地衣芽孢桿菌B-1降解西維因的環(huán)境條件

蘇 趙， 胡凱弟， 朱佳雯， 王興潔， 劉書亮,2

(1.四川農(nóng)業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014； 2.四川農(nóng)業(yè)大學食品加工與安全研究所，四川 雅安 625014)

西維因(Carbaryl，分子式為C12H11NO2)，又名甲萘威，為一種廣譜型氨基甲酸酯類農(nóng)藥[1]。由于其低毒高效，一經(jīng)推廣便迅速替代高毒低效的有機磷類農(nóng)藥，大量用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和室內(nèi)病蟲害防治[2]。但近些年研究結(jié)果表明，西維因不僅對生態(tài)環(huán)境造成影響[3]，對人體健康亦會造成多方面危害[1-2]。雖然歐盟已禁止使用，但西維因仍廣泛流通于諸如美國、澳大利亞等發(fā)達國家乃至大部分發(fā)展中國家[4]。眾所周知，農(nóng)藥并非只局限于殘留在農(nóng)作物上，可遷移至空氣、土壤和水體[5]，甚至經(jīng)食物鏈傳播形成生物富集[6]。西維因一度成為美國地表水中最常被檢測到的殺蟲劑[7]，在某些食品中也有檢出[8]。如何消除環(huán)境及食品中的西維因殘留已成為亟需解決的問題。

目前，降解西維因及其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥的方法主要有物理法[9]、化學法[10]和生物法[2]，其中生物法由于低成本、綠色、高效等優(yōu)點被廣泛應(yīng)用。已報道能降解西維因的微生物中，細菌有假單胞菌屬(Pseudomonas)[11]、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)[12]、鞘脂菌屬(Sphingobium)[13]、微球菌屬(Micrococcus)[14]、根瘤菌屬(Rhizobium)[15]等，真菌有曲霉屬(Aspergillus)[16]、畢赤酵母屬(Pichia)[17]等。隨著研究的不斷深入，愈來愈多的菌株將被發(fā)掘。菌株對農(nóng)藥的降解往往與其生長狀況存在必然聯(lián)系[18]，而環(huán)境因素對微生物生長和農(nóng)藥本身降解均有影響[19]。地衣芽孢桿菌B-1(BacilluslicheniformisB-1) 是一株可高效降解氯氰菊酯的功能性菌株[20]，也能降解西維因，因此研究其降解西維因環(huán)境條件，對菌株的實際應(yīng)用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

1.1.1 菌株 地衣芽孢桿菌B-1(BacilluslicheniformisB-1) ，由四川農(nóng)業(yè)大學食品微生物實驗室分離鑒定并保存，其培養(yǎng)72 h對20 mg/L氯氰菊酯的降解率為93.93%[20]。

1.1.2 培養(yǎng)基 Luria-Bertani培養(yǎng)基(LB)：胰蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，Tween 80 2.0 g/L，蒸餾水溶解并定容至1.0 L，pH調(diào)至7.0；固體培養(yǎng)基添加20.0 g/L瓊脂粉。均 1×105Pa條件下滅菌15 min。

1.2 主要試劑和儀器

西維因標準品(99%)、丁硫克百威標準品(98%)、毒死蜱標準品(99%)，德國Dr. Ehrenstorfer GmbH公司產(chǎn)品；葉蟬散標準品(99.8%)，中國計量科學研究院提供；1-萘酚標準品(99.5%)，美國Sigma公司產(chǎn)品；乙腈(色譜純)，瑞典Oceanpak公司產(chǎn)品；甲醇(AR)，成都科龍試劑廠產(chǎn)品。

農(nóng)藥母液配制：準確稱取適量農(nóng)藥，用無水乙醇溶解并定容，配制成質(zhì)量濃度均為5 mg/ml的母液備用。

LC-2010C HT液相色譜儀，LC-Solution工作站，日本Shimazu公司產(chǎn)品；Sorvall ST 16R冷凍離心機，美國Thermo Fisher Scientific公司產(chǎn)品。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及種子液制備 挑取地衣芽孢桿菌B-1劃線于LB斜面，30 ℃培養(yǎng)48 h，用5 ml無菌生理鹽水洗下菌苔并調(diào)整細胞數(shù)量至 1×108CFU/ml，作為種子液。

1.3.2 西維因的提取與測定 取細菌均勻培養(yǎng)液1 ml至刻度試管中，加入等體積甲醇，超聲波(40 kHz，300 W)輔助提取20 min，搖勻后用甲醇定容至10 ml，取1.5 ml離心(12 000 r/min，15 min)，吸取上清過0.45 μm有機相濾膜，棄去初濾液，取續(xù)濾液供HPLC檢測。HPLC檢測條件[21]：色譜柱為Sepax GP-C18柱(150.0 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為乙腈超純水(56∶44，體積比)，流速0.5 ml/min，柱溫25 ℃，進樣量10 μl，紫外檢測器波長220 nm。計算農(nóng)藥降解率和殘留率，降解率=[(C0-C)/C0]×100%，殘留率=1-降解率，式中，C0為樣品培養(yǎng)液0 h時目標農(nóng)藥總質(zhì)量濃度(mg/L)，C為樣品培養(yǎng)液取樣時目標農(nóng)藥殘留質(zhì)量濃度(mg/L)。

1.3.3 菌株B-1生長曲線和降解曲線的測定 將菌株B-1種子液按5% (體積分數(shù))接種量分別接種于LB培養(yǎng)基和含100 mg/L西維因的LB培養(yǎng)基中，分裝于250 ml錐形瓶，每瓶30 ml。30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)72 h，同時設(shè)置添加等量無菌生理鹽水的空白對照。取樣時間為 0～24 h間隔2 h，24～36 h間隔4 h，36～72 h間隔12 h。生物量以細菌均勻培養(yǎng)液在波長600 nm處的吸光值(OD600)表示，計算西維因殘留率。試驗重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 菌株B-1降解西維因的環(huán)境條件試驗

1.3.4.1 培養(yǎng)溫度 將菌株B-1種子液按5%(體積分數(shù))接種量接種于西維因質(zhì)量濃度為100 mg/L的LB培養(yǎng)基中，錐形瓶分裝，在不同溫度下140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。測定樣品生物量及西維因殘留率。

1.3.4.2 初始pH 將菌株B-1種子液按5%(體積分數(shù))接種量接種于西維因質(zhì)量濃度為100 mg/L、不同初始pH 的LB培養(yǎng)基中，錐形瓶分裝，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。測定樣品生物量及西維因殘留率。

1.3.4.3 底物質(zhì)量濃度 將菌株B-1種子液按5%(體積分數(shù))接種量接種于含有不同質(zhì)量濃度西維因的LB培養(yǎng)基中，錐形瓶分裝，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。測定樣品生物量及西維因殘留率。

1.3.4.4 NaCl質(zhì)量濃度 將菌株B-1種子液按5%(體積分數(shù))接種量接種于含有100 mg/L西維因和不同質(zhì)量濃度NaCl的LB培養(yǎng)基中，錐形瓶分裝，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。測定樣品生物量及西維因殘留率。

1.3.4.5 金屬離子 將菌株B-1種子液按5%(體積分數(shù))接種量接種于含有100 mg/L西維因和0.05%(質(zhì)量濃度)不同金屬離子化合物(CaCl2、FeCl3、MnSO4、MgCl2、CuSO4)的LB培養(yǎng)基中，設(shè)置未添加上述金屬離子化合物的對照，分裝于錐形瓶中，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)48 h。測定樣品生物量及西維因殘留率。

1.3.5 菌株B-1降解譜試驗 將菌株B-1種子液按5%(體積分數(shù))接種量分別接種于含20 mg/L丁硫克百威、20 mg/L葉蟬散和20 mg/L毒死蜱的LB培養(yǎng)基中，分裝于錐形瓶，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)一定時間后取樣。采用HPLC檢測各樣品中農(nóng)藥殘留量，考察菌株B-1降解不同種類農(nóng)藥的能力。HPLC檢測條件參照文獻[21]、[22]。

1.3.6 菌株B-1降解西維因中間產(chǎn)物的分析 將菌株B-1種子液按5%(體積分數(shù))接種量接種于含100 mg/L西維因的LB培養(yǎng)基中，錐形瓶分裝，30 ℃、140 r/min振蕩培養(yǎng)。定時整瓶取樣，加入等體積甲醇，超聲波(40 kHz，300 W) 30 min后按照方法1.3.2處理樣品。用HPLC直接檢測樣品中西維因變化情況，并結(jié)合添加疑似產(chǎn)物標準品進行分析。以添加等量無菌生理鹽水為空白對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 地衣芽孢桿菌B-1的生長曲線和降解曲線

比較菌株B-1在LB和LB-Carbaryl培養(yǎng)基中的生長情況(圖1)。由圖1可知，B-1在兩種培養(yǎng)基中生物量略有不同，但總體趨勢一致。0～8 h生長緩慢，8 h后生長迅速，28 h后進入穩(wěn)定期，最終OD600分別為1.10和1.09。菌株在LB-Carbaryl培養(yǎng)基中的生物量較在LB培養(yǎng)基中的小，可能是因為西維因?qū)晟L有一定的抑制作用[23]，但并不影響其對數(shù)生長期的到來。圖1還顯示了菌株B-1在LB培養(yǎng)基中對西維因的降解情況。西維因殘留量在 0～8 h內(nèi)變化緩慢，此時菌株生長處于延滯期；8 h后隨著菌株生物量的增加，西維因開始降解，并在 20～48 h內(nèi)迅速減少，可見菌株B-1對西維因降解與生長是同步的。除去空白對照組損失部分，B-1在72 h內(nèi)對100 mg/L西維因的降解率達到91.21%。

圖1 菌株B-1的生長曲線及對西維因的降解曲線Fig.1 Curves of growth and carbaryl degradation by strain B-1

2.2 地衣芽孢桿菌B-1降解西維因的環(huán)境條件

培養(yǎng)溫度對西維因降解率影響較大(圖2)。40 ℃以下時，隨著培養(yǎng)溫度的升高，菌株生物量增加，西維因殘留量逐漸降低；40 ℃時OD600最大，為2.28，且西維因降解率也較高，為99.79%。超過40 ℃時，菌株生長減緩，未檢測到西維因殘留，可能是由于西維因在較高溫度下不穩(wěn)定而分解了[24]，但更主要的原因還是被菌株降解了。

圖2 不同培養(yǎng)溫度對菌株B-1生長及降解西維因的影響Fig.2 Effects of different culture temperatures on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

由圖3可知，初始pH為6時，菌株B-1 生物量(OD600)最大，西維因殘留較少，分別為1.691和40.37%。堿性環(huán)境對菌株生長有較大抑制作用，表現(xiàn)為菌株生物量偏低，但西維因殘留較少，原因可能是西維因在堿性環(huán)境中發(fā)生水解[1]。

圖3 不同初始pH對菌株B-1生長及降解西維因的影響Fig.3 Effects of different initial pH on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

菌株B-1在含不同質(zhì)量濃度西維因的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后，菌體生長和西維因降解情況如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)周期內(nèi)菌株B-1對不同質(zhì)量濃度的西維因有不同程度的降解，底物濃度越高，菌株生物量越低，降解率亦越低?？赡苁怯捎诟哔|(zhì)量濃度的農(nóng)藥對菌株有一定毒害作用，影響其生長[25]。

圖4 不同底物質(zhì)量濃度對菌株B-1生長及降解西維因的影響Fig.4 Effects of different substrate concentrations on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

當培養(yǎng)基中NaCl添加量為0時，菌株B-1生長最好，西維因降解率亦最高，為84.74%(圖5)。隨著NaCl添加量的增加，菌株生物量和西維因降解率均呈下降趨勢。當NaCl添加量為2%時，降解率僅為65.35%。

圖5 不同NaCl質(zhì)量濃度對菌株B-1生長及降解西維因的影響Fig.5 Effects of different concentration of sodium chloride on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

不同金屬離子對菌株B-1降解西維因的影響也不同(圖6)。由圖6可知，與對照相比，Ca2+、Fe3+、Mn2+和Mg2+對菌株降解西維因均有不同程度的刺激作用,其中添加Mn2+降解率最高，菌株生長最好。Cu2+對B-1生長有毒害作用[26]，菌株幾乎不能生長(OD600為0.235)，西維因也未降解。

圖6 不同金屬離子對菌株B-1生長及降解西維因的影響Fig.6 Effects of different metal ions on growth of strain B-1 and carbaryl degradation

2.3 地衣芽孢桿菌B-1的降解譜

結(jié)果(表1)顯示，B-1不僅能降解丁硫克百威和葉蟬散，也具備降解毒死蜱的能力，其在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)168 h對20 mg/L毒死蜱的降解率為50.77%。

表1 菌株B-1的降解譜

2.4 地衣芽孢桿菌B-1降解西維因的中間產(chǎn)物

HPLC檢測結(jié)果顯示，相較于LB培養(yǎng)體系，LB-Carbaryl培養(yǎng)體系在0 h時多了1號色譜峰,隨著培養(yǎng)時間的延長，1號色譜峰逐漸變小，隨之產(chǎn)生的是2號色譜峰，并逐漸變大。同混合標準品HPLC色譜圖比較，1號色譜峰與響應(yīng)時間為7.431 min的西維因相對應(yīng)，而2號色譜峰與1-萘酚(響應(yīng)時間8.392 min) 對應(yīng)。向LB-Carbaryl培養(yǎng)體系樣品中添加50 μl 1-萘酚標準品溶液(200 mg/L，乙腈配制)后，2號峰面積增加。

用HPLC分析LB-Carbaryl培養(yǎng)體系西維因變化趨勢，結(jié)果顯示，0～48 h隨著培養(yǎng)時間的延長，1號色譜峰與2號色譜峰呈此消彼長的趨勢；72 h后2號色譜峰開始減小，推測菌株B-1可在LB培養(yǎng)基中降解1-萘酚。經(jīng)進一步驗證，菌株B-1在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h對20 mg/L 1-萘酚的降解率為48.70%。

3 討 論

環(huán)境條件的改變會影響微生物的生長及代謝狀況[5]，而微生物降解農(nóng)藥的能力又與其生長狀況密切相關(guān)[27]。45 ℃時，BacilluslicheniformisB-1生物量較40 ℃時低，但無西維因殘留，推測可能是由于在菌株B-1降解的基礎(chǔ)上，西維因在較高溫度下不穩(wěn)定而分解，這與Uyanik等[28]的結(jié)論相吻合。Hawker[4]在研究不同pH值下西維因降解動力學時發(fā)現(xiàn)，在堿性環(huán)境下其半衰期更短。因此，當pH為9時西維因殘留率最低可能是生物與化學因素共同作用的結(jié)果。另一方面，當農(nóng)藥底物質(zhì)量濃度較大或滲透壓較高時，菌株生長會因脅迫壓力而受抑制，降解能力必然有所下降[25]。本試驗中，與不添加金屬離子的對照相比，添加Ca2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+對菌株B-1降解西維因能力有不同程度的促進作用，其中Mn2+效果最為明顯，而Cu2+則有抑制作用。

目前還未見關(guān)于地衣芽孢桿菌降解西維因的報道。本試驗中地衣芽孢桿菌B-1可降解50～300 mg/L的西維因，于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h對100 mg/L西維因的降解率為91.21%，降解能力強于PichiaanomalaHQ-C-01[17]和Arthrobactersp. RC100[12]。污染治理過程中，常常存在多類農(nóng)藥殘留混合的問題，僅僅消除某一種農(nóng)藥是不可行的[29]。菌株B-1對20 mg/L溴氰菊酯、氟氯氰菊酯和氰戊菊酯的72 h降解率分別為95.62%、79.73%和55.67%[20]，對毒死蜱和其他氨基甲酸酯類農(nóng)藥也均有降解作用，具有廣譜性，是降解農(nóng)藥殘留的理想菌源。對菌株B-1降解西維因產(chǎn)物的分析結(jié)果顯示，西維因降解過程中酯鍵斷裂生成1-萘酚，而且后者能被菌株B-1進一步代謝，這與已有的報道降解途徑[11-12]一致。賴文等的研究結(jié)果還表明，菌株B-1對氯氰菊酯的降解作用源于其所產(chǎn)生的胞外固有酯酶[20]。上述幾種農(nóng)藥的分子中都存在酯鍵，其生物降解的第一步也均是酯鍵水解而實現(xiàn)解毒[30-34]，因此推測菌株B-1的降解酯酶具有廣譜活性，有必要開展深入研究。

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