豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA抗體檢測試劑盒研制及應(yīng)用

李 爽，榮桂芬，盛英霞，陳銀輝，溫 凱，華利忠，熊雅婷，楊若松*

(1.北京維德維康生物技術(shù)有限公司，北京 100095；2.山東省畜牧獸醫(yī)信息中心，山東濟(jì)南 250022；3.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，南京江蘇 210014)

豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV-2)隸屬于圓環(huán)病毒科，是一種較小的、無包膜的、環(huán)狀排列的單鏈DNA病毒[1]。豬圓環(huán)病毒2型相對于豬圓環(huán)病毒1型來說，具有致病性，可引起豬圓環(huán)病毒病。在豬生長發(fā)育過程中，PCV-2的感染與多種臨床表現(xiàn)密切相關(guān)，通常歸結(jié)為PCV-2相關(guān)疾病(PCVAD)，包括全身性疾病、腸炎和肺炎[2]。除了引起PCVAD外，PCV-2感染可能導(dǎo)致延長亞臨床疾病的病發(fā)期，這可能對豬的育肥以及豬肉品質(zhì)產(chǎn)生消極的影響[3-4]。

1974年，研究者們首次發(fā)現(xiàn)在永久性傳代的豬腎細(xì)胞系中存在一種病毒樣的“圓形小顆?！保?年后，被證實是一種新的病毒——豬圓環(huán)病毒。1996年，加拿大學(xué)者從患斷奶后仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的豬體內(nèi)分離到 PCV變異株，將其命名為PCV-2[5]。2000年，我國豬場首次發(fā)現(xiàn)了PCV-2。豬圓環(huán)病毒病作為對全球養(yǎng)豬業(yè)具有重大威脅的主要疾病之一[6]，也是我國重點(diǎn)原種豬場監(jiān)測疫病之一。因此，一個好的臨床診斷關(guān)乎著PCV-2的監(jiān)測與凈化。當(dāng)前，臨床上診斷主要是PCV-2間接ELISA方法。市場上，現(xiàn)有的試劑盒參差不齊，可選擇性偏少，故而進(jìn)行符合市場需求的商品化試劑盒研究。PCV基因組由一條共價閉合環(huán)狀單股DNA構(gòu)成，包含2個大的開放閱讀框架ORF1和ORF2，分別編碼病毒蛋白復(fù)制酶(Rep)和病毒衣殼蛋白(Cap)[7]。Cap蛋白具有良好的免疫原性和反應(yīng)原性，可以進(jìn)行較好的血清學(xué)診斷。本研究以此為包被抗原，建立ELISA方法并優(yōu)化反應(yīng)條件，最終形成產(chǎn)品，進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型的血清學(xué)診斷。

1 材料與方法

1.1 材料

PCV-2原核表達(dá)重組Cap純化蛋白由本公司合成、表達(dá)及純化；辣根過氧化物酶(HRP)羊抗豬購自億米諾公司；TMB底物顯色液為本公司自備；PCV-2陰陽性對照血清由本公司實驗室制備；樣本血清為本公司樣本庫保存；胎牛血清購自美國Gibco公司；96孔可拆式酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；豬圓環(huán)病毒2型抗體ELISA檢測試劑盒購自于韓國金諾公司；其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA的建立及優(yōu)化 對抗原包被量、抗原包被條件、封閉液成分、孵育溫度、樣品稀釋液和二抗稀釋液成分，二抗稀釋度等進(jìn)行優(yōu)化，根據(jù)P/N值建立最佳條件。

1.2.2 豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA反應(yīng)體系的確立 取酶標(biāo)板(根據(jù)樣品多少，可拆開分次使用)，將待檢血清進(jìn)行1∶50稀釋，取100 μL加至酶標(biāo)板中。同時設(shè)陰、陽性對照各2孔，取陰陽性對照取100 μL加入孔中(不用稀釋)。輕輕振勻孔中樣品，蓋上蓋板膜，置室溫下溫育30 min。棄去孔中的溶液，每孔加入稀釋好的洗滌液260 μL，靜置30 s后，棄去洗滌液；洗滌4次后在吸水紙上拍干。配制酶結(jié)合物工作液：按1∶100，混勻。每孔加酶結(jié)合物工作液100 μL，蓋上蓋板膜，室溫(25℃±2℃)下溫育30 min。棄去孔中的溶液，洗滌4次后在吸水紙上拍干。將底物A液與底物B液按1∶1混合均勻，加入孔中，100 μL/孔，蓋上蓋板膜，室溫下反應(yīng)10 min。每孔加入終止液50 μL，5 min內(nèi)于450 nm/630 nm處測定OD值。

1.2.3 豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立 利用建立的方法，檢測陰性對照血清和陽性對照血清OD450 nm/630 nm差值，并檢測通過標(biāo)桿產(chǎn)品韓國金諾公司產(chǎn)品篩選的20份陰性血清和20份陽性血清OD450 nm/630 nm差值，計算出陰性對照平均OD值和陽性對照平均OD值，以S/P值作為判定陰陽性的標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.4 與國外標(biāo)桿產(chǎn)品的比對 用本自制產(chǎn)品與韓國金諾公司產(chǎn)品對187份豬血清進(jìn)行檢測，后分析本自制產(chǎn)品的敏感性、特異性和符合率。

1.2.5 豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒的批間、批內(nèi)重復(fù)性 用3個不同批次組裝的試劑盒檢測同樣5份血清，根據(jù)OD450 nm/630 nm差值標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分析其批間重復(fù)性。使用同一批次組裝的試劑盒檢測同樣5份血清,根據(jù)OD450 nm/630 nm差值標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分析其批內(nèi)重復(fù)性。

1.2.6 豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒穩(wěn)定性試驗 4℃條件下，利用同一份血清檢測OD450 nm/630 nm差值以及陰陽性對照血清OD450 nm/630 nm差值。檢測時間分別為0 d、15 d、1個月、3個月、6個月和12個月。計算3批次的S/P值，探究試劑盒的有效期。

1.2.7 豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒的應(yīng)用 利用自制豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒產(chǎn)品對江蘇A豬場和B豬場進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測。江蘇A豬場隨機(jī)抽取哺乳期、保育期、斷奶期、育肥期、懷孕和空懷豬共45份樣品進(jìn)行檢測，B豬場檢測15頭免疫疫苗母豬的基礎(chǔ)上，探究后代不同周齡的仔豬抗體水平變化。

2 結(jié)果

2.1 豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA的建立及優(yōu)化

根據(jù)P/N值確定了抗原包被濃度為2 μg/mL，4℃包被過夜，封閉液選用50 mL/L胎牛血清-PBST液，37℃封閉2 h；待檢血清以PBS緩沖液按1∶50稀釋，室溫孵育30 min；酶結(jié)合物以自制含防腐劑酶結(jié)合物稀釋液按照1∶100稀釋，室溫下孵育30 min；TMB底物顯色液，室溫下顯色10 min；濃硫酸終止顯色，用酶標(biāo)儀450 nm/630 nm波長測定各反應(yīng)孔的OD值。

2.2 豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA陰陽性判定標(biāo)準(zhǔn)的建立

對陰性對照血清、陽性對照血清、20份陰性血清和20份陽性血清OD450 nm/630 nm差值(表1)。結(jié)果表明，陰性對照OD450 nm/630 nm平均值為0.118，陽性對照OD450 nm/630 nm差值平均值為2.132。綜合陰陽性血清結(jié)果得出，當(dāng)陰性對照平均OD值<0.20且陽性對照平均OD值>1.0，試驗結(jié)果才有效；否則，應(yīng)進(jìn)行重復(fù)試驗。根據(jù)公式S/P=(樣本OD值-陰性對照平均值)/(陽性對照平均OD值-陰性對照平均值)，確定判定方法為S/P≥0.15為陽性；0.15>S/P≥0.1判為可疑；S/P<0.1為陰性。

表1 ELISA檢測豬血清結(jié)果(OD450 nm/630 nm差值)

2.3 與國外標(biāo)桿韓國金諾公司產(chǎn)品的比對

與韓國金諾公司產(chǎn)品完成了267份臨床樣本的比對試驗，結(jié)果證明，本研究中發(fā)明的ELISA產(chǎn)品與標(biāo)桿產(chǎn)品的陽性符合率為97.8%，陰性符合率為92.8%，總體符合率達(dá)到了95%(表2)。

2.4 豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒的批間、批內(nèi)重復(fù)性

用3個不同批次組裝的試劑盒檢測同樣5份血清OD450 nm/630 nm差值，結(jié)果見表3。批間變異系數(shù)在1.20%～6.89%之間，均小于10%。表明豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒不同批次間的可重復(fù)性比較好。

表2 與國外進(jìn)口標(biāo)桿品牌符合度對比結(jié)果

使用同一批次組裝的試劑盒檢測同樣5份血清,根據(jù)OD450 nm/630 nm差值標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)分析其批內(nèi)重復(fù)性(表4)。批內(nèi)變異系數(shù)在0.90%～6.21%之間，均小于10%。表明豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒同批次內(nèi)的可重復(fù)性比較好。

2.5 豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒4℃保存試驗

4℃條件下，測得0 d、15 d、1個月、3個月、6個月、12個月結(jié)果，可見4℃條件下，12個月S/P值基本恒定，故可以保存1年(表5)。

2.6 豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒的應(yīng)用

利用本研制豬圓環(huán)病毒2型抗體檢測試劑盒對江蘇A豬場(未免疫)和B豬場(母豬產(chǎn)前1個月免疫勃林格殷格翰圓環(huán)滅活疫苗，仔豬出生21后免疫該疫苗)進(jìn)行豬圓環(huán)病毒2型抗體檢。江蘇A豬場陽性率為82.2%，B豬場免疫母豬及后代的陽性率為98.3%(表6)。對江蘇A豬場這45頭母豬及育肥豬進(jìn)行S/P值分析比較得出，斷奶和保育時(4周、6周)S/P值較低(圖1)。B豬場免疫母豬及后代基本都是陽性，但母豬相對子代的抗體水平高(圖2和圖3)。

表3 批間重復(fù)性試驗結(jié)果

表4 批內(nèi)重復(fù)性試驗結(jié)果

表5 4℃保存試驗(S/P值)

3 討論

豬圓環(huán)病毒病給全球的養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的沖擊，包括斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征、豬皮炎與腎病綜合征、呼吸道疾病綜合征、增生性壞死性肺炎、新生仔豬先天性震顫與懷孕母豬的繁殖障礙等疾病，而斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征致死率最高[8]。豬圓環(huán)病毒Cap蛋白為病毒的獨(dú)特的結(jié)構(gòu)蛋白，是主要的免疫原性蛋白[9-10]。本研究采取低溫低誘導(dǎo)劑濃度原核表達(dá)獲取Cap純化蛋白，保證了蛋白正常折疊、可溶性表達(dá)，防止蛋白異常折疊形成包涵體，盡最大可能維持原有的抗原表位，利于該病的診斷。并且采取大腸桿菌原核表達(dá)有利于較短時間獲得大量抗原，保證了試劑盒產(chǎn)品原料的供應(yīng)。

表6 江蘇A豬場和B豬場ELISA檢測結(jié)果

圖1 A豬場豬圓環(huán)病毒抗體S/P值

圖2 B豬場豬圓環(huán)病毒抗體S/P值

實線指陽性閾值，虛線為陰性閾值

The solid line refers to the positive threshold,and dashed line is the negative threshold

圖3 B豬場豬圓環(huán)病毒抗體S/P值及離散度

Fig.3 S/P values and dispersion of PCV-2 antibody

我國國標(biāo)中，采用PCR方法檢測PCV-2抗原來診斷該病。PCV-2抗體競爭ELISA方法以其良好的特異性[11]也被越來越多地應(yīng)用。免疫組化也是檢測PCV-2抗原經(jīng)典的檢測方法。后有生物學(xué)家在此方法基礎(chǔ)上，使用免疫膠體標(biāo)記抗體，提高了檢測效果。另外，還有免疫熒光的方法。目前，國內(nèi)外均已有免疫熒光PCV-2檢測試劑盒。本產(chǎn)品與本研究參比標(biāo)桿產(chǎn)品韓國金諾公司豬圓環(huán)病毒2型抗體ELISA檢測試劑盒同為間接ELISA方法。無論從敏感性、特異性還是總體符合率，二者具有高度一致性。說明本研制產(chǎn)品具有較好的診斷效果，其結(jié)果可靠性較好。

利用本研制試劑盒對豬場進(jìn)行檢測，可以看出，豬圓環(huán)病毒2型在我國豬場普遍存在，這與文獻(xiàn)[12]報道一致。A豬場研究發(fā)現(xiàn)，斷奶和保育時(4周、6周)抗體水平低，可能是由于體內(nèi)含有少量母源抗體，一方面含量較低，另一方面抵抗野毒感染。育肥期母源抗體減少，又受到外界感染，導(dǎo)致抗體水平升高。B豬場免疫后，母豬抗體水平較高且與子代基本都為陽性，說明疫苗免疫效果較好。不同周齡的仔豬的抗體消漲變化側(cè)面也印證母源抗體降低，可能又誘發(fā)新的感染狀況。因此，通過豬圓環(huán)病毒2型間接ELISA抗體檢測試劑盒的應(yīng)用，對免疫豬場抗體監(jiān)測以及帶毒豬場的凈化具有重要的意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] Xi X,Mo X,Xiao Y,et al.Production ofEscherichiacoli-based virus-like particle vaccine against porcine circovirus type 2 challenge in piglets:Structure characterization and protective efficacy validation [J].J Biotechnol,2016,223:8-12.

[2] Bucarey S A,Pujol M,Poblete J,et al.Chitosan microparticles loaded with yeast-derived PCV2 virus-like particles elicit antigen-specific cellular immune response in mice after oral administration[J].Virol J,2014,11(1):149.

[3] Oliver-Ferrando S,Segalés J,López-Soria S,et al.Evaluation of natural porcine circovirus type 2 (PCV2) subclinical infection and seroconversion dynamics in piglets vaccinated at different ages [J].Vet Res,2016,47(1):121.

[4] Blomstr?m A L,Fossum C,Wallgren P,et al.Viral metagenomic analysis displays the co-infection situation in healthy and PMWS affected pigs[J].PLoS One,2016,11(12):e0166863.

[5] Kurtz S,Grau-Roma L,Cortey M,et al.Pigs naturally exposed to porcine circovirus type 2 (PCV2) generate antibody responses capable to neutralise PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins[J].Vet Res,2014,45(1):29.

[6] Huang Y,Liu Z,Bo R,et al.The enhanced immune response of PCV-2 vaccine usingRehmanniaglutinosapolysaccharide liposome as an adjuvant [J].Int J Biol Macromol,2016,86:929-936.

[7] Zheng G,Lu Q,Wang F,et al.Selection of affinity peptides for the purification potential of porcine circovirus type 2 (PCV2) Cap virus-like particles (VLPs)[J].RSC Adv,2017,7(62):38911-38914.

[8] Tassis P D,Tsakmakidis I,Papatsiros V G,et al.A randomized controlled study on the efficacy of a novel combination vaccine against enzootic pneumonia (Mycoplasmahyopneumoniae) and porcine circovirus type 2 (PCV2) in the presence of strong maternally derived PCV2 immunity in pigs [J].BMC Vet Res,2017,13(1):91.

[9] Fotso G B K,Bernard C,Bigault L,et al.The expression level of gC1qR is down regulated at the early time of infection with porcine circovirus of type 2 (PCV-2) and gC1qR interacts differently with the Cap proteins of porcine circoviruses [J].Virus Res,2016,220:21-32.

[10] Zhu S,Zhang C,Wang J,et al.Immunity elicited by an experimental vaccine based on recombinant flagellin-porcine circovirus type 2 Cap fusion protein in piglets[J].PLoS One,2016,11(2):e0147432.

[11] Han S,Xiao Y,Zheng D,et al.Establishment and application of a competitive enzyme-linked immunosorbent assay differentiating PCV2 antibodies from mixture of PCV1/PCV2 antibodies in pig sera [J].BMC Vet Res,2016,12(1):175.

[12] Zhan Y,Wang N,Zhu Z,et al.In silico analyses of antigenicity and surface structure variation of an emerging porcine circovirus genotype 2b mutant,prevalent in southern China from 2013 to 2015 [J].J Gen Virol,2016,97(4):922-933.