豬胎盤中生物活性肽的制備及含量測(cè)定

張尚衛(wèi)，黃大鵬

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

胎盤肽(placental polypeptide，PP)又稱胎盤免疫調(diào)節(jié)肽、胎盤轉(zhuǎn)移因子，是從動(dòng)物胎盤中分離提純得到的由核苷酸、肽類、和各種氨基酸等小分子物質(zhì)混合而成的多肽。研究發(fā)現(xiàn)[1]胎盤肽具有抗菌抗氧化、提高機(jī)體免疫力等多種生物活性功能，它不僅能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞E受體表達(dá)，還能促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂，從而增強(qiáng)細(xì)胞免疫。采用超聲波破碎[2]、酶解[3]、組織勻漿[4]等方法，均能從鮮活胎盤中釋放并提取出胎盤肽，胎盤組織中細(xì)胞壁的破碎以及固液分離程度對(duì)胎盤肽的提取效率有較大影響，不同的提取工藝對(duì)不同動(dòng)物胎盤中胎盤肽的提取效率也不盡相同。目前我國(guó)基礎(chǔ)母豬存欄大約3 500萬(wàn)頭，每年可產(chǎn)出大量豬胎盤。研究豬胎盤內(nèi)含有的活性物質(zhì)，對(duì)合理利用數(shù)量龐大的豬胎盤資源具有重要意義。本試驗(yàn)用組織勻漿法提取豬胎盤肽，采用Tricine-SDS-PAGE 電泳法和考馬斯亮藍(lán) G-250法對(duì)豬胎盤肽分子量大小和含量進(jìn)行測(cè)定，為豬胎盤的進(jìn)一步研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

豬鮮活胎盤由大慶市龍鳳區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)提供；丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；溴芬蘭、巰基乙醇均為北京科昊達(dá)生物技術(shù)公司產(chǎn)品 ；冰醋酸、尿素、甘油為國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；三羥甲基氨基甘氨酸(ttricine)、十二烷基磺酸鈉(SDS)為Biomo公司產(chǎn)品；Tris堿、TEMED為上?；瘜W(xué)試劑公司產(chǎn)品 ；過(guò)硫酸銨(AP)為BIB產(chǎn)品 ；超低分子蛋白marker為北京索萊寶公司產(chǎn)品；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白均為北京Solarbio公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 豬胎盤肽的提取 選取6付剛娩出鮮活豬胎盤，將其分為A、B、C、D、E、F 6個(gè)組，從每付胎盤中3個(gè)隨機(jī)部位各剪取1 g胎盤組織，并分別標(biāo)記為A1、A2、A3；B1、B2、B3……F1、F2、F3，將胎盤組織用鹽水沖洗干凈后用吸水紙把水分吸凈，加入1.5倍去離子蒸餾水，置于高速組織搗碎勻漿機(jī)(12 000 r/min，3 min/次，10次)勻漿，經(jīng)3次反復(fù)凍融后于高速冷凍離心機(jī)冷凍離心(8 000 r/min，20 min)，取上清液用0.45 μm微孔濾器進(jìn)行微濾處理，以除去不溶性雜質(zhì)，將提取液進(jìn)行分裝，置-80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 Tricine-SDS-PAGE 電泳法檢測(cè)豬胎盤肽分子量

1.2.2.1 試劑的配置與灌膠 電泳液的配置與灌膠參照周國(guó)華[5]改良后的 Tricine-SDS-PAGE電泳法進(jìn)行，凝膠由3層不同密度膠體構(gòu)成，分別為分離膠、間隙膠和濃縮膠。

1.2.2.2 上樣與電泳 電泳儀和電泳槽安裝完畢后，加入電泳液，下槽裝陽(yáng)極緩沖液，上槽裝陰極緩沖液。將待測(cè)液和上樣緩沖液以1∶1混合均勻后，沸水浴加熱5 min后冷卻，開始上樣。取20 μL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品加入第1個(gè)點(diǎn)樣孔，另外分別從每組樣品液中取20 μL依次加入點(diǎn)樣孔內(nèi)。先將電壓調(diào)至30V約1.5 h，待樣品進(jìn)入分離膠后電壓升至120V至電泳結(jié)束。

1.2.2.3 染色和脫色 電泳結(jié)束后將膠至于染色液中緩慢振蕩染色20 min，之后轉(zhuǎn)移至脫色液中進(jìn)行脫色，脫色至條帶清晰后進(jìn)行照膠分析。

1.2.3 考馬斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定胎盤肽的含量

1.2.3.1 試劑的配置 考馬斯亮藍(lán)G-250溶液與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液均按常規(guī)方法進(jìn)行配置與保存[6]。

1.2.3.2 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 取6支10 mL具塞試管分別編號(hào)0、1、2、3、4、5號(hào)，并按表1中所示分別加入相應(yīng)試劑，充分混勻2 min后在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度值(OD)，然后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并求出標(biāo)準(zhǔn)方程。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作表

1.2.3.3 待測(cè)液的測(cè)定 吸取0.01 mL樣品溶液，用蒸餾水補(bǔ)至0.1 mL，再加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G-250顯色劑，充分混勻2 min后在595 nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，并記錄吸光值(需重復(fù)實(shí)驗(yàn))。如表2所示，然后根據(jù)所得吸光度值(OD)帶入標(biāo)準(zhǔn)方程中計(jì)算蛋白質(zhì)含量。按以下公式計(jì)算胎盤組織中所含胎盤肽的含量。

樣品蛋白質(zhì)含量(mg/g鮮重)=[查得的蛋白質(zhì)含量(μg)/樣品的重量(g)×1 000]×稀釋倍數(shù)

表2 樣品液的測(cè)定表

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，用胎盤中3個(gè)不同部位的平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示此胎盤中胎盤肽分子質(zhì)量和含量。

2 結(jié)果

2.1 豬胎盤肽分子量檢測(cè)結(jié)果

由圖1可看出6組份豬胎盤樣在14.4 ku處均有較為清晰的蛋白質(zhì)條帶，其他條帶不明顯。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品的分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)(lg Mr)和在分離膠中的相對(duì)遷移率(Rf)進(jìn)行了回歸分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)，并得出相應(yīng)的線性回歸方程為y=-0.599 5Rf+1.316 7，r=0.993 2。從標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線中查得6組豬胎盤中胎盤肽分子質(zhì)量分別為14.219、13.801、12.012、12.357、11.326、10.197 ku，明確表明豬胎盤中含有小分子多肽。

A、B、C、D、E、F分別為6組豬胎盤肽樣品相對(duì)分子質(zhì)量條帶

A,B,C,D,E,F were relative molecular mass bands of 6 pig placental peptide samples

圖1豬胎盤肽和標(biāo)準(zhǔn)蛋白電泳圖

Fig.1 Pig placental peptide and standard protein electrophoresis

圖2 標(biāo)準(zhǔn)蛋白曲線

2.2 豬胎盤肽含量測(cè)定結(jié)果

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程建立 用分光光度計(jì)，以試劑空白對(duì)照做參比，在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液吸光度值(OD)。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標(biāo)，吸光值(OD)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖3)，并得出相應(yīng)的線性回歸方程y=0.006x+0.014 9，r=0.998 3，曲線很好的符合郎伯-比爾(Lamber-Beer)定律。

圖3 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2.2 豬胎盤中胎盤肽的含量 由表3可知，6組胎盤中胎盤肽的含量不同，且同一胎盤不同部位胎盤肽的含量也不相同。6組豬胎盤中胎盤肽的平均含量分別為0.67 mg/g±0.07 mg/g、0.82 mg/g±0.03 mg/g、0.81 mg/g±0.02 mg/g、0.70 mg/g±0.11 mg/g、0.79 mg/g±0.03 mg/g及0.84 mg/g±0.04 mg/g。

表3 豬胎盤肽含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 胎盤肽的提取工藝

動(dòng)物體內(nèi)的生物活性肽主要源于蛋白質(zhì)，對(duì)于活性肽的提取首先應(yīng)考慮到如何將其蛋白質(zhì)更好的溶解釋放，同時(shí)盡可能少的破壞其多肽結(jié)構(gòu)。提取動(dòng)物組織中多肽首先要使組織細(xì)胞破碎和固液分離，這一步也是分離純化階段的重要環(huán)節(jié)。細(xì)胞破碎的方法通常有組織勻漿法、超聲波破碎法和酶解法，前兩種方法即為物理方法提取活性多肽，其原理均是通過(guò)外力將細(xì)胞破碎，使細(xì)胞中的多肽或蛋白質(zhì)進(jìn)入到溶液中，然后進(jìn)行下一步的提取純化。酶解法即是利用生物酶制劑將細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜充分溶解和消化，使其細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和多肽等內(nèi)容物釋放溶解，但應(yīng)用此方法需嚴(yán)格掌握酶的專一性以及反應(yīng)條件，只有選擇合適的酶，并且在適應(yīng)的溫度和pH條件下才能充分酶解釋放胞內(nèi)物質(zhì)而不過(guò)多破壞其結(jié)構(gòu)。以上幾種方法的最終目的以及基本原理都是將細(xì)胞破碎后釋放出胞內(nèi)物質(zhì)，但目前超聲波破碎法和酶解法均無(wú)成套的關(guān)鍵技術(shù)，制作工藝復(fù)雜，成本較高，不具備大批量生產(chǎn)的條件。本試驗(yàn)采用組織勻漿法獲得了透明清亮較為優(yōu)質(zhì)的豬胎盤肽，相比之下，組織勻漿法工藝較簡(jiǎn)單，關(guān)鍵技術(shù)較為成熟，且適合大規(guī)模生產(chǎn)。

3.2 豬胎盤肽分子質(zhì)量測(cè)定分析

用SDS-PAGE分離鑒定蛋白質(zhì)，其有效分離范圍取決于聚丙烯酰胺的濃度和交聯(lián)度，即膠體孔徑的大小，分離膠濃度越大，其孔徑越小，孔徑的大小直接影響到蛋白質(zhì)分離的效果。汪建雄等[7]研究發(fā)現(xiàn)分離膠濃度為100 g/L、120 g/L時(shí)，膠體孔徑過(guò)大，得不到清晰條帶，當(dāng)分離膠濃度為150 g/L時(shí)條帶效果得到改善，分離膠濃度達(dá)180 g/L、200 g/L時(shí)條帶效果較清晰，當(dāng)濃度達(dá)250 g/L時(shí)，電泳受阻嚴(yán)重,說(shuō)明分離膠孔徑已經(jīng)太小。對(duì)于小分子多肽(Mr<10 ku)而言，即使用高濃度聚丙烯酰胺凝膠的 SDS-PAGE 也不能夠完全分離，由于在含SDS 緩沖液的樣品中，小分子肽的濃縮較為困難，因?yàn)槎叱蔀閺?fù)合體后所帶的電荷和大小皆與SDS本身類似，因此小分子多肽的濃縮對(duì)SDS-PAGE 來(lái)說(shuō)就成了一個(gè)突出問(wèn)題[8]。

本試驗(yàn)采用改良后的Tricine-SDS-PAGE電泳法[5]對(duì)豬胎盤肽相對(duì)分子質(zhì)量進(jìn)行測(cè)定，得到了較為清晰的條帶，改良后的Tricine-SDS-PAGE中加入的尿素在一定程度上能夠有效的減少小分子多肽與SDS的結(jié)合量，而甘油則能緩解間隙膠和分離膠快速聚合時(shí)引起的斷層問(wèn)題[9]。由電泳結(jié)果可知6組豬胎盤肽分子質(zhì)量分別為14.219、13.801、12.012、12.357、11.326、10.197 ku。這與李小梅[10]所報(bào)道的豬胎盤肽分子質(zhì)量(14.4 ku)相差較小，而與周國(guó)華等[11]所測(cè)得的豬胎盤肽分子質(zhì)量(6 ku)結(jié)果相差較大，這可能與豬的品種以及胎次或是提取工藝的不同有關(guān)，其真正原因有待于進(jìn)一步的研究。同時(shí)，由圖1可以看出6條樣品帶中A組和D組條帶顏色較淺，也許是樣品的濃度不夠高而導(dǎo)致，由此猜測(cè)不同胎盤或是同一胎盤的不同部位其胎盤肽的含量是不同的。

3.3 豬胎盤肽含量的測(cè)定分析

考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量已經(jīng)得到廣泛的應(yīng)用，被眾多科研工作者認(rèn)為是一種穩(wěn)定而可靠的蛋白質(zhì)測(cè)定方法。此方法對(duì)儀器設(shè)備的要求不高，簡(jiǎn)便而精準(zhǔn)，據(jù)估計(jì)考馬斯亮藍(lán)法比紫外吸收法靈敏10倍～20倍，比Lowry法約高4倍[12]。但是環(huán)境溫度、光照強(qiáng)度、蛋白質(zhì)孵育溫度及時(shí)間等因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性均有較大影響[13-14]。本試驗(yàn)應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法，對(duì)豬胎盤中胎盤肽的含量進(jìn)行測(cè)定，由結(jié)果可知，6組豬胎盤中胎盤肽的含量分別為0.67 mg/g±0.07 mg/g、0.82 mg/g±0.03 mg/g、0.81 mg/g±0.02 mg/g、0.70 mg/g±0.11 mg/g、0.79 mg/g±0.03 mg/g及0.84 mg/g±0.04 mg/g，這與周國(guó)華所報(bào)導(dǎo)的豬胎盤肽含量相差較大，這可能與以上提出的影響因素有關(guān)。從試驗(yàn)結(jié)果中得知不同豬胎盤中胎盤肽的含量不同，且同一胎盤中不同部位的胎盤肽含量也不相同，這可能與豬的品種以及豬的體質(zhì)或是胎次有關(guān)，具體原因還需要進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn):

[1] 侯銀臣,吳 麗,劉旺旺,等.羊胎盤免疫活性肽的制備及其活性[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào),2016,16(1):123-129.

[2] 唐文林.豬胎盤綜合利用工藝與應(yīng)用研究[D].江南大學(xué),2014.

[3] 王 晶,林志穎,林立梅,等.牛羊胎盤免疫調(diào)節(jié)因子的提取及對(duì)PANC-Ⅰ增殖和遷移影響的比較[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2016,24(12):1863-1871.

[4] 任興宏.羊胎盤免疫活性小分子肽的分離純化[D].西南大學(xué),2010.

[5] 周國(guó)華,孟凡軍,王永志,等.羊和豬胎盤肽的制備及其生物活性的初步研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2006,27(3):000019-22.

[6] 姜亦超,白洪健,郭 鸰,等.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定糞便中蛋白質(zhì)含量及應(yīng)用[J].食品研究與開發(fā),2013,34(21):77-79.

[7] 汪建雄,隋秀芝.用SDS-PAGE電泳法測(cè)定小分子多肽分子量的研究[J].絲綢,2001(12):44-45.

[8] Cleveland D W,Fischer S G,Kirschner M W,et al.Peptide mapping by limited proteolysis in SDS and analysis by gel electrophoresis[J].J Biol Chem,1977,252(3):1102-1106.

[9] 馬興亮.奶山羊胎盤肽的分離提純及其對(duì)小白鼠免疫功能的影響[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2008.

[10] 李小梅.豬胎盤肽凍干粉的制備及功效考察[D].揚(yáng)州大學(xué),2016.

[11] 周國(guó)華.家畜胎盤肽的制備及其生物活性的研究[D].山東農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

[12] 周躍男,王 湛,趙小川,等.淺談蛋白質(zhì)含量的定量檢測(cè)方法[J].食品研究與開發(fā),2014(7):127-130.

[13] 趙 卓,籍浩天,劉東波,等.光照對(duì)考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度影響的研究[J].吉林師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2015(2):112-116.

[14] Zhao Z,Ya-Ru J I,Hao-Tian J I,et al.Effects of temperature on determination of protein concentration with Coomassie brilliant blue method[J].J Anhui Agri Sci,2015.