葡萄糖和茉莉酸甲酯對(duì)芥藍(lán)芽菜芥子油苷積累及其抗氧化特性的影響

苗慧瑩，陳浩，常嘉琪，王夢(mèng)雨，張芬，孫勃，汪俏梅*

（1.浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)部園藝作物生長發(fā)育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州310058；2.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都611130）

芥藍(lán)（Brassica oleracea var.alboglabra Bailey）是原產(chǎn)于中國的十字花科蕓薹屬甘藍(lán)類蔬菜，主要分布在中國南部。芥藍(lán)通常以肥嫩的花薹及嫩葉作為食用部分。如今，其芽菜由于具有高營養(yǎng)價(jià)值且富含生物活性物質(zhì)而日漸成為餐桌新寵。據(jù)報(bào)道，芥藍(lán)芽菜中芥子油苷的含量至少10倍于花薹和蓮座葉[1]。研究證明，經(jīng)常攝入芥子油苷有助于維持人體健康，降低患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)[2-4]。因此，探究有效調(diào)控芥藍(lán)芽菜中芥子油苷合成積累的化學(xué)手段，對(duì)其品質(zhì)改良具有重大意義。

芥子油苷是一類主要存在于十字花科植物中的次生代謝物質(zhì)，其含量除了受遺傳因素的影響外，還受外源信號(hào)的調(diào)節(jié)，如糖信號(hào)[5-6]和植物激素[7-10]。葡萄糖不僅是植物碳和能量的來源，也是一種重要的信號(hào)分子，在植物整個(gè)生命進(jìn)程中發(fā)揮著調(diào)控作用[11]。前期研究表明，葡萄糖可以顯著地增加擬南芥和蕓薹屬蔬菜中芥子油苷的含量[5-6,12]。植物激素對(duì)芥子油苷合成積累的調(diào)控作用也已有報(bào)道。其中，茉莉酸甲酯通過MYC-MYB模型調(diào)控?cái)M南芥中芥子油苷合成的機(jī)制已被闡明[13-14]。此外，GUO等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖與茉莉酸甲酯在擬南芥的芥子油苷合成過程中發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用。然而，葡萄糖和茉莉酸甲酯在作物中的互作研究還鮮有報(bào)道?；诖耍疚姆治隽私嫠{(lán)芽菜中葡萄糖和茉莉酸甲酯在芥子油苷合成積累過程中的作用，并探究了二者共同處理對(duì)芥藍(lán)芽菜中維生素C、花青素和多酚含量，以及總抗氧化活性的影響，以期為運(yùn)用低毒高效的化學(xué)調(diào)控手段改善蕓薹屬蔬菜中芥子油苷的組分和含量、提高營養(yǎng)品質(zhì)提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與培養(yǎng)方法

試驗(yàn)材料：所用芥藍(lán)種子為商業(yè)種“正源大筍遲花”。

培養(yǎng)方法：芥藍(lán)種子經(jīng)0.7%乙醇滅菌30 min后，用無菌蒸餾水沖洗4～5次，在25℃培養(yǎng)箱中催芽24 h后，播種在鋪有3層濕潤無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，于23℃培養(yǎng)室中進(jìn)行光照培養(yǎng)。培養(yǎng)室光周期為16 h光照/8 h黑暗。

1.2 處理方法

培養(yǎng)4 d后，在處理組培養(yǎng)皿中加入5 mL 0.03 g/mL葡萄糖溶液，或者5 mL 5 μmol/L茉莉酸甲酯溶液，或者5 mL含有5 μmol/L茉莉酸甲酯的0.03 g/mL葡萄糖溶液；在對(duì)照組培養(yǎng)皿中加入5 mL蒸餾水。處理3 d后取樣，去除根部。樣品用液氮速凍后，將用于檢測(cè)維生素C含量的材料保存于-80℃超低溫冰箱中；其余材料經(jīng)真空冷凍干燥機(jī)（Vir Tis公司，美國）冷凍干燥72 h，粉碎成粉后置于-20℃儲(chǔ)存，用于檢測(cè)芥子油苷、花青素、總多酚的含量和總抗氧化能力。

1.3 測(cè)定方法和數(shù)據(jù)分析

1.3.1 芥子油苷的提取純化和分析

參照SUN等[8]的方法并加以改進(jìn)。將30 mg冷凍干燥的樣品置于離心管中，加入2 mL沸騰的ddH2O，100℃水浴10 min后，7 000 g離心5 min轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中。重復(fù)提取1次。合并提取液并進(jìn)行純化后，使用高效液相色譜儀（Shimadzu公司，日本）檢測(cè)芥子油苷含量。結(jié)果表示為每毫克鮮樣中含有的芥子油苷納摩爾數(shù)，nmol/mg。

1.3.2 花青素含量的測(cè)定

取0.2 g芥藍(lán)凍干粉，加入2 mL含1%HCl的甲醇，冰浴研磨，其余參照TENG等[15]的方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 總多酚含量的測(cè)定

參照AINSWORTH等[16]的方法，略加改進(jìn)。將0.2 g芥藍(lán)凍干粉加入5 mL 30%乙醇中，37℃水浴1 h，然后室溫下7 000 r/min離心10 min，吸取上清液作為多酚提取液。采用Folin-Ciocalteau溶劑法測(cè)定多酚化合物的含量。以沒食子酸為標(biāo)樣，結(jié)果表示為每克干物質(zhì)中沒食子酸的含量。

1.3.4 維生素C含量的測(cè)定

參照YUAN等[17]的方法，并加以改進(jìn)。取0.2 g冷凍的樣品于研缽中，加入2 mL1%草酸溶液于冰上研磨，殘?jiān)? mL 1%草酸溶液洗滌2次，合并濾液，7 000 r/min離心10 min，取上清液，過濾后使用高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）進(jìn)行維生素C含量分析。

HPLC條件：C18色譜柱（5 μm,250 mm×4.6 mm），柱溫30℃，流動(dòng)相為0.1%的草酸溶液，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為243 nm。將不同濃度的維生素C標(biāo)樣進(jìn)行HPLC分析，依所得結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以外標(biāo)法計(jì)算樣品中維生素C的含量。

1.3.5 抗氧化能力的測(cè)定

參照BENZIE等[18]的鐵離子還原/抗氧化能力（ferric reducing antioxidant potential assay,FRAP）法，并加以改進(jìn)。取0.2 g芥藍(lán)芽菜凍干粉于2 mL離心管中，加入1 mL 30%乙醇和2粒鋼珠，使用研磨儀在60 Hz下振蕩研磨60 s后轉(zhuǎn)移到10 mL離心管中，用30%乙醇定容至6 mL，80℃水浴1 h，然后7 500 r/min離心10 min，吸取上清液作為提取液。取提取液0.3 mL，加入預(yù)熱的2.7 mL FRAP工作液，混勻，37℃水浴10 min后，在593 nm波長下測(cè)定吸光度。以硫酸亞鐵溶液作為標(biāo)樣，樣品的抗氧化活性（FRAP值）以達(dá)到同樣吸光度所需的硫酸亞鐵的微摩爾數(shù)表示。

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)分析所用軟件為SPSS 11.5，采用單因素方差分析（one-way analysis of variance,ANOVA）和獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 芥藍(lán)芽菜中芥子油苷的種類和含量

從圖1可以看出，在芥藍(lán)芽菜中共檢測(cè)到11種芥子油苷。其中：7種為脂肪類芥子油苷，分別為3-甲基硫氧丙基芥子油苷（glucoiberin,GIB）、2-羥基-3-丁烯基芥子油苷（progoitrin,PRO）、烯丙基芥子油苷（sinigrin,SIN）、4-甲基硫氧丁基芥子油苷（glucoraphanin,GRA）、3-丁烯基芥子油苷（gluconapin,GNA）、4-甲基硫丁基芥子油苷（glucoerucin,GER）和2-羥基-4-戊烯基芥子油苷（gluconapoleiferin,GNL），分別占總脂肪類芥子油苷的2.7%、24.4%、14.3%、8.8%、37.9%、11.4%和0.4%（圖1A）；4種為吲哚類芥子油苷，分別為吲哚-3-甲基芥子油苷（glucobrassicin,GBS）、4-甲氧基-吲哚-3-甲基芥子油苷（4-methoxy glucobrassicin,4-OMGBS）、4-羥基-吲哚-3-甲基芥子油苷（4-hydroxy glucobrassicin,4-OHGBS）和1-甲氧基-吲哚-3-甲基芥子油苷（1-methoxy glucobrassicin,NGBS），分別占總吲哚類芥子油苷的23.1%、49.2%、21.4%和6.2%（圖1B）。由圖1C可知，芥藍(lán)芽菜中芥子油苷以脂肪類芥子油苷為主，約占總芥子油苷含量的95.5%。

2.2 葡萄糖和茉莉酸甲酯處理對(duì)芥藍(lán)芽菜中芥子油苷積累的影響

如圖2所示，茉莉酸甲酯單獨(dú)處理可以顯著提高芥藍(lán)芽菜中除GIB和GRA以外的所有種類脂肪類芥子油苷的含量，而0.03 g/mL葡萄糖單獨(dú)處理對(duì)脂肪類芥子油苷的積累沒有顯著影響。然而，當(dāng)共同施加葡萄糖和茉莉酸甲酯時(shí)，芥藍(lán)芽菜中的GIB和GRA含量得到了顯著的提升，與對(duì)照相比分別增加了63%和52%（圖2A、D）。此外，葡萄糖可以進(jìn)一步促進(jìn)茉莉酸甲酯誘導(dǎo)的GNA的積累（圖2E）。

圖2 葡萄糖和茉莉酸甲酯（MeJA）單獨(dú)或者共同處理對(duì)脂肪類芥子油苷積累的影響Fig.2 Effect of glucose or/and methyl jasmonate(MeJA)on accumulation of aliphatic glucosinolates

葡萄糖單獨(dú)處理可以顯著促進(jìn)芥藍(lán)芽菜中GBS的合成（圖3A）；茉莉酸甲酯單獨(dú)處理可以顯著增加所有吲哚類芥子油苷的積累（圖3A～D）；葡萄糖的添加可增強(qiáng)茉莉酸甲酯對(duì)4-OMGBS合成的促進(jìn)作用，與茉莉酸甲酯單獨(dú)處理時(shí)4-OMGBS的積累量相比達(dá)到顯著水平，比對(duì)照提高了50%（圖3B）。

由圖4可知，與對(duì)照相比，茉莉酸甲酯單獨(dú)處理可以顯著促進(jìn)芥藍(lán)芽菜中總芥子油苷的積累，葡萄糖可以在一定程度上增強(qiáng)茉莉酸甲酯對(duì)總芥子油苷合成的促進(jìn)作用。

2.3 葡萄糖和茉莉酸甲酯共同處理對(duì)芥藍(lán)芽菜中維生素C、花青素、總多酚含量和抗氧化活性的影響

由表1可知：葡萄糖和茉莉酸甲酯共同處理對(duì)芥藍(lán)芽菜中花青素的積累和總抗氧化活性有一定的促進(jìn)作用，其中對(duì)花青素含量的提升作用達(dá)到顯著水平；但是，二者共同處理對(duì)維生素C和總多酚含量幾乎沒有影響。

3 討論與結(jié)論

圖3 葡萄糖和茉莉酸甲酯單獨(dú)或者共同處理對(duì)吲哚類芥子油苷積累的影響Fig.3 Effect of glucose or/and MeJAon accumulation of indolic glucosinolates

圖4 葡萄糖和茉莉酸甲酯單獨(dú)或者共同處理對(duì)總芥子油苷積累的影響Fig.4 Effect of glucose or/and MeJA on accumulation of total glucosinolates

本研究采用濃度較低的葡萄糖溶液（0.03 g/mL）和植物激素（5 μmol/L茉莉酸甲酯）進(jìn)行外源復(fù)合處理，既經(jīng)濟(jì)又安全。作為一種營養(yǎng)價(jià)值很高的中國特產(chǎn)蔬菜，芥藍(lán)具有很大的消費(fèi)群體，其價(jià)格低廉的種子使得商業(yè)化生產(chǎn)芽菜成為可能。本文以芥藍(lán)芽菜為材料，探究了有效改良蕓薹屬蔬菜中芥子油苷組分和含量、提高其抗氧化活性的化學(xué)調(diào)控手段。

前期研究表明，葡萄糖可作為信號(hào)分子有效促進(jìn)芥子油苷的合成積累[5-6]。WEI等[12]的研究表明，5%葡萄糖可以顯著提升芥藍(lán)芽菜中脂肪類和吲哚類芥子油苷的積累。在本研究中，0.03 g/mL葡萄糖處理僅對(duì)吲哚類芥子油苷的合成有顯著促進(jìn)作用，這可能與使用的葡萄糖濃度不同有關(guān)，也說明芥藍(lán)芽菜中吲哚類芥子油苷的合成對(duì)葡萄糖的響應(yīng)更敏感。迄今為止，已知多種植物激素，如生長素、脫落酸、茉莉酸、油菜素內(nèi)酯、水楊酸和乙烯等參與了芥子油苷的代謝調(diào)控[17,19-20]。其中，SCHWEIZER等[13]已闡明了茉莉酸對(duì)擬南芥芥子油苷生物合成的調(diào)控機(jī)制。MOREIRA-RODRíGUEZ等[21]的研究發(fā)現(xiàn)，茉莉酸可有效促進(jìn)青花菜芽菜中吲哚類芥子油苷的積累。本研究表明，茉莉酸甲酯處理可以顯著提高芥藍(lán)芽菜中絕大多數(shù)種類的脂肪類和吲哚類芥子油苷的積累；當(dāng)與葡萄糖共同處理時(shí)，茉莉酸甲酯對(duì)4-OMGBS的促進(jìn)作用得到了進(jìn)一步的增強(qiáng)，比對(duì)照增加了50%。據(jù)報(bào)道，在人體攝食過程中，4-OMGBS的降解產(chǎn)物——4-甲氧基吲哚-3-甲醇可抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖，在十字花科蔬菜預(yù)防癌癥功能中具有重要作用[22]。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，茉莉酸甲酯單獨(dú)處理可以促進(jìn)大多數(shù)脂肪類芥子油苷的合成，唯獨(dú)不能提升GIB和GRA的積累，而這2種芥子油苷的降解產(chǎn)物——烷基異硫代氰酸鹽具有較強(qiáng)的抗癌活性，可以抑制癌細(xì)胞的增殖和促進(jìn)組氨酸乙?；痆23-24]。并且，GRA的降解產(chǎn)物蘿卜硫素被認(rèn)為是最具潛力的天然抗癌化合物[25-26]，可以有效抑制致癌代謝中的階段Ⅰ酶活性，并誘導(dǎo)具有解毒作用的階段Ⅱ酶活性，從而阻遏癌癥的發(fā)生[27-29]，同時(shí)還能誘導(dǎo)癌癥細(xì)胞的程序化死亡[30-33]。然而，茉莉酸甲酯與葡萄糖共同處理使這2種芥子油苷的含量得到了顯著增高，與對(duì)照相比分別提升了63%和52%。

維生素C和多酚類化合物是十字花科植物中含量高，且具有抗氧化能力的重要生物活性物質(zhì)。臨床試驗(yàn)表明，食用含有此類物質(zhì)的食物有助于延緩衰老，降低多種疾病發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)[34]。因此，本研究探究了葡萄糖和茉莉酸甲酯復(fù)合處理對(duì)于芥藍(lán)芽菜中此類抗氧化物含量的影響。我們發(fā)現(xiàn)，每百克芥藍(lán)芽菜中維生素C高達(dá)100 mg，再次證明芥藍(lán)芽菜是抗氧化物質(zhì)維生素C的重要來源[1,12]。有研究表明，在擬南芥和煙草Bright Yellow-2（BY-2）懸浮細(xì)胞中，茉莉酸可以促進(jìn)維生素C的從頭合成[35]。但本研究表明，葡萄糖與茉莉酸甲酯復(fù)合處理沒有顯著促進(jìn)芥藍(lán)芽菜維生素C的積累，可能是由于葡萄糖對(duì)維生素C積累的抑制作用抵消了茉莉酸甲酯對(duì)它的促進(jìn)效果[12]?；ㄇ嗨厥且活愔匾奶烊簧?，屬于多酚類化合物。前人的研究表明，糖類可以促進(jìn)青花菜中花青素的合成[36]。FLORES等[37]的研究顯示，茉莉酸可以促進(jìn)黑加侖中花青素的積累。此外，LORETI等[38]闡明了蔗糖和茉莉酸對(duì)花青素合成的協(xié)同調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和茉莉酸共同處理也同樣可以顯著提升芥藍(lán)芽菜中花青素的含量，然而，二者復(fù)合處理對(duì)總多酚的含量沒有顯著影響。WEI等[12]的研究表明，葡萄糖可能通過調(diào)控多酚類化合物合成過程中的關(guān)鍵酶——苯丙氨酸解氨酶的活性來影響十字花科蔬菜中多酚物質(zhì)的合成，但是關(guān)于茉莉酸對(duì)多酚化合物的調(diào)控作用則存在不同的見解。有報(bào)道指出，茉莉酸對(duì)青花菜芽菜中的多酚類化合物具有負(fù)向調(diào)控作用[21,39]；而KIM等[40]在蘿卜芽菜中的研究則證明了茉莉酸可以促進(jìn)多酚類化合物的合成。這其中的具體作用機(jī)制還有待闡明。此外，葡萄糖和茉莉酸復(fù)合處理對(duì)芥藍(lán)芽菜的總抗氧化能力沒有顯著影響，再次印證了關(guān)于酚類化合物的含量和抗氧化活性之間具有高度相關(guān)性的報(bào)道[40]。

表1 葡萄糖和茉莉酸甲酯共同處理對(duì)芥藍(lán)芽菜中維生素C、花青素、總多酚含量和抗氧化活性的影響Table 1 Effect of glucose and MeJAon contents of vitamin C,anthocyanins,total phenols,and antioxidant activity of Chinese kale sprouts

以上分析表明，0.03 g/mL葡萄糖與5 μmol/L茉莉酸甲酯共同處理可以增加芥藍(lán)芽菜中芥子油苷的積累，并且可以顯著提高花青素的含量，因此，這不失為一種有效改善芥藍(lán)芽菜品質(zhì)的化學(xué)調(diào)控手段。

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