNA及蛋白水平比較

注：與空白組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

糖皮質(zhì)激素是治療COPD最有效的抗炎藥物，但對(duì)部分患者療效較差。研究認(rèn)為，吸煙哮喘患者存在顯著的糖皮質(zhì)激素抵抗，其治療藥物選擇是臨床面臨的棘手問題[17]。大環(huán)內(nèi)酯類抗生素除可發(fā)揮抗感染作用外，還具有良好的抗炎作用，因此，該類抗生素在多種炎癥性疾病的治療上有著廣泛應(yīng)用[18-19]。研究表明，長期應(yīng)用羅紅霉素可改善COPD患者的臨床癥狀，改善患者生活質(zhì)量[20]。另有研究顯示，羅紅霉素治療急性加重期COPD，能夠明顯降低患者血清IL-8、TNF-α等炎性介質(zhì)表達(dá)水平[21]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，羅紅霉素組血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平明顯降低，證實(shí)了羅紅霉素的抗炎作用。本研究還顯示，與模型組比較，羅紅霉素組GRα mRNA及蛋白表達(dá)明顯升高，GRβ mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低，表明羅紅霉素對(duì)糖皮質(zhì)激素抵抗有改善作用。

綜上所述，羅紅霉素能夠抑制IL-8、TNF-α、MCP-1等炎性介質(zhì)釋放，調(diào)節(jié)GRα/GRβ平衡，對(duì)逆轉(zhuǎn)COPD大鼠糖皮質(zhì)激素抵抗有積極作用，值得深入研究。

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