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    幾株芽孢桿菌的生理生化、生長(zhǎng)和產(chǎn)酶特性研究

    2018-07-05 03:11:58梁晶晶鄭衛(wèi)衛(wèi)張大偉
    中國(guó)飼料 2018年11期
    關(guān)鍵詞:生長(zhǎng)

    梁晶晶 ,鄭衛(wèi)衛(wèi) ,趙 碩 ,張大偉 ,2*

    (1.青島根源生物技術(shù)集團(tuán)有限公司,山東青島 266111;2.齊魯工業(yè)大學(xué),山東濟(jì)南 250353)

    芽孢桿菌在動(dòng)物上應(yīng)用主要依賴(lài)其在腸道或環(huán)境中繁殖分泌消化酶、維生素或抗菌物質(zhì)而達(dá)到益生的功能。同一菌株在不同生長(zhǎng)環(huán)境中繁殖和分泌產(chǎn)物能力有很大差異,不同菌株之間的生長(zhǎng)潛力和分泌產(chǎn)物類(lèi)別同樣有較大差異。本文主要探究枯草與解淀粉芽孢桿菌的生理生化指標(biāo)差異,及枯草、地衣與解淀粉芽孢桿菌低溫生長(zhǎng)和平板上的產(chǎn)酶比較,以期探尋三類(lèi)芽孢之間性能差異的規(guī)律,為其在動(dòng)物養(yǎng)殖中的應(yīng)用方案提供菌株性能基礎(chǔ)數(shù)據(jù)指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種 芽孢桿菌菌種來(lái)源見(jiàn)表1。

    1.2 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基:取33 g營(yíng)養(yǎng)瓊脂粉(北京陸橋)溶于1 L蒸餾水中,121℃滅菌30 min。

    LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.0,用蒸餾水定容至1 L,121℃滅菌30 min。

    表1 評(píng)估的芽孢桿菌菌種來(lái)源

    酪素培養(yǎng)基:干酪素10 g,酵母膏1 g,瓊脂20 g,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.0,用蒸餾水定容至1 L,121℃滅菌30 min。

    淀粉培養(yǎng)基:可溶性淀粉2 g,蛋白胨10 g,牛肉膏5 g,氯化鈉5 g,瓊脂20 g,用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié) pH為7.2,用蒸餾水定容至1 L,121℃滅菌30 min。

    1.3 染色液 酸性汞試劑:HgCl215 g,濃HCl 20 mL,加蒸餾水至100 mL。

    盧哥氏碘液:碘片1 g,碘化鉀2 g。先將碘化鉀溶解在少量水中,再將碘片溶解在碘化鉀中,待碘全溶后,加蒸餾水至300 mL。

    1.4 試驗(yàn)方法

    1.4.1 生理生化指標(biāo)測(cè)定 將枯草芽孢桿菌1號(hào)和3號(hào)、解淀粉芽孢桿菌1號(hào)進(jìn)行7%氯化鈉生長(zhǎng)、V-P測(cè)定、硝酸鹽還原、D-甘露醇發(fā)酵、丙酸鹽利用試驗(yàn),方法參考《GB/T 26428-2010飼用微生物制劑中枯草芽孢桿菌的檢測(cè)》。

    1.4.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)制作 從-80℃冰箱取出保種甘油管,用接種環(huán)挑取一環(huán)菌液,采用劃線(xiàn)法接種到營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上,37℃培養(yǎng)至出現(xiàn)單菌落。從平板上挑取一環(huán)菌苔,接種到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基中,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,作為種子。

    將種子液按3%接種量接種到盛有100 mL LB液體培養(yǎng)基中,15℃或28℃、200 r/min連續(xù)培養(yǎng)24~80 h,每隔4~8 h在超凈工作臺(tái)進(jìn)行取樣,采用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm處吸光值,如菌液過(guò)濃,用純凈水進(jìn)行適當(dāng)稀釋?zhuān)庵悼刂圃?.3~0.6,用相應(yīng)稀釋倍數(shù)的LB培養(yǎng)基作為對(duì)照。以培養(yǎng)時(shí)間t為橫坐標(biāo),吸光值OD600為縱坐標(biāo),制作生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖。

    1.4.3 產(chǎn)酶性能測(cè)定 使用滅菌牙簽挑取平板上的單菌落,分別點(diǎn)種在酪素培養(yǎng)基和淀粉培養(yǎng)基上,37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

    通過(guò)酪素培養(yǎng)基觀察產(chǎn)蛋白酶的能力,該培養(yǎng)基一般呈乳白色,菌株生長(zhǎng)中產(chǎn)蛋白酶后菌落周?chē)虻鞍妆环纸?,乳白色褪掉而呈現(xiàn)透明,肉眼初步觀察可見(jiàn)隱約的透明圈,在菌落周?chē)渭舆m量酸性汞試劑后,未被降解的蛋白遇酸性汞試劑變性,培養(yǎng)基底色白色加重,透明圈會(huì)更加明顯,采用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落及透明圈直徑的大小。

    通過(guò)淀粉培養(yǎng)基觀察產(chǎn)淀粉酶的能力,該培養(yǎng)基一般無(wú)色透明,滴加盧哥氏碘液,輕搖平皿,使碘液鋪滿(mǎn)培養(yǎng)基表面,等待片刻,培養(yǎng)基中未被降解的淀粉遇碘變藍(lán),菌落周?chē)矸郾唤到獾牡牡胤匠霈F(xiàn)透明圈,同樣采用游標(biāo)卡尺測(cè)量菌落及透明圈直徑的大小。

    酶活力大小采用透明圈與菌落直徑的比值表示,比值越大,表示該芽孢桿菌產(chǎn)酶的活力越大。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 生理生化指標(biāo)測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果表明,枯草1號(hào)、枯草3號(hào)和解淀粉1號(hào)三株菌都可在7%氯化鈉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。V-P測(cè)定三株芽孢桿菌都為陽(yáng)性,枯草3顏色最深。硝酸鹽還原測(cè)定中三株菌菌液濃度都較濃,紅色不易觀察,將發(fā)酵液稀釋十倍后紅色更明顯,觀察更方便,結(jié)果顯示三株菌均為硝酸鹽還原陽(yáng)性。發(fā)酵D-甘露醇產(chǎn)酸驗(yàn)證試驗(yàn)表明,三株菌都可發(fā)酵D-甘露醇產(chǎn)酸使培養(yǎng)基變黃。試驗(yàn)中將三株芽孢桿菌接種在丙酸鹽培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng)后其顏色均為深綠色,與對(duì)照組無(wú)顯著差異,說(shuō)明三株菌都不能利用丙酸鹽。

    2.2 生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    2.2.1 15℃生長(zhǎng)曲線(xiàn) 試驗(yàn)測(cè)定了芽孢桿菌在低溫(15℃)下生長(zhǎng)情況,每隔8 h取樣測(cè)定吸光值,共培養(yǎng)80 h。試驗(yàn)表明,兩株解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌1號(hào)在低溫條件下生長(zhǎng)好于其余兩株枯草和地衣芽孢桿菌。隨著時(shí)間延長(zhǎng),枯草芽孢桿菌1號(hào)的生物量最大,在72 h OD600達(dá)到8.0,兩株解淀粉芽孢桿菌最高OD600也出現(xiàn)在48 h以后,最高值為3.8~4.4。枯草芽孢桿菌2號(hào)和3號(hào)在15℃下生長(zhǎng)情況較差,48 h后才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,而兩株地衣芽孢桿菌生物量80 h內(nèi)一直低于1.0。綜上,試驗(yàn)中兩株解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌1號(hào)相較于其他四株芽孢桿菌更能耐受低溫,較適宜在低溫水產(chǎn)養(yǎng)殖水體應(yīng)用(圖1和圖2)。

    圖1 枯草芽孢桿菌15℃生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    圖2 地衣和解淀粉芽孢桿菌15℃生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    2.2.2 28℃生長(zhǎng)曲線(xiàn) 芽孢桿菌在28℃下生長(zhǎng)較為迅速,所評(píng)估的7株芽孢桿菌都在4 h內(nèi)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,24 h即可到達(dá)穩(wěn)定期,生長(zhǎng)明顯快于低溫下。但研究表明,枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌28℃下最高OD600值均低于15℃,因此,同一株菌28℃時(shí)最高生物量不一定高于15℃。地衣芽孢桿菌在低溫下生長(zhǎng)最差的狀態(tài),在28℃下長(zhǎng)勢(shì)甚至好于解淀粉芽孢桿菌和部分枯草芽孢桿菌(圖3和圖4)。

    圖3 枯草芽孢桿菌28℃生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    圖4 地衣和解淀粉芽孢桿菌28℃生長(zhǎng)曲線(xiàn)

    2.3 產(chǎn)酶性能測(cè)定結(jié)果 試驗(yàn)表明,這7株芽孢桿菌都能在酪素培養(yǎng)基以及淀粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并分解蛋白或淀粉,加入相應(yīng)指示劑后出現(xiàn)透明圈。通過(guò)透明圈與菌落直徑比值可知,這7株芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶能力由大到小排序?yàn)椋航獾矸?>解淀粉1>枯草2>枯草3>地衣1>地衣 2>枯草1;產(chǎn)淀粉酶能力大小排序?yàn)椋航獾矸?>枯草3>解淀粉1>枯草1>枯草2>地衣2>地衣1??梢园l(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌2號(hào)產(chǎn)兩種胞外酶能力最強(qiáng),兩株地衣芽孢桿菌產(chǎn)酶能力不占優(yōu)勢(shì)(表2)。

    表2 芽孢桿菌產(chǎn)酶能力測(cè)定結(jié)果

    3 討論

    研究表明,枯草芽孢桿菌與解淀粉芽孢桿菌16S rDNA同源性較高,通過(guò)簡(jiǎn)單的測(cè)序鑒定也無(wú)法準(zhǔn)確確定種屬,需通過(guò)特性基因進(jìn)行分析確定。盧娟等(2013)利用基因yyaR、tetB在解淀粉芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌中排列順序的差異,利用引物yyaR-F/tetB-R對(duì)疑似解淀粉芽孢桿菌菌株進(jìn)行了分類(lèi)鑒定。湯際亮等(2013)根據(jù)生理、生化反應(yīng)和菌株gyrB基因序列鑒定了枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌,表明試驗(yàn)獺兔個(gè)體盲腸中解淀粉芽孢桿菌的數(shù)量多于枯草芽孢桿菌。劉勇等(2010)根據(jù)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌基因組中β-甘露聚糖酶基因(gmuG或ydhT)上下游序列,設(shè)計(jì)了特異引物,通過(guò)特異PCR方法對(duì)33株枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行有效的鑒定區(qū)分。本研究結(jié)果顯示,通過(guò)簡(jiǎn)單生理生化指標(biāo)無(wú)法區(qū)分枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌,與董靖等(2016)的結(jié)論一致,表明在解淀粉芽孢桿菌的工業(yè)化生產(chǎn)中需結(jié)合特性基因進(jìn)行亞種鑒定。

    生長(zhǎng)曲線(xiàn)是描述生物生長(zhǎng)繁殖變化的曲線(xiàn)(王宏偉,1994),其可反映細(xì)菌在不同的培養(yǎng)條件下所表現(xiàn)出的生長(zhǎng)規(guī)律和繁殖特點(diǎn),細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)的繪制方法有很多,有血細(xì)胞計(jì)數(shù)法、活菌計(jì)數(shù)法、稱(chēng)重法、分光光度法等。在嚴(yán)格控制培養(yǎng)條件的前提下,可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD值判斷細(xì)菌是否進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及細(xì)菌生物量變化(何嵐等,2017)。本研究結(jié)果顯示,溫度對(duì)芽孢桿菌的繁殖影響很大,28℃時(shí)4 h內(nèi)即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,15℃時(shí)24 h后才進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期;同一溫度下三種菌之間及不同亞株之間生長(zhǎng)情況差異顯著 (P≤0.05);研究發(fā)現(xiàn)15℃生長(zhǎng)不好的地衣芽孢桿菌在28℃下卻生長(zhǎng)較好,所評(píng)估的所有枯草和解淀粉芽孢桿菌28℃時(shí)最高生物量均低于15℃。綜上說(shuō)明,要在某一特定動(dòng)物或環(huán)境飼喂或使用芽孢桿菌制劑,需提前對(duì)其生長(zhǎng)繁殖規(guī)律進(jìn)行探究,以免因環(huán)境不適宜造成繁殖較差而起不到效果。此外,在15℃下應(yīng)用芽孢桿菌可加大使用量,縮短其進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間,但一旦繁殖起來(lái),投加頻率卻不一定比溫度高時(shí)頻繁。

    產(chǎn)生多種酶、促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料營(yíng)養(yǎng)的消化吸收是益生芽孢桿菌發(fā)揮益生作用的機(jī)制之一,有研究表明,枯草芽孢桿菌對(duì)動(dòng)物日糧的消化效果明顯優(yōu)于地衣芽孢桿菌(陶榮霞,2012)。對(duì)芽孢桿菌產(chǎn)酶特性的研究可采用模擬消化法(劉秀俠等,2017;程德勇等,2014)和平板透明圈法(程德勇等,2014;徐良玉,2003)。本文采用平板透明圈法比較了待測(cè)芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶和淀粉酶能力,結(jié)果顯示在產(chǎn)酶方面除枯草3號(hào)的產(chǎn)淀粉酶能力較突出外,參與測(cè)試的其他枯草芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌產(chǎn)兩種酶能力相近,均不及解淀粉芽孢桿菌。本研究以酪素作為蛋白、以可溶性淀粉(α-淀粉)作為淀粉進(jìn)行分解蛋白和淀粉性能評(píng)估,結(jié)果表明解淀粉芽孢桿菌性能最優(yōu),但因不同飼料原料所含蛋白、淀粉的種類(lèi)不同,對(duì)具體原料的分解效果需進(jìn)一步進(jìn)行評(píng)估。

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