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    不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖含量及其抗氧化活性的影響

    2018-07-05 11:42:48楊暉柯樂(lè)芹舒若男陳雨薇朱婷瑜王俊范錦濤汪亮亮
    關(guān)鍵詞:黑木耳香菇存活率

    楊暉,柯樂(lè)芹,舒若男,陳雨薇,朱婷瑜,王俊,范錦濤,汪亮亮

    (麗水學(xué)院生態(tài)學(xué)院,浙江麗水323000)

    食用菌多糖不僅在抗氧化、抗腫瘤和抗病原體等方面有顯著作用[1-2],還是一種很好的免疫調(diào)節(jié)增強(qiáng)劑[3]。近年來(lái),食用菌多糖在抗氧化和抗腫瘤方面的研究越來(lái)越受到關(guān)注[4-8]。然而,隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),食用菌多糖的含量和生物活性會(huì)發(fā)生變化。張佳欣[9]指出,茯磚茶中多糖的抗氧化能力隨著貯藏年限的增加先升后降,并在第3年達(dá)到最佳。

    HepG2細(xì)胞是廣泛應(yīng)用于癌癥機(jī)制、遺傳學(xué)和營(yíng)養(yǎng)學(xué)等研究的一類細(xì)胞株,其分化程度高,具有相對(duì)正常肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的表型,還能夠行使正常肝細(xì)胞的代謝解毒功能,分泌正常肝細(xì)胞特征的蛋白[9-10]。此外,HepG2細(xì)胞増殖能力強(qiáng),易于獲得且多次傳代后仍能保持原有的生理狀態(tài),可被用作替代肝細(xì)胞的理想細(xì)胞系[11]。過(guò)氧化氫(H2O2)是氧氣的二電子還原產(chǎn)物,是一種氧化性很強(qiáng)的活性氧[12],可以穿透大部分細(xì)胞膜,增加細(xì)胞毒性,如乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)滲漏顯著,脂質(zhì)過(guò)氧化,DNA損傷增加及還原型谷胱甘肽(glutathione reduced,GSH)水平降低[13],而且還有易于獲得、性質(zhì)比較穩(wěn)定等特點(diǎn);因此,H2O2氧化損傷模型已成為目前應(yīng)用最廣泛的一種細(xì)胞損傷模型[14]。

    之前人們對(duì)于食用菌多糖的研究主要側(cè)重于提取、純化和分離[5-6,15-17],而很少涉及不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖提取率和多糖生物活性影響的研究。因此,本文以香菇、杏鮑菇和黑木耳為研究對(duì)象,初步研究不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖提取率的影響,并建立H2O2誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞氧化損傷模型對(duì)HepG2細(xì)胞預(yù)保護(hù)再損傷,從細(xì)胞學(xué)的角度探究不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖抗氧化活性的影響,為合理確定不同食用菌貯藏年限提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    3種試驗(yàn)材料香菇808、黑木耳916和杏鮑菇kE015均由浙江百興食品有限公司提供。

    1.1.2 細(xì)胞與試劑

    人肝癌HepG2細(xì)胞系購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù);DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗溶液、0.25%胰蛋白酶[含0.5%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)]及磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)購(gòu)自美國(guó)GIBICO公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自日本同仁研究所;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所;其余藥品、試劑均為國(guó)產(chǎn),分析純。

    1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

    1.2.1 食用菌多糖的提取

    設(shè)置3×4雙因子試驗(yàn),即3種食用菌材料(香菇808、杏鮑菇kE015、黑木耳916)、4種貯藏時(shí)間(1、2、3和4年),每組試驗(yàn)重復(fù)3次。食用菌多糖含量的提取采用超聲輔助復(fù)合酶法[17]。

    具體步驟為:稱取3.00 g食用菌干粉,加入60 mL蒸餾水混合均勻,進(jìn)行超聲波細(xì)胞破碎(超聲工作5 s,間隙5 s,超聲波功率720 W,總工作時(shí)間20 min)后,置于50℃水浴0.5 h;稱取果膠酶和纖維素酶,按料液比1∶21.17、復(fù)合酶比1.96∶1加入食用菌溶液中,反應(yīng)1 h后抽濾,濾液于沸水中滅酶10 min,溫度降至室溫后,將酶提取液于5 000 r/min條件下離心5 min,取上清液,于75℃、0.09 Pa條件下濃縮到總上清液體積的2/5~1/2;加入3倍體積的95%乙醇溶液,置于4℃冰箱中靜置24 h后,取出,以4 000 r/min離心20 min;將沉淀溶解、定容、稀釋后,采用蒽酮-硫酸法測(cè)定多糖總量。

    1.2.2 食用菌多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞存活率影響的測(cè)定[18-21]

    設(shè)置3×4×4三因子試驗(yàn),即:3種食用菌材料(香菇808、杏鮑菇kE015和黑木耳916);4種貯藏時(shí)間(1、2、3和4年);給藥組(4種食用菌多糖提取物終質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1和2 mg/mL的完全培養(yǎng)液);H2O2誘導(dǎo)的對(duì)照組(加入完全培養(yǎng)液)。每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。

    望虞河常熟水利樞紐于2010年11月起開(kāi)始實(shí)施更新改造工作,改造工程于2011年3月10日前完成。改造期間常熟水利樞紐泵站無(wú)法正常投入運(yùn)用,僅能通過(guò)節(jié)制閘自引。望虞河望亭水利樞紐更新改造工程于2010年11月28日正式開(kāi)工。根據(jù)施工期工程運(yùn)行維護(hù)要求,望亭水利樞紐需開(kāi)展水下檢查暫停運(yùn)用。同時(shí),施工期間望亭水利樞紐閘門也無(wú)法全部投入運(yùn)用。

    具體操作參照CCK-8試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。將HepG2細(xì)胞以6×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板上,培養(yǎng)24 h后,換成含有食用菌多糖提取物,繼續(xù)培養(yǎng)24 h,經(jīng)PBS洗滌2次后加入60 μmol/L H2O2培養(yǎng)液作用2 h;根據(jù)CCK-8法測(cè)定各組的細(xì)胞存活率。

    1.2.3 食用菌多糖對(duì)H2O2氧化損傷的HepG2細(xì)胞中SOD、MDA、LDH水平影響的測(cè)定[19,21-23]

    設(shè)置3×4×3三因子試驗(yàn),即:3種食用菌材料(香菇808、杏鮑菇kE015和黑木耳916);4種貯藏時(shí)間(1、2、3和4年);正常對(duì)照組(加入完全培養(yǎng)液);模型組(H2O2誘導(dǎo)組,加入完全培養(yǎng)液);給藥組(食用菌多糖質(zhì)量濃度為0.5、1和2 mg/mL)。每組3個(gè)重復(fù)。

    酶活性的測(cè)定參照SOD、MDA和LDH試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,具體操作方法如下。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按5×105個(gè)/孔的密度接種于6孔板上,按上述設(shè)置的試驗(yàn)分組培養(yǎng)24 h;將苯甲基磺酰氟(phenylmethanesulfonyl fluoride,PMSF)加入細(xì)胞裂解液中,使裂解液中的PMSF最終濃度為1 mmol/L;將各組細(xì)胞消化收集到EP管中,2 000 r/min離心5 min,然后放入冰盒;棄上清液,再加入1 mL PBS,離心以去除胰酶;每管加入100 μL裂解液,渦旋混勻;于4℃、1×104g條件下離心5 min,取上清液用于各類酶活性的測(cè)定。

    1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

    采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和因子方差分析(factorial ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性分析,采用STATISTICA 8.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,顯著性水平為P<0.05。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 不同貯藏時(shí)間對(duì)食用菌多糖提取率的影響

    由圖1和表1可知:香菇多糖的提取率最高[貯藏3年的提取率為(6.92±0.18)%],杏鮑菇多糖次之,黑木耳多糖的提取率最低,且不同食用菌類型的多糖提取率存在顯著差異(P<0.05);不同貯藏時(shí)間對(duì)香菇、杏鮑菇多糖提取率的影響沒(méi)有顯著差異,但貯藏1年的黑木耳多糖提取率[(2.61±0.73)%]和貯藏3年的黑木耳多糖提取率[(1.72±0.09)%]之間差異達(dá)顯著水平(P<0.05)。

    圖1 不同貯藏時(shí)間的食用菌粗多糖的提取率Fig.1 Extraction rate of polysaccharide from edible fungi at different storage time

    表1 食用菌類型、貯藏時(shí)間及兩者的交互作用對(duì)食用菌多糖提取率的影響Table 1 Effects of edible fungi variety,storage time and their interaction on extraction rate of polysaccharides from edible fungi

    2.2 不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響

    由圖2A可知,隨著質(zhì)量濃度的增加,香菇多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響總體呈現(xiàn)增加的趨勢(shì)。而杏鮑菇和黑木耳多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)(圖2B和2C)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng),香菇多糖在0.25 mg/mL時(shí)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì),但在高質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響變化不大。貯藏時(shí)間為3年、4年的香菇多糖在質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時(shí),HepG2細(xì)胞存活率最低;貯藏時(shí)間為2年、3年的杏鮑菇多糖對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響最為明顯,均和對(duì)照存在顯著差異(P<0.05),其中以貯藏時(shí)間為3年、多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL處理組的HepG2細(xì)胞存活率最高,為(99.37±8.23)%,是對(duì)照組 HepG2細(xì)胞存活率[(51.98±7.10)%]的1.91倍,表明杏鮑菇多糖可以有效降低經(jīng)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞產(chǎn)生的氧化損傷作用。黑木耳多糖組的HepG2細(xì)胞存活率受貯藏時(shí)間變化的影響并不明顯,但不同多糖質(zhì)量濃度間存在顯著差異(P<0.05)。貯藏時(shí)間為1年的黑木耳多糖處理組的HepG2細(xì)胞存活率較低,其中1 mg/mL多糖處理組的HepG2細(xì)胞存活率最低,僅為(35.43±12.8)%;隨著貯藏年限的增加,HepG2細(xì)胞存活率有所增加,當(dāng)貯藏時(shí)間為4年、黑木耳粗多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),HepG2細(xì)胞的存活率最高,達(dá)(104.85±4.08)%,顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。

    圖2 不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖(EFP)對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of edible fungi polysaccharides(EFP)of different storage time on survival rate of HepG2 cells

    以上結(jié)果結(jié)合表2可知,杏鮑菇多糖作用的HepG2細(xì)胞存活率最高,其次是黑木耳多糖,而香菇多糖組的HepG2細(xì)胞存活率最低,且三者之間存在顯著差異(P<0.05)。不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖處理對(duì)HepG2細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)效果存在顯著差異,其中以貯藏1年的食用菌多糖處理的HepG2細(xì)胞存活率最低,且與其他貯藏時(shí)間間差異顯著(P<0.05)。不同的多糖質(zhì)量濃度對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響差異不顯著。

    2.3 不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖對(duì)HepG2細(xì)胞中SOD、MDA和LDH水平的影響

    由圖3可知,不同貯藏時(shí)間的香菇多糖顯著提高了SOD、MDA和LDH的水平,表現(xiàn)出良好的抗氧化活性(P<0.05)。貯藏時(shí)間為1年的香菇多糖對(duì)氧化損傷的保護(hù)能力優(yōu)于2年、3年和4年,其中:貯藏時(shí)間為1年、香菇多糖質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),HepG2細(xì)胞中SOD活性最高,達(dá)(2.37±0.13)U/mg;在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),HepG2細(xì)胞中MDA含量最接近空白對(duì)照組[(8.08±0.43)mmol/mg],為(8.19±0.16)mmol/mg;在質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí),HepG2細(xì)胞中LDH活性最接近對(duì)照組[(40.02±3.19)U/mg],為(46.29±4.48)U/mg。貯藏時(shí)間為3年的杏鮑菇多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的保護(hù)能力最佳,當(dāng)質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí),HepG2細(xì)胞的SOD活性最高,達(dá)(1.50±0.06)U/mg,明顯高于模型組[(0.46±0.01)U/mg];貯藏時(shí)間為3年、4年的杏鮑菇多糖組的MDA含量比1年、2年組高;但杏鮑菇多糖對(duì)LDH活性的影響不顯著。在黑木耳組中,貯藏時(shí)間為4年的黑木耳多糖在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí),HepG2細(xì)胞的SOD活性達(dá)到最高[(0.93±0.10)U/mg],MDA含量為[(10.93±0.30)mmol/mg],最接近對(duì)照組[(10.68±0.88)mmol/mg],而LDH活性最低,為[(78.11±1.57)U/mg]??傮w而言,貯藏時(shí)間為4年的黑木耳粗多糖對(duì)HepG2細(xì)胞的保護(hù)能力優(yōu)于其他3個(gè)貯藏年限。

    表2 食用菌類型、貯藏時(shí)間、多糖質(zhì)量濃度及其相互作用對(duì)HepG2細(xì)胞存活率的影響Table 2 Effects of edible fungi variety,storage time,polysaccharide concentrations and their interactions on survival rate of HepG2 cells

    從表3可知,食用菌類型、貯藏時(shí)間和多糖質(zhì)量濃度均對(duì)HepG2細(xì)胞中SOD、MDA、LDH水平的影響具有顯著差異(P<0.05)。香菇處理組的SOD活性顯著高于杏鮑菇和黑木耳,但其MDA、LDH水平顯著低于杏鮑菇和黑木耳(P<0.05),表明香菇多糖對(duì)H2O2氧化損傷作用的降低效果顯著高于杏鮑菇多糖和黑木耳多糖。在不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖組中,HepG2細(xì)胞的MDA含量存在顯著差異(P<0.05),且以貯藏3年的最高。不同多糖質(zhì)量濃度處理組的SOD活性和MDA含量存在顯著差異(P<0.05),其中高質(zhì)量濃度(1、2 mg/mL)多糖處理組的HepG2細(xì)胞的SOD活性顯著高于低質(zhì)量濃度處理組,表明高質(zhì)量濃度多糖比低質(zhì)量濃度多糖具有更佳的抗氧化效果。

    3 討論和結(jié)論

    多糖類物質(zhì)在食用菌中普遍存在,其在生物活性方面的作用越來(lái)越受到人們的重視。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn),食用菌多糖不僅具有抗癌、抗感染、抗病毒、抗衰老等多方面的藥理活性[24-26],而且具有較好的抗氧化活性,對(duì)物理、化學(xué)及生物來(lái)源的多種活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)具有良好的清除作用。而抗氧化作用是一些多糖抗衰老、降血脂、降血糖的作用機(jī)制之一[27-28]。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外已將抗氧化水平的檢測(cè)用于抗衰老等保健食品的評(píng)價(jià)中。

    本研究結(jié)果表明,在香菇、杏鮑菇和黑木耳3種食用菌中,香菇多糖的提取率顯著高于其他2種,且貯藏3年的香菇多糖提取率最高,為(6.92±0.18)%。杏鮑菇多糖降低H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的氧化損傷作用最佳,且貯藏時(shí)間為2年和3年的杏鮑菇多糖的保護(hù)效果優(yōu)于其他2個(gè)年限;不同質(zhì)量濃度的杏鮑菇多糖處理對(duì)細(xì)胞的保護(hù)效果都顯著高于對(duì)照,其中以貯藏時(shí)間3年、質(zhì)量濃度為1 mg/mL的杏鮑菇多糖的抗氧化效果最佳,其HepG2細(xì)胞存活率為(99.37±8.23)%,是模型組的1.91倍,這與杏鮑菇多糖顯著提高了SOD活性、降低了MDA含量的結(jié)果一致。在黑木耳組中,貯藏時(shí)間為1年的黑木耳多糖提取率最高[(2.61±0.73)%],貯藏3年的最低[(1.72±0.09)%];在抗氧化活性方面,貯藏4年、質(zhì)量濃度為1 mg/mL的黑木耳多糖對(duì)H2O2誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞保護(hù)作用顯著高于對(duì)照組(P<0.05),此條件還顯著提高了SOD活性、降低了MDA和LDH的水平,表現(xiàn)出最強(qiáng)的抗氧化作用。

    圖3 不同貯藏時(shí)間的食用菌多糖(EFP)對(duì)HepG2細(xì)胞中SOD、MDA和LDH水平的影響Fig.3 Effect of edible fungi polysaccharides(EFP)of different storage time on SOD,MDAand LDH levels in HepG2 cells

    張佳欣[9]在細(xì)胞抗氧化活性的研究中發(fā)現(xiàn),茯磚茶多糖表現(xiàn)出陳化時(shí)間的規(guī)律,且陳化3年對(duì)PC12細(xì)胞的保護(hù)作用最強(qiáng);本研究結(jié)果與其一致。說(shuō)明食用菌多糖具有抗氧化活性,而且其活性隨著貯藏時(shí)間的不同而變化。另外,與韓飛等[23](100 μmol/L H2O2,4 h)、羅春麗等[21](400 μmol/L H2O2,2 h)構(gòu)建的模型不同,本試驗(yàn)在建模時(shí)選取的是使HepG2細(xì)胞達(dá)到半抑制時(shí)的H2O2濃度(60 μmol/L,2 h),在此濃度下細(xì)胞處于氧化損傷而又未被完全殺死的狀態(tài),這時(shí)有損傷修復(fù)的可能性[19]。

    然而,食用菌貯藏改變其多糖活性成分的形成機(jī)制尚未見(jiàn)有相關(guān)報(bào)道,推測(cè)可能與多糖的一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,從而影響有效多糖的比例,進(jìn)而造成生物活性的差異有關(guān)。較早的研究表明:食藥用真菌的多糖結(jié)構(gòu)與功能存在一定的關(guān)系;此類多糖中活性成分的主鏈由β-(1-3)糖苷鍵相連接,側(cè)鏈由β-(1-6)糖苷鍵相連接,且該類型的多糖具有抗菌、抗腫瘤和抗病毒功效[29]。此外,多糖分子的結(jié)構(gòu)修飾可能對(duì)其生物學(xué)活性產(chǎn)生重要影響,如糖殘基上的羥基、羧基、氨基等基團(tuán)經(jīng)磺化后可增加抗人類獲得性免疫缺陷病毒(HIV)和抗腫瘤的效果[30]。

    綜上所述,食用菌多糖的提取率、抗氧化活性等會(huì)隨著食用菌的種類及貯藏年限的不同而發(fā)生改變。對(duì)于不同的食用菌多糖,在貯藏過(guò)程中發(fā)生的物質(zhì)變化及有效成分的生物活性機(jī)制還需進(jìn)一

    步深入研究。本研究為香菇、杏鮑菇、黑木耳等食用菌在生產(chǎn)實(shí)踐中優(yōu)化貯藏時(shí)間及條件、獲得良好的生產(chǎn)工藝提供了一定的參考,也為獲得更大生產(chǎn)收益提供了理論支持。

    表3 食用菌類型、貯藏時(shí)間、多糖質(zhì)量濃度及其交互作用對(duì)HepG2細(xì)胞中SOD、MDA和LDH水平的影響Table 3 Effects of edible fungi variety,storage time,polysaccharide concentrations and their interactions on SOD,MDA,and LDH levels in HepG2 cells

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