梁晶晶 ,鄭衛(wèi)衛(wèi) ,趙 碩 ,張大偉 ,2*
(1.青島根源生物技術(shù)集團有限公司,山東青島 266111;2.齊魯工業(yè)大學(xué),山東濟南 250353)
芽孢桿菌在動物上應(yīng)用主要依賴其在腸道或環(huán)境中繁殖分泌消化酶、維生素或抗菌物質(zhì)而達到益生的功能。同一菌株在不同生長環(huán)境中繁殖和分泌產(chǎn)物能力有很大差異,不同菌株之間的生長潛力和分泌產(chǎn)物類別同樣有較大差異。本文主要探究枯草與解淀粉芽孢桿菌的生理生化指標差異,及枯草、地衣與解淀粉芽孢桿菌低溫生長和平板上的產(chǎn)酶比較,以期探尋三類芽孢之間性能差異的規(guī)律,為其在動物養(yǎng)殖中的應(yīng)用方案提供菌株性能基礎(chǔ)數(shù)據(jù)指導(dǎo)。
1.1 菌種 芽孢桿菌菌種來源見表1。
1.2 培養(yǎng)基 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:取33 g營養(yǎng)瓊脂粉(北京陸橋)溶于1 L蒸餾水中,121℃滅菌30 min。
LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.0,用蒸餾水定容至1 L,121℃滅菌30 min。
表1 評估的芽孢桿菌菌種來源
酪素培養(yǎng)基:干酪素10 g,酵母膏1 g,瓊脂20 g,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.0,用蒸餾水定容至1 L,121℃滅菌30 min。
淀粉培養(yǎng)基:可溶性淀粉2 g,蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.2,用蒸餾水定容至1 L,121℃滅菌30 min。
1.3 染色液 酸性汞試劑:HgCl215 g,濃HCl 20 mL,加蒸餾水至100 mL。
盧哥氏碘液:碘片1 g,碘化鉀2 g。先將碘化鉀溶解在少量水中,再將碘片溶解在碘化鉀中,待碘全溶后,加蒸餾水至300 mL。
1.4 試驗方法
1.4.1 生理生化指標測定 將枯草芽孢桿菌1號和3號、解淀粉芽孢桿菌1號進行7%氯化鈉生長、V-P測定、硝酸鹽還原、D-甘露醇發(fā)酵、丙酸鹽利用試驗,方法參考《GB/T 26428-2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測》。
1.4.2 生長曲線制作 從-80℃冰箱取出保種甘油管,用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液,采用劃線法接種到營養(yǎng)瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。從平板上挑取一環(huán)菌苔,接種到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,作為種子。
將種子液按3%接種量接種到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基中,15℃或28℃、200 r/min連續(xù)培養(yǎng)24~80 h,每隔4~8 h在超凈工作臺進行取樣,采用分光光度計測定600 nm處吸光值,如菌液過濃,用純凈水進行適當稀釋,吸光值控制在0.3~0.6,用相應(yīng)稀釋倍數(shù)的LB培養(yǎng)基作為對照。以培養(yǎng)時間t為橫坐標,吸光值OD600為縱坐標,制作生長曲線圖。
1.4.3 產(chǎn)酶性能測定 使用滅菌牙簽挑取平板上的單菌落,分別點種在酪素培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。
通過酪素培養(yǎng)基觀察產(chǎn)蛋白酶的能力,該培養(yǎng)基一般呈乳白色,菌株生長中產(chǎn)蛋白酶后菌落周圍因蛋白被分解,乳白色褪掉而呈現(xiàn)透明,肉眼初步觀察可見隱約的透明圈,在菌落周圍滴加適量酸性汞試劑后,未被降解的蛋白遇酸性汞試劑變性,培養(yǎng)基底色白色加重,透明圈會更加明顯,采用游標卡尺測量菌落及透明圈直徑的大小。
通過淀粉培養(yǎng)基觀察產(chǎn)淀粉酶的能力,該培養(yǎng)基一般無色透明,滴加盧哥氏碘液,輕搖平皿,使碘液鋪滿培養(yǎng)基表面,等待片刻,培養(yǎng)基中未被降解的淀粉遇碘變藍,菌落周圍淀粉被降解的的地方出現(xiàn)透明圈,同樣采用游標卡尺測量菌落及透明圈直徑的大小。
酶活力大小采用透明圈與菌落直徑的比值表示,比值越大,表示該芽孢桿菌產(chǎn)酶的活力越大。
2.1 生理生化指標測定結(jié)果 試驗結(jié)果表明,枯草1號、枯草3號和解淀粉1號三株菌都可在7%氯化鈉培養(yǎng)基中生長。V-P測定三株芽孢桿菌都為陽性,枯草3顏色最深。硝酸鹽還原測定中三株菌菌液濃度都較濃,紅色不易觀察,將發(fā)酵液稀釋十倍后紅色更明顯,觀察更方便,結(jié)果顯示三株菌均為硝酸鹽還原陽性。發(fā)酵D-甘露醇產(chǎn)酸驗證試驗表明,三株菌都可發(fā)酵D-甘露醇產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變黃。試驗中將三株芽孢桿菌接種在丙酸鹽培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng)后其顏色均為深綠色,與對照組無顯著差異,說明三株菌都不能利用丙酸鹽。
2.2 生長曲線
2.2.1 15℃生長曲線 試驗測定了芽孢桿菌在低溫(15℃)下生長情況,每隔8 h取樣測定吸光值,共培養(yǎng)80 h。試驗表明,兩株解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌1號在低溫條件下生長好于其余兩株枯草和地衣芽孢桿菌。隨著時間延長,枯草芽孢桿菌1號的生物量最大,在72 h OD600達到8.0,兩株解淀粉芽孢桿菌最高OD600也出現(xiàn)在48 h以后,最高值為3.8~4.4??莶菅挎邨U菌2號和3號在15℃下生長情況較差,48 h后才進入對數(shù)生長期,而兩株地衣芽孢桿菌生物量80 h內(nèi)一直低于1.0。綜上,試驗中兩株解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌1號相較于其他四株芽孢桿菌更能耐受低溫,較適宜在低溫水產(chǎn)養(yǎng)殖水體應(yīng)用(圖1和圖2)。
圖1 枯草芽孢桿菌15℃生長曲線
圖2 地衣和解淀粉芽孢桿菌15℃生長曲線
2.2.2 28℃生長曲線 芽孢桿菌在28℃下生長較為迅速,所評估的7株芽孢桿菌都在4 h內(nèi)進入對數(shù)生長期,24 h即可到達穩(wěn)定期,生長明顯快于低溫下。但研究表明,枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌28℃下最高OD600值均低于15℃,因此,同一株菌28℃時最高生物量不一定高于15℃。地衣芽孢桿菌在低溫下生長最差的狀態(tài),在28℃下長勢甚至好于解淀粉芽孢桿菌和部分枯草芽孢桿菌(圖3和圖4)。
圖3 枯草芽孢桿菌28℃生長曲線
圖4 地衣和解淀粉芽孢桿菌28℃生長曲線
2.3 產(chǎn)酶性能測定結(jié)果 試驗表明,這7株芽孢桿菌都能在酪素培養(yǎng)基以及淀粉培養(yǎng)基上生長并分解蛋白或淀粉,加入相應(yīng)指示劑后出現(xiàn)透明圈。通過透明圈與菌落直徑比值可知,這7株芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力由大到小排序為:解淀粉2>解淀粉1>枯草2>枯草3>地衣1>地衣 2>枯草1;產(chǎn)淀粉酶能力大小排序為:解淀粉2>枯草3>解淀粉1>枯草1>枯草2>地衣2>地衣1??梢园l(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌2號產(chǎn)兩種胞外酶能力最強,兩株地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶能力不占優(yōu)勢(表2)。
表2 芽孢桿菌產(chǎn)酶能力測定結(jié)果
研究表明,枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌16S rDNA同源性較高,通過簡單的測序鑒定也無法準確確定種屬,需通過特性基因進行分析確定。盧娟等(2013)利用基因yyaR、tetB在解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中排列順序的差異,利用引物yyaR-F/tetB-R對疑似解淀粉芽孢桿菌菌株進行了分類鑒定。湯際亮等(2013)根據(jù)生理、生化反應(yīng)和菌株gyrB基因序列鑒定了枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌,表明試驗獺兔個體盲腸中解淀粉芽孢桿菌的數(shù)量多于枯草芽孢桿菌。劉勇等(2010)根據(jù)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌基因組中β-甘露聚糖酶基因(gmuG或ydhT)上下游序列,設(shè)計了特異引物,通過特異PCR方法對33株枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進行有效的鑒定區(qū)分。本研究結(jié)果顯示,通過簡單生理生化指標無法區(qū)分枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌,與董靖等(2016)的結(jié)論一致,表明在解淀粉芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)中需結(jié)合特性基因進行亞種鑒定。
生長曲線是描述生物生長繁殖變化的曲線(王宏偉,1994),其可反映細菌在不同的培養(yǎng)條件下所表現(xiàn)出的生長規(guī)律和繁殖特點,細菌生長曲線的繪制方法有很多,有血細胞計數(shù)法、活菌計數(shù)法、稱重法、分光光度法等。在嚴格控制培養(yǎng)條件的前提下,可通過測定培養(yǎng)液的OD值判斷細菌是否進入對數(shù)生長期及細菌生物量變化(何嵐等,2017)。本研究結(jié)果顯示,溫度對芽孢桿菌的繁殖影響很大,28℃時4 h內(nèi)即進入對數(shù)生長期,15℃時24 h后才進入對數(shù)生長期;同一溫度下三種菌之間及不同亞株之間生長情況差異顯著 (P≤0.05);研究發(fā)現(xiàn)15℃生長不好的地衣芽孢桿菌在28℃下卻生長較好,所評估的所有枯草和解淀粉芽孢桿菌28℃時最高生物量均低于15℃。綜上說明,要在某一特定動物或環(huán)境飼喂或使用芽孢桿菌制劑,需提前對其生長繁殖規(guī)律進行探究,以免因環(huán)境不適宜造成繁殖較差而起不到效果。此外,在15℃下應(yīng)用芽孢桿菌可加大使用量,縮短其進入對數(shù)生長期的時間,但一旦繁殖起來,投加頻率卻不一定比溫度高時頻繁。
產(chǎn)生多種酶、促進動物對飼料營養(yǎng)的消化吸收是益生芽孢桿菌發(fā)揮益生作用的機制之一,有研究表明,枯草芽孢桿菌對動物日糧的消化效果明顯優(yōu)于地衣芽孢桿菌(陶榮霞,2012)。對芽孢桿菌產(chǎn)酶特性的研究可采用模擬消化法(劉秀俠等,2017;程德勇等,2014)和平板透明圈法(程德勇等,2014;徐良玉,2003)。本文采用平板透明圈法比較了待測芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力,結(jié)果顯示在產(chǎn)酶方面除枯草3號的產(chǎn)淀粉酶能力較突出外,參與測試的其他枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌產(chǎn)兩種酶能力相近,均不及解淀粉芽孢桿菌。本研究以酪素作為蛋白、以可溶性淀粉(α-淀粉)作為淀粉進行分解蛋白和淀粉性能評估,結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌性能最優(yōu),但因不同飼料原料所含蛋白、淀粉的種類不同,對具體原料的分解效果需進一步進行評估。
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