陜南水稻根際細(xì)菌多樣性變化趨勢(shì)

王夢(mèng)姣

(1.陜西理工大學(xué)陜西省資源生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 漢中 723000； 2.陜西理工大學(xué)陜西省食藥用菌工程技術(shù)研究中心，陜西 漢中 723000； 3.陜西理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000)

植物根際微生物是根際微生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分，能夠直接影響土壤物理結(jié)構(gòu)，對(duì)土壤肥力、植物營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)化起決定性作用,是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)[1-2]。對(duì)農(nóng)作物根際微生物結(jié)構(gòu)組成、空間分布、多樣性變化趨勢(shì)的分析，有助于從微生物角度改善土壤環(huán)境和土壤結(jié)構(gòu)，對(duì)進(jìn)一步研究根際微生物與農(nóng)作物的互作關(guān)系，提高陜南農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量具有重要的理論和實(shí)踐意義。

目前，人們對(duì)小麥(TriticumaestivumL.)、玉米(ZeamaysLinn.)等作物的根際微生物多樣性進(jìn)行了許多研究，均發(fā)現(xiàn)根際微生物多樣性與作物的生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)[3-4]。例如，胡桂萍等[5]針對(duì)水稻內(nèi)生菌和根際微生物群落多樣性進(jìn)行共同研究發(fā)現(xiàn)，不同水稻品種其根際微生物群落多樣性具有顯著差異；借助根際微生物群落多樣性的平臺(tái)，劉波等[6]進(jìn)行新的微生物分離方法的研究，這為從不同發(fā)育時(shí)期分離不同微生物，并對(duì)其功能研究提供了新的思路；張仕穎等[7]利用丁草胺污染對(duì)水稻及水稻根際微生物區(qū)系作用的試驗(yàn)闡明了外界影響能夠?qū)λ靖H微生物群落特征有顯著影響，這也反應(yīng)了在“根際微生物-土壤-作物”這個(gè)微生態(tài)系統(tǒng)中，根際微生物的變化能夠直接關(guān)聯(lián)作物的生長(zhǎng)發(fā)育；化感水稻根際微生物的生物學(xué)特性研究[8]，可以使我們了解特定水稻品種的根際微生物的生態(tài)學(xué)特性。這些研究結(jié)果都證明，水稻根際微生物與水稻生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，根際微生物多樣性與作物的生長(zhǎng)發(fā)育存在緊密的互作和聯(lián)系[9-10]。

陜西南部地區(qū)是陜西省水稻的主產(chǎn)區(qū)，也是中國(guó)重要的水稻主產(chǎn)區(qū)[11]，該地區(qū)的水稻種植方式屬于輪作制[12]。前人研究還未涉及到陜南這一具有油菜-水稻輪作制耕種體系的根際微生物多樣性分析，本研究旨在利用培養(yǎng)法研究陜南水稻-油菜輪作區(qū)的2個(gè)水稻品種在其五葉期、分蘗期、孕穗期[13-14]的根際細(xì)菌多樣性組成，擬從土壤細(xì)菌層面探討水稻生長(zhǎng)發(fā)育與根際細(xì)菌之間的關(guān)系，為進(jìn)一步指導(dǎo)實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 采樣地及水稻概況

本試驗(yàn)在陜西南部地區(qū)水稻主要種植區(qū)漢濱、城固和寧強(qiáng)[15-16]進(jìn)行，這3個(gè)采樣地氣候分別屬于亞熱帶大陸性季風(fēng)氣候、北亞熱帶濕潤(rùn)季風(fēng)區(qū)和暖溫帶山地濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，降水集中在9月，經(jīng)度分別為109°01′ E、107°13′ E、105°60′ E，緯度分別為32°42′N(xiāo)、32°75′N(xiāo)、32°55′N(xiāo)，海拔高度分別為260 m、480 m、820 m，供試土壤均為潴育性水稻土，灌溉水源均為河水，使用肥料均為尿素、復(fù)合肥(N∶P∶K=15∶15∶15,質(zhì)量比)。前茬作物為油菜。

水稻K優(yōu)082為平原地區(qū)主栽品種[16]，3個(gè)采樣地產(chǎn)量分別是10 062.0 kg/hm2、10 207.5 kg/hm2、9 100.5 kg/hm2，千粒質(zhì)量分別為31.9 g、31.2 g、31.6 g，單株有效穗數(shù)分別為17.3、16.7、16.9，每穗粒數(shù)分別為180.8、160.6、161.4，結(jié)實(shí)率分別為84.3%、85.8%、82.6%。先豐優(yōu)901為山區(qū)地區(qū)主栽水稻品種[17]，3個(gè)采樣地產(chǎn)量分別是9 762.0 kg/hm2、9 906.0 kg/hm2、9 252.0 kg/hm2，千粒質(zhì)量分別為29.7 g、29.2 g、29.4 g，單株有效穗數(shù)分別為18.1、17.4、16.2，每穗粒數(shù)分別為182.5、170.0、169.1，水稻結(jié)實(shí)率分別為86.9%、84.7%、80.7%。

1.2 水稻根際采集時(shí)間及采集方法

采集土樣時(shí)間為2015年4月至8月，具體采樣時(shí)間見(jiàn)表1。采用五點(diǎn)采樣法進(jìn)行根際樣品采集，將水稻根系從土壤中挖出，用抖落法[17]抖掉與根系松散結(jié)合的土體，然后將土壤連帶植物組織包裹帶回實(shí)驗(yàn)室后進(jìn)行充分混勻，過(guò)2 mm篩。

表1 采樣時(shí)間表

1.3根際微生物的分離計(jì)數(shù)及純培養(yǎng)

稱(chēng)取10 g水稻根際放入裝有100 ml無(wú)菌水的三角瓶中，150 r/min振蕩10 min，吸取5 ml至裝45 ml有無(wú)菌水的三角瓶中，制成1∶100的稀釋液,再依次制備成10-1、10-2、10-3梯度稀釋液。吸取各稀釋液100 ml至牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，涂布均勻，37 ℃培養(yǎng) 14～18 h。每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)重復(fù)。利用菌落計(jì)數(shù)器對(duì)每一個(gè)平板上的土壤細(xì)菌進(jìn)行單菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算分離出來(lái)的土壤中的細(xì)菌數(shù)[18]。

菌落數(shù)=菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)/干土質(zhì)量×100%

1.4 細(xì)菌16S rDNA的擴(kuò)增及序列分析

用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒將細(xì)菌基因組DNA提取后，用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)進(jìn)行16S rDNA的序列擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系(50.00 μl)為：10×Buffer 5.00 μl、2.5 mmol/L Dntp 5.00 μl、上下游引物各2.00 μl、模板1.00 μl、Taq酶0.25 μl，加水至50.00 μl。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，終止PCR反應(yīng)。采用0.8%瓊脂糖對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，并送上海英駿測(cè)序公司測(cè)序。

測(cè)序完成后，對(duì)所有菌株進(jìn)行 16S rDNA序列測(cè)定。測(cè)序結(jié)果利用BLAST軟件(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，初步確定分離得到菌的種屬。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建

選取同源性最高且有效發(fā)表的菌株序列，利用 MEGA5.1 軟件(http：//www.megasoftware.net/mega5.1.html)進(jìn)行分析，用 Clustal W 按照最大同源性的原則進(jìn)行排序，采用Kimura-2 計(jì)算核苷酸差異值，最后用鄰接法(Neighbor-Joining method)[19]構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻根際細(xì)菌的數(shù)量變化

對(duì)3個(gè)地區(qū)根際細(xì)菌菌落數(shù)的統(tǒng)計(jì)(圖1)發(fā)現(xiàn)，在溶液稀釋10倍和100倍的條件下，漢濱和城固地區(qū)K優(yōu)082的根際細(xì)菌菌落數(shù)大于先豐優(yōu)901，寧強(qiáng)地區(qū)則相反。這可能是由于平原主栽品種K優(yōu)082在平原地區(qū)(漢濱和城固)生長(zhǎng)狀態(tài)更好，與根際微生物互作關(guān)系更強(qiáng)，能夠被分離得到更多的細(xì)菌，而山地主栽品種先豐優(yōu)901則在山地(寧強(qiáng))地區(qū)更有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。這說(shuō)明，水稻品種及地理位置對(duì)水稻根際細(xì)菌數(shù)量有顯著影響，這與黃柳琴等[20]、厲桂香等[21]的研究結(jié)果較為一致。稀釋1 000倍的土壤溶液中可培養(yǎng)的細(xì)菌數(shù)量均較小，不能進(jìn)行比較和分析。

分析曲線變化可以發(fā)現(xiàn)，在五葉期的10倍和100倍根際土壤稀釋液中分離得到了較多的細(xì)菌菌落，且其數(shù)量較其他兩個(gè)時(shí)期有顯著差異。這一現(xiàn)象均出現(xiàn)在3個(gè)采樣地的2個(gè)水稻品種根際土壤細(xì)菌分離過(guò)程中?？梢猿醪酵茢啵究赡茉谖迦~期與微生物互作更為緊密，分蘗期次之，孕穗期最差。這可能與水稻生長(zhǎng)特性相關(guān)，隨著水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，土壤含水量逐漸升高，導(dǎo)致細(xì)菌數(shù)量下降[22]。

圖1 細(xì)菌菌落數(shù)變化趨勢(shì)圖Fig.1 The variation tendency of bacterial colony

2.2 水稻根際土壤細(xì)菌組成

對(duì)分離獲得具有明顯差異的單菌落進(jìn)行DNA提取及16S rDNA擴(kuò)增，每個(gè)采樣地的每個(gè)水稻品種3個(gè)時(shí)期的根際細(xì)菌單菌落均篩選出 70株細(xì)菌。從圖2中可以看出，提取的DNA較為完整，擴(kuò)增后得到約為1 500 bp的細(xì)菌16S rDNA條帶，可保證后續(xù)測(cè)序結(jié)果的完整性。

每個(gè)采樣地的每個(gè)品種在每個(gè)時(shí)期均成功進(jìn)行了62個(gè)測(cè)序，通過(guò)對(duì)測(cè)序結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，水稻根際中共檢測(cè)出4個(gè)門(mén)，分別為擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)和厚壁菌門(mén)(Firmicutes)。其中，厚壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌種，在每個(gè)采樣點(diǎn)所占比例均超過(guò)70%，在漢濱采樣地的水稻分蘗期先豐優(yōu)901的根際細(xì)菌均屬于厚壁菌門(mén)。從圖3中還可以發(fā)現(xiàn)，隨著水稻的生長(zhǎng)發(fā)育，厚壁菌門(mén)所占比例也逐漸上升，在分蘗期達(dá)到最高峰，又在孕穗期下降。變形菌門(mén)在所有的五葉期和孕穗期的根際中均能發(fā)現(xiàn)。

A圖和B圖中M代表Maker，用來(lái)指示條帶長(zhǎng)度，為康為世紀(jì)的100 bp ladder,貨號(hào)為CW0636M。A圖中1～6代表6個(gè)不同的細(xì)菌菌液提取出來(lái)的基因組DNA,B圖中1～6代表6個(gè)細(xì)菌基因組DNA經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增出來(lái)的16S DNA條帶。圖2 水稻根際細(xì)菌基因組DNA提取(A)及細(xì)菌16S rDNA擴(kuò)增圖(B) Fig.2 Results of DNA(A) and 16S rDNA(B) on soil bacteria form rice rhizosphere

a:K優(yōu)082-五葉期；b：先豐優(yōu)901-五葉期；c：K優(yōu)082-分蘗期；d：先豐優(yōu)901-分蘗期；e：K優(yōu)082-孕穗期；f：先豐優(yōu)901-孕穗期。圖3 水稻根際細(xì)菌組成Fig.3 The group of bacteria in rice rhizosphere soil

進(jìn)一步從屬的角度分析，從圖4中可以看出：首先，在分析的所有根際樣本中，共有26個(gè)屬，1～26分別為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、葡萄球菌屬(Staphylococcussp.)、節(jié)桿菌屬(Arthrobactersp.)、根瘤菌屬(Rhizobiumsp.)、產(chǎn)堿桿菌屬(Alcaligenessp.)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、泛菌屬(Pantoeusp.)、不動(dòng)桿菌屬(Acinetobactesp.)、短桿菌屬(Brevibacteriumsp.)、嗜冷桿菌屬(Psychrobactersp.)、鞘氨醇菌屬(Sphingobacteriumsp.)、Lysinibacillusvarians、弗拉托氏菌屬(Frateuriasp.)、Fictibacillus、黃單胞菌屬(Xanthomonassp.)、巴斯德菌屬(Pasteurellasp.)、噬氫菌屬(Hydrogenophagaatypica)、梭菌屬(Fusiformis)、Terribacillus、叢毛單胞菌屬(comamonas sp.)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacteriumsp.)、阪崎腸桿菌屬(Cronobactersp.)、氣單胞菌屬(Aeromonassp.)和嗜氮根瘤菌屬(Azorhizophilussp.)。其中，枯草芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)菌，其在除漢濱地區(qū)K優(yōu)082的五葉期根際樣本(枯草芽孢桿菌屬細(xì)菌占總菌數(shù)的64.52%)以外的所有根際樣本中所占比例均超過(guò)80.00%，最高甚至達(dá)到98.39%(寧強(qiáng)采樣地的K優(yōu)082在孕穗期的根際樣本)。

其次，3個(gè)采樣地的2個(gè)水稻品種在五葉期的根際樣本中細(xì)菌豐度最好，這一結(jié)論也與本研究關(guān)于細(xì)菌計(jì)數(shù)及細(xì)菌組成分布的結(jié)論一致。因此，五葉期水稻與土壤及根際微生物互作最為顯著。

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建

根據(jù)測(cè)序結(jié)果對(duì)所有分離得到的細(xì)菌進(jìn)行了統(tǒng)一歸類(lèi)，對(duì)獲得的細(xì)菌DNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)，選擇一些與測(cè)定序列同源性較高的抑制種序列作為參考序列，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果(圖5)表明，在所有土壤樣本中，共得到66個(gè)不同的細(xì)菌種，枯草芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)細(xì)菌類(lèi)群。

圖4 3個(gè)采樣地不同水稻生長(zhǎng)時(shí)期根際細(xì)菌多樣性變化趨勢(shì)Fig.4 The diversity trends of bacteria in rhizosphere soil in different rice growth period

圖5 基于16S rDNA的水稻根際細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.5 Phylogenetic tree of bacteria in rice rhizosphere soil based on 16S rDNA

3 討 論

本研究主要針對(duì)西北水稻主產(chǎn)地——陜西南部地區(qū)，對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，2個(gè)水稻品種的根際微生物組成進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，從所有根際樣本中共分離得到了26個(gè)屬的細(xì)菌，分別劃歸于4個(gè)門(mén)。其中厚壁菌門(mén)的細(xì)菌占大多數(shù)，芽孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬。本研究數(shù)據(jù)對(duì)構(gòu)建陜南土壤微生物數(shù)據(jù)庫(kù)提供了基礎(chǔ)試驗(yàn)數(shù)據(jù)。同時(shí)，試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)了一些其他具有一定研究?jī)r(jià)值的菌屬，比如前人研究較少，具有良好抗鹽效果的Terribacillus屬[23]，將會(huì)在后續(xù)研究中繼續(xù)進(jìn)行探索。

本研究還對(duì)不同生長(zhǎng)階段的細(xì)菌多樣性變化趨勢(shì)進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2個(gè)水稻品種根際細(xì)菌均在五葉期的多樣性最強(qiáng)，隨后逐漸降低，但分蘗期和孕穗期差異不大。這說(shuō)明，與分蘗期和孕穗期相比，五葉期水稻與根際細(xì)菌互作更為頻繁。這就意味著，在下一步研究輪作制狀態(tài)下水稻與根際微生物互作關(guān)系時(shí)選擇五葉期更為合適。

本研究?jī)H采用牛肉膏蛋白胨單一培養(yǎng)基分別對(duì)水稻根際細(xì)菌進(jìn)行分離研究，初步揭示了陜南油菜-水稻輪作制下，水稻根際特有生境中微生物種群的組成特征，但仍然存在一定的局限性。有必要采用不依賴(lài)純培的分子生物學(xué)方法，以獲取更全面的水稻根際微生物多樣性信息。

參考文獻(xiàn)：

[1] ASEMOLOYE M D, AHMAD R, JONATHAN S G.Synergistic action of rhizospheric fungi with Megathyrsus maximus root speeds up hydrocarbon degradation kinetics in oil polluted soil[J]. Chemosphere, 2017, 187:1-10.

[2] 段紅平，張乃明，李進(jìn)學(xué)，等. 高產(chǎn)水稻根基微生物類(lèi)群數(shù)量初探[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007,23(2)：285-289.

[3] ROSIER A, BISHNOI U, LAKSHMANAN V, et al. A perspective on inter-kingdom signaling in plant-beneficial microbe interactions[J]. Plant Mol Biol, 2016, 90(6):537-548.

[4] LAKSHMANAN V, SELVARAJ G, BAIS H P.Functional soil microbiome: belowground solutions to an aboveground problem[J]. Plant Physiol, 2014, 166(2):689-700.

[5] 胡桂萍. 水稻內(nèi)生菌及其根系土壤微生物群落多樣性的研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué)，2010.

[6] 劉 波，胡桂萍，鄭雪芳,等. 利用磷脂脂肪酸(PLFAs)生物標(biāo)記法分析水稻根際土壤微生物多樣性[J]. 中國(guó)水稻科學(xué)，2010,24(3):278-288.

[7] 張仕穎，夏運(yùn)生，肖 煒,等. 丁草胺污染對(duì)高產(chǎn)水稻土微生物區(qū)系的影響[J]. 生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào)，2014,23(4)：679-684.

[8] 林文雄. 化感水稻抑草作用的根際生物學(xué)特性與研究展望[J]. 作物學(xué)報(bào)，2013,39(6)：951-960.

[9] KUMAR A S, BAIS H P.Wired to the roots: impact of root-beneficial microbe interactions on abovegroundplant physiology and protection[J]. Plant Signal Behav, 2012, 7(12):1598-1604.

[10] LAKSHMANAN V, RAY P, CRAVEN KD.Toward a resilient, functional microbiome: drought tolerance-alleviating microbes for sustainable agriculture[J]. Methods Mol Biol, 2017, 1631:69-84.

[11] 馬 欣，吳紹洪，戴爾阜，等. 氣候變化對(duì)我國(guó)水稻主產(chǎn)區(qū)水資源的影響[J]. 自然資源學(xué)報(bào)，2011，26(6)：1052-1063.

[12] YU L, ZHU J, HUANG Q, et al. Application of a rotation system to oilseed rape and rice fields in Cd-contaminated agricultural land to ensure food safety[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2014,108:287-293.

[13] 湯 潔，梁 爽，張 豪，等. 吉林省西部鹽水田水稻生長(zhǎng)不同時(shí)期土壤有機(jī)碳和堿解氮的動(dòng)態(tài)變化特征[J]. 中國(guó)科技論文，2015,10(9):1053-1057.

[14] 朱海平，李貴勇，夏瓊梅，等. 不同時(shí)期干旱脅迫對(duì)水稻產(chǎn)量及生長(zhǎng)特性影響[J].中國(guó)稻米，2017,23(4)：135-138.

[15] 張選明，馮志峰，李 勤，等. 陜西漢中優(yōu)質(zhì)稻生產(chǎn)現(xiàn)狀及思考[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010, 56(3)：126-128.

[16] 喬 帥，王夢(mèng)姣，鄧百萬(wàn)，等. 輪作區(qū)水稻根際土壤鈣鎂離子含量、含水量和酸堿度變化趨勢(shì)[J]．江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45(5):284-288.

[17] FUJII Y, AKIHIRO F, SYUNTARO H. Rhizosphere soil method: a new bioassay to evaluate allelopathy in the field [C]//TUPPER G, WILKES S, FLYNN H, et al. 3rd Australian New Zealand Soils Conference: Novel Approaches. Australia: Charles Sturt University Press, 2004: 490-492.

[18] 岳 輝，李志真，鐘炳林. 水土流失區(qū)芒箕生長(zhǎng)與土壤微生物區(qū)系研究[J].林業(yè)科技，2009,34(4)：22-26.

[19] TAMURA K，PETERSON D，PETERSON N，et al. MEGA5：molecular evolutionar y genetics analysis using maximum likelihood，evolutionary distance，and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology & Evolution，2011，28(10)：2731-2739.

[20] 黃柳琴. 我國(guó)部分地球關(guān)鍵帶中氨氧化菌群分布及其對(duì)環(huán)境的響應(yīng)[D]. 北京：中國(guó)地質(zhì)大學(xué)，2015.

[21] 厲桂香，馬克明.土壤微生物多樣性海拔格局研究進(jìn)展[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2018,38(5)：1521-1529.

[22] 楊瑞紅，趙成義，王新軍，等.梭梭和怪柳土壤微生物多樣性初步分析[J]. 土壤，2016,48(6)：1120-1130.

[23] LIU W Y, JIANG L L, GUO C J, et al.Terribacillusaidingensissp. nov., a moderately halophilic bacterium[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2010, 60：2940-2945.