蘋果中福美胂殘留的RP-HPLC檢測

牛鵬飛， 申 遠， 李 帥, 郭玉蓉

(陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院， 陜西 西安 710062)

福美胂是一種二硫代氨基甲酸酯類殺菌劑，化學(xué)名稱為三-N-二甲基二硫代氨基甲酸胂。其抗菌性強并且具有持效期長,在樹皮死組織部位滲透力強的特點，對多種農(nóng)作物的多種病害均有防治效果，尤其對蘋果腐爛病有較好的防治作用[1-2]，因此曾有過比較廣泛的使用，尤其是在北方果樹生產(chǎn)上有廣泛應(yīng)用[2]。福美胂為中等毒性，可通過呼吸道、胃腸道和皮膚吸收，排泄出體外的過程長，還會在體內(nèi)轉(zhuǎn)化成毒性可能更大的無機三價砷及其衍生物，產(chǎn)生無機砷中毒癥狀，對皮膚、粘膜亦有刺激作用，一旦發(fā)生福美胂中毒，其診斷、治療均較困難[3]。由于在果園中使用福美胂，造成果樹、環(huán)境甚至生態(tài)系統(tǒng)嚴(yán)重污染[4-5]，因此早在2007年以前，中國就已禁止砷制劑在果樹生產(chǎn)中的使用[6]。但在2012年，有媒體報道，在中國某蘋果主產(chǎn)區(qū)，一種無任何標(biāo)志、小作坊式生產(chǎn)的藥袋被部分果農(nóng)使用，這種藥袋內(nèi)部涂布福美胂和退菌特，并包裹在幼果上直至其成熟,而對于蘋果中是否確實存在福美胂和退菌特，國內(nèi)多家檢測機構(gòu)都表示無法檢測。中國作為世界上最大的水果、蔬菜生產(chǎn)國和主要的出口國[7],中國蘋果的出口對全球蘋果市場影響巨大[8]，“藥袋”事件對中國蘋果產(chǎn)業(yè)產(chǎn)生的國際負面影響不容忽視。福美胂作為“藥袋事件”的元兇之一，理應(yīng)受到嚴(yán)格的監(jiān)管。但目前國際上福美胂的藥物殘留檢測尚屬空白，因此福美胂殘留檢測方法的建立，尤其是確定蘋果中福美胂殘留的檢測方法成為保證蘋果產(chǎn)業(yè)安全的首要任務(wù)。國際上，二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測方法有GC法[9]、GC-MS法[10]、HPLC-MS法[11-13]、酶聯(lián)免疫吸附劑測定法[14]以及衍生化結(jié)合HPLC法[15]，但上述方法均未涉及福美胂的檢測。在國內(nèi)，二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測多采用測定CS2含量的間接方法，即檢測二硫代氨基甲酸根酸性水解釋放出的CS2量[16]。但因二硫代氨基甲酸酯類農(nóng)藥種類很多，酸性水解都會產(chǎn)生CS2，檢測時無法區(qū)分CS2來源，因此無法定量檢測福美胂[17]。而檢測食品中總砷[18-19]、無機砷[18-21]和有機砷[22]的方法也都無法準(zhǔn)確定量福美胂的殘留量。目前，福美胂殘留的定量檢測仍是一個空白，國內(nèi)外均無此類報道。本研究以此為切入點，擬建立蘋果中福美胂殘留的快速檢測方法，解決蘋果中福美胂無法定量檢測的難題，以保障中國蘋果產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

市售無公害鮮蘋果

1.2 試劑

福美胂標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99.0%)購自河北冠龍農(nóng)化有限公司,乙腈(色譜純)購自美國Fisher公司,三氟乙酸(分析純)購自上?？曝S化學(xué)試劑有限公司,苯(分析純)購自天津天力化學(xué)試劑有限公司,試驗用水為超純水。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品儲備液制備

準(zhǔn)確稱取福美胂標(biāo)準(zhǔn)品53.1 mg，乙腈溶解、定容至100 ml容量瓶,制成濃度為531 mg/L的福美胂標(biāo)準(zhǔn)儲備液,置于冰箱中4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)：P680型泵(在線脫氣機，梯度混合器及20 μl定量環(huán))和UVD 170U型紫外檢測器，美國DIONEX公司產(chǎn)品；DiamonsilTM型二代C18色譜分析柱(250.0 mm×4.6 mm ID，5.0 μm),DIKMA有限公司產(chǎn)品；AT-330型柱溫箱,天津奧特賽恩斯儀器有限公司產(chǎn)品；U-3010型紫外/可見分光光度計,日本HITACHI公司產(chǎn)品；DN-12A氮氣吹干儀,天津市東康科技有限公司產(chǎn)品；FW400A高速萬能粉碎機,北京科偉永興儀器有限公司產(chǎn)品；SHZ-III型循環(huán)水真空泵,上海亞榮生化儀器廠產(chǎn)品；AL204型電子天平,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司產(chǎn)品。

1.5 色譜條件

流速：1.0 ml/min，進樣體積：20 μl，檢測波長：247 nm,柱溫：30 ℃,流動相：以0.1%三氟乙酸水溶液為溶劑配制乙腈含量為10%溶液作為A相，100%乙腈為B相(A相∶B相=60∶40，體積比)。

1.6 樣品的前處理

蘋果去梗，保留整果，高速粉碎成果泥狀。準(zhǔn)確稱取10.0 g蘋果泥置于100 ml磨口三角燒瓶中，加入20 ml苯，劇烈震蕩提取30 min，靜止5 min，取上清萃取液，重復(fù)萃取4次，合并萃取上清液于100 ml容量瓶中，用乙腈定容,充分搖勻，取10 ml萃取液，氮氣吹干，用2 ml乙腈復(fù)溶，過0.45μm有機濾膜，待分析。

1.7 標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜分離及檢測系統(tǒng)穩(wěn)定性的考察

采用方法1.5的色譜條件，對福美胂標(biāo)準(zhǔn)溶液進行分離和檢測，同時對適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進樣3次，以峰系數(shù)(保留時間、峰值和峰面積)變異系數(shù)(CV)考察HPLC系統(tǒng)以及分析方法運行的日內(nèi)穩(wěn)定性。同時對保留時間的日間精密度(1 d進樣2次，共進樣3 d)進行分析，以CV評價色譜系統(tǒng)以及方法的日間穩(wěn)定性。

1.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

分別取福美胂標(biāo)準(zhǔn)品儲備液1 ml、2 ml、4 ml、6 ml、8 ml、10 ml于6只100 ml容量瓶中，乙腈定容，過0.45 μm微孔有機濾膜，按方法1.5的色譜條件進行測定，以峰面積對濃度進行線性回歸。

1.9 檢出限、定量限的測定

在同一批樣品中添加不同濃度的福美胂標(biāo)準(zhǔn)品溶液，對樣品進行處理，按方法1.5的色譜條件進行檢測。

1.10 加標(biāo)回收率的測定

在同一蘋果樣品中添加不同體積的福美胂標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按方法1.6的方法進行處理，按方法1.5的色譜條件進行檢測(重復(fù)5次)，以評價樣品前處理對福美胂回收率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

以乙腈為空白溶液，對濃度為5.31 mg/L福美胂標(biāo)準(zhǔn)品儲備溶液進行紫外全波長掃描(圖1)，試驗結(jié)果表明，福美胂的最大吸光度在247 nm處。

圖1 福美胂標(biāo)準(zhǔn)溶液的紫外掃描光譜圖Fig.1 Ultraviolet scanning spectra of standard solution of asomate

2.2 福美胂的分離

在相同的色譜條件下，對同一濃度的福美胂標(biāo)準(zhǔn)品溶液連續(xù)進樣3次，記錄保留時間、峰值以及峰面積值。如表1所示，福美胂保留時間、峰值以及峰面積的CV(n=3)均小于2%，其中保留時間的日精密度CV(n=3)為0.16%。由此可見，儀器和方法的穩(wěn)定性均比較好。

表1 福美胂檢測系統(tǒng)的穩(wěn)定性

連續(xù)進樣6次(1 d 2次，共3 d)，考察福美胂保留時間、峰值以及峰面積的日間精密度。如表2所示，福美胂保留時間、峰值和峰面積的日間精密度CV均小于1%，表明儀器和方法的日間精密度可以滿足檢測要求。

表2 福美胂檢測方法的日間精密度

2.3 福美胂標(biāo)準(zhǔn)曲線

如圖2所示，福美胂濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，Y=0.378 0x-0.123 2，R2=0.999 7，線性范圍：5.31 mg/L至53.1 mg/L。其中，Y為福美胂的峰面積(mAU·min)；x為福美胂質(zhì)量濃度(mg/L)。因此，用峰面積定量法對福美胂進行定量分析是可行的。

圖2 福美胂標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curve of asomate

2.4 福美胂檢測限

以S/N=3定為檢出限(LOD)，以S/N=10定為定量限(LOQ)，測定蘋果中福美胂的LOD為0.295 3 mg/kg，LOQ為1.206 7 mg/kg。

2.5 福美胂加標(biāo)回收率

按方法1.10的方法，在蘋果樣品中加入適當(dāng)體積的福美胂標(biāo)準(zhǔn)品溶液后進行色譜分析。如圖3、圖4和圖5所示，福美胂得到了良好的分離與檢測。

圖3 福美胂標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖Fig.3 The chromatogram of standard solution of asomate

圖4 蘋果空白樣品色譜圖Fig.4 The chromatogram of blank apple sample

圖5 添加福美胂的蘋果樣品色譜圖Fig.5 The chromatogram of apple sample with asomate

參考福美雙和福美鋅在水果中的殘留限量[12]，在蘋果樣品中添加不同劑量的福美胂標(biāo)準(zhǔn)品，進行色譜分析，計算其加標(biāo)回收率。如表3所示，福美胂的加標(biāo)回收率為 76.56%～100.22%，變異系數(shù)(CV)為 4.86%～7.51%。因此，該色譜分析方法對于蘋果中福美胂殘留的分析是準(zhǔn)確、可靠的。

3 結(jié) 論

本研究建立了定量檢測蘋果中福美胂殘留的RP-HPLC方法。該方法在準(zhǔn)確度、精密度以及回收率等方面均能滿足國家對農(nóng)藥殘留分析質(zhì)量控制要求[23],可以用于蘋果中福美胂殘留檢測。

表3 蘋果樣品中福美胂加標(biāo)回收率(n=5)

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