耐甲氧西林葡萄球菌的耐藥性分析

翟俊輕 張立志 李靜 劉開揚(yáng)

自從1961年英國學(xué)者Jevons報(bào)道了世界上首株耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA)以來，MRSA和耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球(methicillin-resistant coagu-lase-ngeative staphylococci，MRCNS)在世界各地廣泛傳播，其分離率逐年增加。20世紀(jì)80年代末90年代初以來，葡萄球菌較以前感染明顯增多，尤其是耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)。耐藥菌株的出現(xiàn)，給臨床抗感染治療造成極大困難。本文旨在比較我院患者M(jìn)RS對利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧、利福平、左氧氟沙星的耐藥性，為臨床預(yù)防、治療該菌感染提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株 選擇我院2007年12月至2008年5月門診及住院患者送檢的標(biāo)本(包括分泌物、膿、痰、血液、尿液、腦脊液等)，臨床分離MRS 31株，按CLSI標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，葡萄球菌用頭孢西丁紙片法檢測出MRS。

1.2 試劑 利奈唑胺(30 μg/片)紙片購自英國OXOID公司，替考拉寧(30μg/片)、利福平(5μg/片)、左氧氟沙星(5μg/片)、頭孢西丁(30μg/片)紙片購自北京天壇微生物技術(shù)開發(fā)公司，萬古霉素(30 μg/片)紙片以及藥敏培養(yǎng)基(MH瓊脂)購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 方法 紙片擴(kuò)散法按CLSI標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程進(jìn)行，MRSA:頭孢西丁的抑菌圈直徑≤19 mm為耐藥;MRCNS:頭孢西丁的抑菌圈直徑≤24 mm為耐藥。采用Kerby-Bauer紙片擴(kuò)散法進(jìn)行測定所有菌株對利奈唑胺等5種抗菌藥物的耐藥性。在MH平板上涂布0.5麥?zhǔn)蠁挝坏拇龣z細(xì)菌后，用藥敏紙片專用加樣器將藥敏紙片均勻分散放置在平板上，35℃培養(yǎng)18～24 h。精確量取(坐標(biāo)紙量取法，量3次取其平均值)抑菌圈直徑，以ATCC25923為質(zhì)控菌株，藥敏結(jié)果依據(jù)CLSI/NCCLS(2006年)判斷。

2 結(jié)果

K-B法測得31株MRS對5種抗菌藥物的抑菌圈情況:利奈唑胺與萬古霉素、替考拉寧敏感率均為100%，利福平敏感率為45.16%，左氧氟沙星敏感率為16.13%。利奈唑胺與萬古霉素、替考拉寧抗菌效果優(yōu)于其他2種藥物。見表1、2。

3 討論

細(xì)菌耐藥性已成為全球醫(yī)藥界關(guān)注的問題，具有重要臨床意義的耐藥菌有青霉素耐藥的肺炎鏈球菌、甲氧西林耐藥的葡萄球菌、萬古霉素耐藥的腸球菌、β-內(nèi)酰胺類抗生素耐藥的革蘭氏陰性桿菌。這些耐藥菌不僅呈逐年上升趨勢，并且常為多重耐藥菌株，致使這些菌種所致感染的治療成為臨床上的難題，對感染患者的健康和生命直接構(gòu)成威脅，因此控制和減緩耐藥細(xì)菌的增長已成當(dāng)務(wù)之急。

表1 5種藥物對MRS的抑菌圈直徑 mm

表2 MRS對5種藥物的敏感性 n=31，株(%)

MRS包括MRSA和MRCNS。MRS對甲氧西林的耐藥性主要是由PBP2α所介導(dǎo)的。編碼PBP2α，從而介導(dǎo)葡萄球菌對甲氧西林耐藥性的是位于細(xì)菌染色體上的mecA基因，這種基因只存在于MRS中。葡萄球菌耐藥機(jī)制比較復(fù)雜，主要通過質(zhì)粒介導(dǎo)、靶位改變、競爭結(jié)合位點(diǎn)，改變核糖體結(jié)構(gòu)和DNA促螺旋酶與拓?fù)洚悩?gòu)酶的變異及主動外排系統(tǒng)的參與而使其耐藥性增加;耐藥質(zhì)粒不但可在同種菌間傳播，也可在不同細(xì)菌間傳播，導(dǎo)致耐藥迅速廣泛的散布，這也是細(xì)菌耐藥性不斷增強(qiáng)的重要原因［1］。葡萄球菌對甲氧西林的耐藥是由于其攜帶的mecA基因所表達(dá)的一種低親和力的青霉素結(jié)合蛋白PBP2α造成的，mecA基因位于一個稱為葡萄球菌盒式染色體(staphylococcal cassette chromosome，SCC)的移動基因組件上［2］。本次檢測耐甲氧西林葡萄球菌時采用頭孢西丁紙片法。耐甲氧西林葡萄球菌檢測方法很多，有頭孢西丁紙片法、苯唑西林紙片法、苯唑西林-鹽瓊脂篩選法、PBP2α膠乳凝集法等表型檢測，還有PCR、探針雜交法快速檢測。苯唑西林法隨著β-內(nèi)酰胺酶含量增加被破壞導(dǎo)致假陽性發(fā)生;苯唑西林不能檢測異質(zhì)性MRSA，因?yàn)閷Υ蠖鄶?shù)非β-內(nèi)酰胺類抗生素表現(xiàn)為敏感而被認(rèn)為是甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌(MSSA)［3］導(dǎo)致MRSA漏檢。苯唑西林-鹽瓊脂篩選法簡便可行，敏感度極高，常用作校正其他方法的標(biāo)準(zhǔn);本法因氯化鈉濃度高(40 g/L)，造成高滲環(huán)境，時間延長至48 h，MSSA易產(chǎn)生大量β-內(nèi)酰胺酶緩慢水解苯唑西林，致細(xì)菌生長，檢測特異性下降。PBP2α膠乳凝集法簡便、快速、準(zhǔn)確，檢測全程只需15 min，但由于檢測試劑依賴進(jìn)口費(fèi)用昂貴，限制了在臨床中的應(yīng)用。PCR檢測mecA基因，雖然會有基因不表達(dá)的情況，但對作為分子標(biāo)志的mecA基因的檢測仍是目前認(rèn)為最可靠的檢測方法，是判定MRSA和MRCNS的金標(biāo)準(zhǔn)［4］。MecA基因檢測(PCR法)和頭孢西丁紙片擴(kuò)散法檢測MRSA、MRCNS的陽性率無差別。探針雜交法目前還處于研究階段，還未應(yīng)用于臨床。頭孢西丁更易誘導(dǎo)mecA基因的表達(dá)。在紙片擴(kuò)散試驗(yàn)中無中介類別，易判讀終點(diǎn)，是臨床應(yīng)用的首選方法［5，6］。

利奈唑胺與50 S核糖體亞基的特殊位點(diǎn)結(jié)合，不可逆地阻止蛋白合成初期絡(luò)合物的形成，盡管其結(jié)合位點(diǎn)與氯霉素和林可霉素相近(均作用于細(xì)菌50 S核糖體亞單位)，終止蛋白合成。但他們的作用機(jī)制不同，氯霉素抑制肽鍵的形成，利奈唑胺作用于翻譯起始階段，干擾包含mRNA、30 S核糖體、起始因子和fMet-tRNA等復(fù)合物的形成，從而抑制細(xì)菌合成蛋白，以往的抗菌藥物均未將此階段作為抑制生物蛋白合成的靶位［7，8］，這種不同的作用機(jī)制使利奈唑胺與氯霉素和林可霉素之間不易產(chǎn)生交叉耐藥性。萬古霉素和替考拉寧屬于糖肽類抗生素，結(jié)構(gòu)基本骨架相同。從部分文獻(xiàn)的結(jié)果及目前臨床耐藥菌株的分布情況看，萬古霉素是MRSA及MRSE感染所致疾病的首選藥物，但是，近年來，不斷有報(bào)道MRSA對萬古霉素敏感性降低，而且Garrett等［9］先后報(bào)道表皮葡萄球菌與溶血葡萄球菌對萬古霉素敏感性降低。替考拉寧主要用于治療革蘭陽性細(xì)菌的感染，是目前臨床上為數(shù)不多的仍對多重耐藥葡萄球菌和腸球菌具有抗菌活性的藥物之一。有學(xué)者認(rèn)為，由于萬古霉素大量應(yīng)用于對MRS感染的治療，可能會導(dǎo)致MRS對萬古霉素敏感性的下降并最終對萬古霉素的耐藥，因而交替使用利奈唑胺、萬古霉素和替考拉寧可能會延緩這種耐藥情況的出現(xiàn)［10］。

國外在一項(xiàng)院內(nèi)獲得性MRS感染的隨機(jī)研究中發(fā)現(xiàn)，治療組給予利奈唑胺600 mg，靜脈注射，12 h/次;對照組給予萬古霉素1 g，靜脈注射，12 h/次。其主要感染部位為肺和皮膚軟組織。結(jié)果，MRSA的治療有效率分別為78.5%(51/65)和72.2%(57/79)。2 組的胃腸外給藥時間(5.4 d 和 14.8 d，P＜0.01)和住院時間(8 d和16 d，P＜0.01)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［11］。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室采用K-B法檢測藥物對MRS抑菌圈大小分析利奈唑胺的作用效果優(yōu)于萬古霉素。

從本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果綜合分析利奈唑胺抑菌圈明顯大于其他幾種藥物，甚至有的抑菌圈是敏感界限的兩倍，鑒于這種情況的存在，因此建議給臨床提供藥敏結(jié)果是不能單純報(bào)告敏感、中敏和耐藥，而是用最新的一種提法極度敏感、高度敏感、敏感、中度敏感和耐藥來報(bào)告結(jié)果，以便為臨床治療提供更好的用藥信息，延緩藥物耐藥性的產(chǎn)生。

針對近年來葡萄球菌耐藥性越來越嚴(yán)重，我們要對細(xì)菌耐藥性提高重視，用藥前進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及其藥敏試驗(yàn)，合理使用抗生素，延緩或避免細(xì)菌對一種又一種抗生素耐藥。有人提倡，在可能情況下，應(yīng)選用喹諾酮類藥物，如左氧氟沙星、利福平、呋喃妥因等聯(lián)合治療多重耐藥MRS，在這些藥物治療失敗后，再選用萬古霉素等藥物［12］。臨床檢驗(yàn)工作者在實(shí)驗(yàn)工作中應(yīng)增加藥敏試驗(yàn)的抗生素品種，為臨床醫(yī)生提供更合適的敏感抗生素，這樣才能保證治療效果以及防止耐藥菌株的進(jìn)一步增加。通過實(shí)驗(yàn)室對5種藥物抑菌圈大小分析發(fā)現(xiàn)利奈唑胺、萬古霉素、替考拉寧為治療MRS的首選藥物。

1 何代平，胡美玲，央娜，等.高原地區(qū)醫(yī)院耐甲氧西林葡萄球菌感染及其耐藥譜分析.高原醫(yī)學(xué)雜志，2005，15:57-59.

2 周義正，李向陽，楊錦紅，等.臨床分離葡萄球菌中mecR1和mecI基因突變?nèi)笔а芯?醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36:46-49.

3 Felten A，Grandry B，Lagrange PH，et al.Evalution of three techniques for detection of low-level methicillin-resistant Staphylococcus aureus:a disk difusion method with cefoxitin and moxalactam，the Vitek 2 system，and the MRSA-Screen latex agglutination test.J Clin Microbiol，2002，40:2766-2771.

4 沈定霞，羅燕萍，張有江，等.我院近十年細(xì)菌流行分布及耐藥性監(jiān)測.中華臨床醫(yī)藥衛(wèi)生雜志，2004，2:15-18.

5 宋焰桃，徐元宏.四種初篩試驗(yàn)檢測耐甲氧西林葡萄球菌的評價(jià).熱帶醫(yī)學(xué)雜志，2007，7:1170-1172.

6 楊錦紅，周義正，朱敏敏，等.基因擴(kuò)增和3種表型篩查法檢測耐甲氧西林葡萄球菌的應(yīng)用評價(jià).醫(yī)學(xué)研究雜志，2007，36:42-45.

7 Linden P.Ues of linezolid for gram-positive infections.Infect Med，2002，19:25-32.

8 Sisson TL，Jungnluth GL，Hopkins NK.Age and sex effects on the pharmacokinetics of linezolid.Eur J Clin Pharmacol，2002，57:793-797.

9 Garrett DO，Tochimsen E，Murfitt K，et al.The emergence of aecreased susceptibicity to oancomycin in Staphy Cococcus epidermidis.Infect Control Hosp Epidemiol，1999，20:167-170.

10 逢崇杰，鞏路，田彬，等.替考拉寧和萬古霉素對臨床分離耐甲氧西林葡萄球菌體外抗菌活性比較.中國抗感染化療雜志，2005，5:360-361.

11 Linden P.Use of linezolid for Gram-positive infections.Infect Med，2002，19:25.

12 余方友，胡龍華，譚絲明，等.金黃色葡萄球菌臨床分離株的耐藥譜變遷分析.中華傳染病雜志，2004，22:57-60.