N-乙酰半胱氨酸對(duì)哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞自噬水平的影響

周冬梅，孔靈菲

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，沈陽(yáng) 110001）

支氣管哮喘是一種涉及基因和環(huán)境相互作用的復(fù)雜疾病，病因仍不完全清楚。氣道上皮細(xì)胞在肺內(nèi)環(huán)境和外部環(huán)境之間提供了重要的保護(hù)層，支氣管上皮中表達(dá)的多個(gè)基因的多態(tài)性均與哮喘易感性相關(guān)［1］，而環(huán)境因素可能影響表觀遺傳機(jī)制，改變上皮細(xì)胞功能和對(duì)環(huán)境污染的反應(yīng)。詳細(xì)了解氣道上皮細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，有助于肺部疾病的進(jìn)一步診治。大量的研究［2］表明，哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞存在功能障礙，它在哮喘的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。氣道上皮屏障功能損傷的嚴(yán)重程度與支氣管哮喘急性發(fā)作的嚴(yán)重程度相關(guān)。近期研究［3］發(fā)現(xiàn)，支氣管哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞存在自噬功能障礙。哮喘患者的肺組織電鏡檢查亦顯示，哮喘患者的氣道上皮細(xì)胞內(nèi)可見許多雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體［4］。本研究旨在檢測(cè)N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）能否調(diào)控支氣管哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞的自噬水平。

1 材料與方法

1.1 模型的制備與處理

將18只SPF級(jí)BALB/C小鼠分為磷酸鹽 （phosphate buffer saline，PBS） 對(duì)照組 （PBS組）、卵清白蛋白 （ovalbumin，OVA） 支氣管哮喘組 （OVA組） 及NAC治療組 （NAC組） ，每組6只，由遼寧長(zhǎng)生生物有限公司提供。支氣管哮喘小鼠于第1天、第8天、第15天腹腔注射OVA （美國(guó)Sigma公司） 20 μ g與氫氧化鋁凝膠（美國(guó)Pierce公司） 2 mg的混合液致敏，第22天開始霧化吸入2%OVA30 min，5 d/周，持續(xù)4周。PBS組用磷酸鹽緩沖液替代，NAC組于每次霧化前1 h腹腔注射NAC （300 mg/kg，美國(guó)Sigma公司） 。

1.2 小鼠氣道反應(yīng)性檢測(cè)

末次霧化后24～48 h內(nèi)行氣道反應(yīng)性檢測(cè) （法國(guó)EMKA無(wú)創(chuàng)肺功能儀） ，檢測(cè)小鼠在不同濃度的乙酰甲膽堿（分別為0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/mL）霧化后增強(qiáng)呼氣間歇 （enhanced pause，Penh） 的水平，Penh較基線水平的倍數(shù)變化反映氣道高反應(yīng)程度。

1.3 小鼠肺泡灌洗液細(xì)胞計(jì)數(shù)

小鼠肺功能檢測(cè)后予戊巴比妥鈉 （2%，50 mg/kg，美國(guó)Sigma公司） 麻醉，氣道內(nèi)插入留置針，予生理鹽水0.5 mL注入氣道內(nèi)后回收，重復(fù)3次，回收量均＞80%。顯微鏡下計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)，4 ℃離心并重懸至合適濃度后甩片，行瑞氏-吉姆薩染色 （北京索萊寶科技有限公司，按說明書操作） ，每張涂片計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞分類。

1.4 肺組織切片病理染色

左側(cè)肺組織取出后放入4%多聚甲醛中固定，石蠟包埋后切片。肺組織切片 （5 μ m） 按照HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、AB-PAS染色試劑盒 （北京索萊寶科技有限公司） 說明書進(jìn)行染色。

1.5 免疫熒光檢測(cè)

切片脫蠟至水，檸檬酸鈉抗原修復(fù)1 min后，1%BSA封閉45 min，微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 （microtubule-associated protein 1 light chain 3，LC3B） （武漢愛博泰克生物科技有限公司，1∶200） 4 ℃濕盒孵育過夜。洗后避光加入熒光二抗 （異硫氰酸熒光素，1∶100） 37 ℃ 30 min。清洗后加入DAPI染核 （20 μg/μL） 37 ℃ 30 min。甘油封片，圖像采集。

1.6 電鏡檢查自噬體

沿支氣管束走行方向剪下約0.3 cm×0.3 cm組織塊浸入2.5%戊二醛中固定，送入電鏡室行電鏡檢查。

1.7 LC3B蛋白電泳

BCA蛋白定量法測(cè)定蛋白濃度，12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，PVDF膜轉(zhuǎn)印，LC3B抗體4 ℃孵育過夜 （1∶1 000） ，二抗室溫1 h，ECL發(fā)光，UVP凝膠成像系統(tǒng) （美國(guó)Bio-Rad公司） 成像。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD法，方差不齊時(shí)采用Dunnett’s T3法，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NAC可減輕支氣管哮喘小鼠氣道炎癥

為了解NAC能否降低支氣管哮喘小鼠氣道炎癥，對(duì)肺組織行HE染色 （圖1） 和肺泡灌洗液細(xì)胞分類計(jì)數(shù) （表1） 。肺HE染色顯示，PBS組小鼠的支氣管氣道上皮細(xì)胞完整，氣道周圍沒有或僅有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；支氣管哮喘小鼠有顯著的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，上皮細(xì)胞層增厚，氣道管腔縮窄，平滑肌增厚；而NAC組顯示出良好的抑制氣道炎癥作用，氣道周圍僅有輕度炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣道上皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，管腔狹窄較OVA組亦明顯好轉(zhuǎn)。

小鼠肺泡灌洗液結(jié)果也顯示，NAC具有抑制氣道炎癥的作用。NAC組小鼠肺泡灌洗液較OVA組小鼠細(xì)胞總數(shù)明顯下降，其中嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及中性粒細(xì)胞下降明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.001） 。

2.2 NAC抑制支氣管哮喘小鼠的氣道高反應(yīng)性（表2）

隨著乙酰甲膽堿濃度逐步上升，各組小鼠的Penh均呈上升趨勢(shì)，OVA組小鼠氣道反應(yīng)性升高最為明顯，乙酰甲膽堿濃度為6.25 mg/mL時(shí)即顯著升高 （P＜ 0.05） 。NAC組自12.5 mg/mL濃度后較OVA組明顯下降，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜ 0.05） ，自25 mg/mL濃度后才較PBS組升高，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜ 0.05） 。

2.3 NAC抑制氣道上皮細(xì)胞黏液分泌及膠原蛋白沉積

OVA組小鼠氣道AB-PAS染色顯示，大多數(shù)氣道上皮細(xì)胞均呈強(qiáng)陽(yáng)性改變，而NAC組PAS陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著下降。氣道上皮下膠原蛋白沉積是支氣管哮喘氣道重塑的重要病理生理學(xué)改變。Masson染色可見，OVA組較PBS組氣道上皮及血管周圍大量的膠原蛋白沉積，上皮層明顯增厚，而NAC組上皮下膠原沉積減少。

表1 各組小鼠肺泡灌洗細(xì)胞分類計(jì)數(shù) （×105/mL）Tab.1 Cellular analysis of bronchoalveolar lavage fluid in each group （×105/mL）

圖1 各組小鼠肺組織切片染色 ×200Fig.1 Histochemical staining of lung tissue sections in each group ×200

2.4 NAC抑制肺組織氣道上皮細(xì)胞的自噬水平

LC3B免疫熒光顯示，PBS組的氣道上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中僅有極少量細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)，OVA組的氣道上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中LC3B高表達(dá)，幾乎所有的上皮細(xì)胞均發(fā)生自噬反應(yīng)，而NAC組中LC3B的表達(dá)減弱，表達(dá)LC3B的上皮細(xì)胞數(shù)目減少 （圖2） 。透射電鏡結(jié)果亦顯示，OVA組小鼠部分氣道上皮細(xì)胞中出現(xiàn)很多自噬體。NAC可見少量自噬體（圖3） 。蛋白電泳結(jié)果 （圖4） 同樣顯示，OVA組LC3BⅡ型明顯增多，NAC組LC3BⅡ型減少。

3 討論

氣道上皮細(xì)胞是肺組織的第1道屏障，其屏障功能除物理屏障功能外還發(fā)揮著化學(xué)屏障及免疫屏障的功能［2，5］。越來越多的研究［6-9］表明，氣道上皮細(xì)胞在支氣管哮喘發(fā)病及氣道重塑過程中發(fā)揮著不容忽視的作用。氣道上皮細(xì)胞通過分泌MUC5AC黏蛋白、促纖維化生長(zhǎng)因子自噬與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化等參與氣道重塑。

本研究結(jié)果顯示，NAC具有良好的抗氣道炎癥及氣道重塑的作用，這與既往研究NAC對(duì)哮喘小鼠的作用結(jié)果相一致［10］。然而既往的研究均關(guān)注于NAC對(duì)氣道的抗氧化抗炎作用，本研究著重關(guān)注于NAC對(duì)氣道上皮細(xì)胞自噬水平的影響。本研究表明，NAC組小鼠肺泡灌洗液中不僅嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)減少，中性粒細(xì)胞數(shù)亦明顯減少，說明NAC在緩解氣道炎癥的基礎(chǔ)上針對(duì)難治性哮喘可能有進(jìn)一步的治療作用，亦有文獻(xiàn)［11］支持NAC可抑制激素耐受型支氣管哮喘的急性發(fā)作。近期許多研究［12-13］均表明，自噬是導(dǎo)致支氣管哮喘氣道上皮細(xì)胞發(fā)生杯狀細(xì)胞轉(zhuǎn)化及MUC5AC分泌的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，自噬同樣是導(dǎo)致氣道上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵因素之一［14］。過度的自噬可能是氣道上皮細(xì)胞功能障礙的原因。本研究結(jié)果顯示，NAC可減輕氣道上皮細(xì)胞的黏液分泌，抑制支氣管哮喘氣道上皮細(xì)胞的過度自噬。由此可推測(cè)NAC可能通過抑制氣道上皮細(xì)胞的過度自噬從而保護(hù)氣道上皮細(xì)胞，減少膠原沉積及黏液分泌，進(jìn)而緩解氣道重塑。

表2 不同濃度的乙酰甲膽堿霧化后各組小鼠的Penh值Tab.2 Enhanced pause values in different mouse groups after acetylcholine treatment

圖2 肺組織LC3B免疫熒光染色 ×200Fig.2 Immunohistochemical staining of microtubule-associated proteins 1A/1B light chains 3B in lung tissues ×200

圖3 氣道上皮細(xì)胞透射電鏡檢查Fig.3 Transmission electron microscopy examination of airway epithelial cells

圖4 Western blotting分析各組小鼠肺組織LC3B表達(dá)Fig.4 LC3B expression by Western blotting analysis in mice lung tissues in each group

本研究通過動(dòng)物模型的方法驗(yàn)證NAC對(duì)哮喘小鼠氣道上皮細(xì)胞自噬水平的作用具有局限性，需進(jìn)一步完善細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，明確NAC針對(duì)氣道上皮細(xì)胞自噬水平的作用機(jī)制及作用靶點(diǎn)。值得注意的是，NAC對(duì)支氣管哮喘的是否真的有效目前尚沒有確切證據(jù)，相關(guān)的臨床試驗(yàn)表明，NAC在抑制哮喘患者的急性發(fā)作的研究中未見明確療效，但該研究?jī)H有50例患者入選，NAC也僅應(yīng)用5 d［15］。是否可以長(zhǎng)期應(yīng)用NAC輔助控制氣道上皮細(xì)胞的自噬水平，從而達(dá)到減輕氣道重塑效果尚不清楚，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，NAC對(duì)氣道上皮細(xì)胞自噬功能的影響有可能成為治療支氣管哮喘新的突破口。

綜上所述，NAC可減輕支氣管哮喘的氣道炎癥及氣道重塑，氣道上皮細(xì)胞自噬水平的降低可能在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，有望成為治療哮喘，緩解氣道重塑的新方向，但其具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

［1］ TSICOPOULOS A，DE NADAI P，GLINEUR C. Environmental and genetic contribution in airway epithelial barrier in asthma pathogenesis［ J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol，2013，13（ 5） ：495-499.DOI：10.1097/ACI.0b013e328364e9fe.

［2］ GEORAS SN，REZAEE F . Epithelial barrier function：at the frontline of asthma immunology and allergic airway inflammation［ J］. J Allergy Clin Immunol，2014，134（ 3） ：509-520. DOI：10.1016/j.jaci.2014.05.049.

［3］ POON A，EIDELMAN D，LAPRISE C，et al. ATG5，autophagy and lung function in asthma.［ J］. Autophagy，2012，8（ 4） ：694-695. DOI：10.4161/auto.19315.

［4］ POON AH，CHOUIALI F，TSE SM，et al. Genetic and histological evidence for autophagy in asthma pathogenesis［ J］. J Allergy Clin Immunol，2012，129（ 2） ：569-571. DOI：10.1016/j.jaci.2011.09.035.

［5］ LOXHAM M，DAVIES DE，BLUME C. Epithelial function and dysfunction in asthma［ J］. Clin Exp Allergy，2014，44（ 11） ：1299-1313.DOI：10.1111/cea.12309.

［6］ SHIMIZU S，KOUZAKI H，OGAWA T，et al. Eosinophil-epithelial cell interactions stimulate the production of MUC5AC mucin and profibrotic cytokines involved in airway tissue remodeling［ J］. Am J Rhinol Allergy，2014，28（ 2） ：103-109. DOI：10.2500/ajra.2014.28.4018.

［7］ HACKETT TL. Epithelial-mesenchymal transition in the pathophysiology of airway remodeling in asthma［ J］. Curr Opin Allergy Clin Immunol，2012，12（ 1） ：53-59. DOI：10.1097/ACI.0b013e32834ec6eb.

［8］ ROYCE SG，LI X，TORTORELLA S，et al. Mechanistic insights into the contribution of epithelial damage to airway remodeling. Novel therapeutic targets for asthma［ J］. Am J Respir Cell Mol Biol，2014，50（ 1） ：180-192. DOI：10.1165/rcmb.2013-0008OC.

［9］ PROUD D，LEIGH R. Epithelial cells and airway diseases［ J］.Immunol Rev，2011，242（ 1） ：186-204. DOI：10.1111/j.1600-065X.2011.01033.x.

［10］ BLESA S，CORTIJO J，MARTINEZ-LOSA M，et al. Effectiveness of oral N -acetylcysteine in a rat experimental model of asthma［ J］. Pharmacol Res，2002，45（ 2） ：135-140. DOI：10.1006/phrs.2001.0917.

［11］ EFTEKHARI P，HAJIZADEH S，RAOUFY MR，et al. Preventive effect of N-acetylcysteine in a mouse model of steroid resistant acute exacerbation of asthma［ J］. EXCLI J，2013，12：184-192.

［12］ DICKINSON JD，ALEVY Y，MALVIN NP，et al. IL13 activates autophagy to regulate secretion in airway epithelial cells［ J］. Autophagy，2016，12（ 2） ：397-409. DOI：10.1080/15548627.2015.1056967.

［13］ ZHOU JS，ZHAO Y，ZHOU HB，et al. Autophagy plays an essential role in cigarette smoke-induced expression of MUC5AC in airway epithelium［ J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2016，310（ 11） ：L1042-1052. DOI：10.1152/ajplung.00418.2015.

［14］ LIU T，LIU Y，MILLER M，et al. Autophagy plays a role in FSTL1-induced epithelial mesenchymal transition and airway remodeling in asthma［ J］. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2017，313（ 1） ：L27-L40. DOI：10.1152/ajplung.00510.2016.

［15］ ALIYALI M，POORHASAN AMIRI A，SHARIFPOOR A，et al. Effects of N-acetylcysteine on asthma exacerbation［ J］. Iran J Allergy Asthma Immunol，2010，9（ 2） ：103-109. DOI：09.02/ijaai.103109.