His-CDs@NaTbF4的合成及其在組氨酸檢測和腫瘤細胞成像中的應用

劉 玲 李瑞怡 來 婷 李在均 顧志國

（江南大學化學與材料工程學院，無錫 214122）

0 引 言

碳點（carbon dots，CDs）是尺寸小于 100 nm 的碳納米材料，包括石墨烯量子點等。碳點具有比表面積大、載流子遷移率高、柔性、熱穩(wěn)定好和化學惰性等特點[1]。相對于有機熒光染料、貴金屬納米簇、熒光蛋白和半導體量子點，碳點具有更高的發(fā)光效率、生物相容性和抗漂白能力[2]。目前，碳點已應用于生物傳感、細胞成像、藥物傳輸、光電子器件等領域[3-6]。提高碳點光學性能的主要方法是異原子摻雜和功能化。摻雜是指在骨架碳結構中引入其他原子。雜原子可改變碳點的電子分布和帶隙間距，實現(xiàn)對光電性能的有效調節(jié)[7]。Lu小組通過熱解鄰苯二胺和多巴胺的混合物得到一種能近紅外熒光發(fā)射的氮摻雜碳點[8]。功能化是在碳片邊緣引入特定化學活性基團或結構單元[9]。Hola小組以沒食子酸衍生物為前驅體水熱合成了烷基鏈功能化碳點[10]。研究發(fā)現(xiàn)，通過改變烷基種類可實現(xiàn)對碳點親水性和疏水性的有效調節(jié)，呈現(xiàn)出羧基誘導下的熒光紅移現(xiàn)象。

稀土氟化物具有寬帶隙、低聲子能量、高熱的特性和環(huán)境穩(wěn)定性，是一種重要的發(fā)光材料[11]。稀土氟化物的發(fā)光性能取決于它的組成，不同的發(fā)光稀土和基質稀土組合將產生不同顏色的熒光發(fā)射[12]。例如，NaTbF4和NaEuF4因稀土電子躍遷能級不同分別發(fā)出明亮的綠光和紅光。此外，晶型、粒徑及表面修飾也不同程度地影響稀土氟化物的發(fā)光性能。為此，人們開發(fā)出許多稀土氟化物合成方法。其中，以溶劑熱法和水熱法最為常用[13-14]。溶劑熱法通常采用油酸、十八烯等有機溶劑為介質制備稀土氟化物晶體。溶劑熱法制備的稀土氟化物尺寸較小且均一，更適合細胞和生物體內的光學檢測與成像，但合成條件苛刻，所制備的氟化物因水溶性差需要改性后方可使用。相對于溶劑熱法，水熱法具有操作簡單和產品結晶度好的特點。Luo小組研究水熱合成六方相NaTbF4，發(fā)現(xiàn)Eu3+摻雜能調節(jié)NaTbF4的熒光發(fā)射。Eu3+摻雜量增加到1%時NaTbF4的熒光由綠色轉化為紅色[15]。然而，傳統(tǒng)水熱法制備的稀土氟化物粒徑偏大，極大地限制了它們在生物分析等領域的應用。

碳點和稀土氟化物是各具特色的發(fā)光材料，它們的結合可能導致不同尋常的性質及相關應用。最近，加拿大多倫多大學的Krull小組利用稀土氟化物與石墨烯量子點之間的熒光共振能量轉移，實現(xiàn)了對人血清中大腸桿菌、痢疾志賀菌和抗四環(huán)素生物標記物的同時檢測[16]。碳點通過2條互補DNA單鏈的雜交與稀土氟化物彼此接近，伴隨著共振能量轉移石墨烯量子點的熒光下降。因不同材料間存在較大距離，能量轉移的效率非常有限。為了克服這一問題，我們以組氨酸功能化碳點（His-CDs）為穩(wěn)定劑，采用水熱法合成了一種His-CDs@NaTbF4復合材料。研究表明，碳點對NaTbF4晶體的包覆提高了水溶性，復合物在水中能長期穩(wěn)定。碳點與NaTbF4的共價結合實現(xiàn)了稀土粒子向碳點的高效能量轉移，導致顯著的熒光增強。該復合材料成功地應用于人體尿液中組氨酸測定和Hela細胞成像。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

所用儀器有：JEM-2100（HR）透射電子顯微鏡（日本 JEOL公司）；Nicolet iS50 FT-IR傅立葉紅外光譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；Cary Esclipse熒光光度計（美國瓦里安公司）；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計 （北京普析通用儀器有限責任公司）；D8 Advance型X射線衍射儀 （德國Bruker AXS公司），XRD 測試條件：Cu Kα 射線 （λ=0.154 nm）， 管電壓40 kV，管電流 300 mA，掃描范圍 5°～90°。

TbCl3·6H2O、NaF、CuSO4和組氨酸購于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。BR緩沖溶液：H3PO4、乙酸和 H3BO3濃度均為 0.04 mol·L-1，用 0.02 mol·L-1NaOH溶液在pH計上調節(jié)到所需要的pH值。His-CDs按文獻方法合成[17]。其它試劑均為分析純，購于國藥集團化學試劑公司。實驗用水為二次去離子水。

1.2 His-CDs@NaTbF4制備

將 TbCl3·6H2O（5 mmol）溶 于 去 離 子 水 中 （15 mL），緩慢滴加 His-CDs溶液（5 mg·mL-1，100 mL），攪拌 30 min。滴加 1.0 mol·L-1NaF 水溶液（60 mL）于上述混合溶液，強力攪拌1 h后轉移至壓力反應釜中，于180℃ 反應4 h，冷卻至室溫，收集上清液，高速離心（10 000 r·m-1）20 min 去除游離的 His-CDs，沉淀用水洗滌3次，冷凍干燥得到His-CDs@/NaTbF4固體樣品。稱取一定量的His-CDs@NaTbF4溶解于水中配成0.3 mg·mL-1的儲備液，在4℃冰箱中避光保存，備用。

1.3 熒光測定

移取200 μL His-CDs@NaTbF4水溶液于5 mL離心管，加入600 μL pH 7的BR緩沖溶液，加水定容至1 mL，混勻，倒入1 cm石英比色皿中，然后在熒光分光光度計上選擇激發(fā)波長為340 nm進行熒光光譜掃描或熒光強度測定。

1.4 共振光散射光譜測定

在2 mL離心管中，依次加入200 μL Cu2+標準溶液、600 μL BR 緩沖溶液（pH=7）和 200 μL His-CDs@NaTbF4水溶液，搖勻，然后在熒光光度計上選擇激發(fā)波長等于發(fā)射波長進行同步掃描測定共振光散射光譜。

1.5 組氨酸檢測

在2 mL離心管中，依次加入200 μL 1.0×10-2mol·L-1Cu2+標準溶液、400 μL BR 緩沖溶液（pH=7）和200 μL His-CDs@NaTbF4溶液，搖勻，加入200 μL組氨酸標準溶液或樣品溶液，在熒光光度計上進行熒光光譜掃描或熒光強度測定。

1.6 細胞成像

將Hela細胞轉移到含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素的 DMEM 中，37 ℃、5%（V/V）CO2和 95%（V/V）空氣的潮濕環(huán)境下培養(yǎng)。成像實驗前，將細胞轉移至共聚焦專用培養(yǎng)皿，培養(yǎng)6 h后用5 mL pH=7.4的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3次。將此細胞注入30 mg·mL-1His-CDs@NaTbF4溶液， 于37℃和5%（V/V）CO2的條件下培養(yǎng) 4 h，用 5 mL pH=7.4 的 PBS洗滌3次去除殘余His-CDs@NaTbF4，然后在共聚焦熒光顯微鏡上選擇490 nm激發(fā)光進行熒光成像。

2 結果與討論

2.1 His-CDs@NaTbF4合成

His-CDs@NaTbF4合成包括制備His-CDs-Tb和NaTbF4的形成2個步驟。首先，His-CDs通過咪唑氮和羧基氧與Tb3+結合形成穩(wěn)定的His-CDs-Tb配合物[18]。在配位反應過程中，隨著His-CDs的加入TbCl3溶液由透明狀逐步轉變?yōu)榛鞚?，直到產生大量沉淀。這是因為每個碳片含有多個咪唑基團和羧基，不同碳片之間可以通過“Tb3+橋”連接在一起，碳片聚合導致配合物水溶性顯著下降而最終從體系中沉淀析出。沉淀完全后，向體系中加入NaF，并在180℃下水熱反應產生His-CDs@NaTbF4復合物。這一過程中，F(xiàn)-將替代His-CDs-Tb配合物中His-CDs配體而最終形成NaTbF4晶體。一方面，His-CDs對Tb3+的緩釋作用可有效調控NaTbF4晶體生長，從而形成細小且結晶度高的NaTbF4晶體。另一方面，碳片共價鍵合于NaTbF4晶體表面形成親水性包覆層，改善了NaTbF4的水溶性。此外，碳片上含氧基團的離解造成粒子表面帶負電荷，強的靜電排斥進一步提高了His-CDs@NaTbF4水溶液穩(wěn)定性。

圖1是His-CDs的TEM圖和His-CDs@NaTbF4的TEM、晶格指紋和XRD圖。從圖1可以看出，His-CDs碳片呈現(xiàn)為準零維材料，其碳片尺寸較小，直徑僅為1～3 nm，沒有明顯的團聚。NaTbF4具有明顯的六方晶型結構，晶體大小均一，尺寸在4～6 nm之間，明顯小于傳統(tǒng)水熱法和溶劑熱法所制備的稀土氟化物[19-20]。 晶格指紋圖包含His-CDs的（002）和NaTbF4的（110）衍射峰的晶格。復合物的XRD圖上有 5 個衍射峰，分別位于 17.1°、29.8°、30.4°、42.9°和53.1°，對應于（100），（110），（101），（201）和（211）晶面。這些衍射峰都能在標準卡片中找到（PDF#27-0809），證明形成了六方相NaTbF4。圖1D中XRD衍射峰呈現(xiàn)強而尖的特征，說明NaTbF4有高的結晶度。熱重分析揭示His-CDs@NaTbF4含有33.19%的His-CDs，然而圖1D中并未出現(xiàn)碳材料在22°處的特征衍射峰。這主要是因為His-CDs是一種準零維納米材料，低結晶度降低了在22°處XRD衍射峰的強度。相對于NaTbF4晶體的強衍射峰，His-CDs的衍射峰弱到幾乎觀察不到的程度。

圖2是His-CDs@NaTbF4的EDS圖和紅外光譜。 EDS 分析表明，復合物主要是由 C、N、O、Tb、Y和F元素組成。因為C、N和O主要來源于His-CDs，而Tb、Y和F來源于NaTbF4，上述結果證明復合物中含有His-CDs和NaTbF4。His-CDs@NaTbF4的紅外光譜存在5個強的紅外吸收峰和吸收帶。3 400 cm-1附近的寬峰是O-H和-N-H鍵伸縮振動產生的紅外吸收。1 700 cm-1附近的強峰是-C=O鍵伸縮振動產生的紅外吸收。1 380 cm-1和1 150 cm-1的吸收峰證實-COOH存在。1 650 cm-1處有一明顯的吸收峰對應咪唑基團中C＝N伸縮振動紅外吸收。圖2A中還有許多弱的吸收峰和吸收帶，它們相似于His-CDs的紅外吸收，說明在水熱反應過程中His-CDs的主要功能基團得以較好地保留。

2.2 NaTbF4對His-CDs熒光增強

圖1 His-CDs的 TEM 圖 （A）和 His-CDs@NaTbF4的 TEM （B）、晶格指紋 （C）和 XRD 圖 （D）Fig.1 TEM image （A）of His-CDs and TEM image （B）,lattice fringe image （C）and XRD patterns （D）of His-CDs@NaTbF4

圖2 His-CDs@NaTbF4的 EDS圖 （A）和紅外光譜 （B）Fig.2 EDS image （A）and IR spectrum （B）of His-CDs@NaTbF4

His-CDs@NaTbF4和His-CDs的熒光光譜列于圖3A。His-CDs@NaTbF4的熒光光譜明顯不同于His-CDs。His-CDs的熒光光譜具有較好的對稱性，最大熒光發(fā)射波長為440 nm。His-CDs@NaTbF4有一不對稱的熒光光譜，最大熒光發(fā)射峰移到425 nm。這是因為His-CDs@NaTbF4是由 His-CDs和NaTbF4復合而成，His-CDs@NaTbF4的熒光光譜包括了His-CDs和NaTbF4兩種材料的熒光發(fā)射。圖3A還顯示，His-CDs@NaTbF4有更強的熒光發(fā)射，峰熒光強度超過His-CDs的7倍，這說明His-CDs和NaTbF4的結合能產生顯著的熒光增強，且熒光增強效果優(yōu)于文獻報道（表1）。為了探討熒光增強機理，分別測定了NaTbF4的熒光光譜和His-CDs的吸收光譜。從圖3B可以看出，NaTbF4的熒光光譜位于240～660 nm之間，而His-CDs的吸收光譜覆蓋了250～800 nm的波長范圍。NaTbF4的熒光光譜與His-CDs的吸收光譜有很大程度的重疊，這符合產生熒光共振能量轉移的條件。因此，His-CDs@NaTbF4的熒光強于His-CDs應歸于His-CDs和NaTbF4之間的共振能量轉移。在這一過程中，NaTbF4作為能量供體將能量迅速轉移給His-CDs，帶來His-CDs發(fā)光效率的大幅提升。大量研究表明，供體和受體之間的距離是影響熒光共振能量轉移增強的關鍵因素。His-CDs是通過N-Tb共價鍵的方式與NaTbF4相結合，它們之間的距離僅為一個共價鍵的鍵長，能量供體和受體之間如此短的距離使NaTbF4能高效地向His-CDs轉移能量，從而產生更高的熒光增強效應。

圖3 （A）His-CDs@NaTbF4和His-CDs的熒光光譜;（B）His-CDs的紫外-可見吸收光譜和NaTbF4的熒光光譜Fig.3 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4and His-CDs;（B）UV-visible absorption spectrum of His-CDs and fluorescence spectrum of NaTbF4

表1 不同方法熒光增強效果的比較Table 1 Comparison of different fluorescence enhancement methods

2.3 對Cu2+和組氨酸的光學響應

為了研究His-CDs@NaTbF4對 Cu2+的熒光響應，分別測定了Cu2+加入前后His-CDs@NaTbF4的熒光光譜。圖4A呈示，Cu2+的加入引起了一個明顯的熒光猝滅過程。由于His-CDs@NaTbF4的His-CDs含有能與Cu2+發(fā)生反應的咪唑基團，上述熒光猝滅可歸因于N-Cu鍵的形成。由于N-Cu形成過程中碳片上的部分能量將轉移到Cu2+離子，從而導致其熒光強度的下降。此外，用共振光散射技術研究了Cu2+加入His-CDs@NaTbF4粒子大小的影響。從圖4B可以看出，隨著銅離子濃度增加，His-CDs@NaTbF4的共振光散射光譜強度迅速增大，說明Cu2+加入導致His-CDs@NaTbF4粒子變大。每一個His-CDs碳片中含有多個咪唑基，它與Cu2+的配位可能發(fā)生在不同碳片之間，造成粒子尺寸的迅速增加。

圖4 （A）在 2.0 mmol·L-1Cu2+存在下 （a）和缺少 Cu2+的情況下 （b）His-CDs@NaTbF4 溶液的熒光光譜;（B）在不同濃度 Cu2+存在下His-CDs@NaTbF4溶液的共振光散射光譜Fig.4 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4solution in the presence of 2.0 mmol·L-1Cu2+ （a）and the absence of Cu2+ （b）;（B）Resonance Rayleigh scattering spectra of His-CDs@NaTbF4 solution in the presence of Cu2+with different concentrations

圖5 His-CDs@NaTbF4-Cu 加入組氨酸前 （a）后 （b）的熒光光譜Fig.5 Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4-Cu before （a）and after addition of histidine （b）

在His-CDs@NaTbF4溶液中加入適量的Cu2+可將其全部轉化為相應的配合物。研究發(fā)現(xiàn)，猝滅的熒光能被組氨酸恢復 （圖5）。在體系中加入組氨酸后，組氨酸將同His-CDs競爭與Cu2+配位。組氨酸的配位能力略強于His-CDs，因此組氨酸能分解His-CDs@NaTbF4-Cu而生成His-Cu配合物。同時，釋放出His-CDs@NaTbF4，從而導致體系熒光增加。

2.4 組氨酸檢測的熒光“開-關”體系

基于His-CDs@NaTbF4對Cu2+和組氨酸的熒光響應行為，構建了測定組氨酸的熒光“開-關”方案（圖6）。在這個熒光“開-關”方案中，先加入 Cu2+猝滅His-CDs@NaTbF4的熒光，體系處于熒光“關”狀態(tài)。然后，加入組氨酸分解前面所形成的配合物，同時釋放出His-CDs@NaTbF4使體系的熒光得到一定恢復，體系處于熒光“開”狀態(tài)。利用熒光“開”和“關”產生的信號變化可定量測定組氨酸。以上分析方案中，Cu2+發(fā)揮著至關重要的作用。為此，我們測定了不同Cu2+存在下體系的熒光變化。結果表明，隨著Cu2+濃度增加體系的熒光強度迅速下降。當Cu2+的濃度達到2 mmol·L-1時，熒光猝滅程度達到最大。繼續(xù)增加Cu2+濃度體系熒光強度不再降低，表明His-CDs@NaTbF4已被完全轉化為相應的配合物。對于組氨酸的分析而言，選擇一個較小濃度的Cu2+濃度組氨酸熒光恢復的范圍較小，導致一個相對窄的線性范圍。選擇一個過高的Cu2+濃度體系中將存在游離Cu2+，這些游離Cu2+更容易與組氨酸反應形成穩(wěn)定的配合物。由于這種反應并不產生熒光信號的變化，導致分析結果失真。為了得到寬的線性范圍和高的可靠性，選取Cu2+濃度為2.0 mmol·L-1用于組氨酸檢測的熒光“開-關”體系構建。

圖6 組氨酸檢測的熒光“開-關”方案Fig.6 Fluorescence “On-Off” scheme for detection of histidine

為驗證熒光“開-關”方案用于微量組氨酸測定的可行性，配制一系列His-CDs@NaTbF4-Cu溶液，分別加入不同量的組氨酸，然后測定它們的熒光光譜和峰熒光強度。圖7顯示，體系的熒光隨組氨酸濃度的增加而增大。當組氨酸濃度在1.0×10-6～2.0×10-4mol·L-1之間，峰熒光強度與組氨酸濃度有良好線性關系。其線性方程為：I=1 072.7c/（mmol·L-1）+169.12，相關系數(shù)R=0.995 6，方法檢出限達到3.8×10-7mol·L-1（S/N=3）。 采 用此 方 法測 定 15 個 0.1 mmol·L-1組氨酸，檢測結果標準偏差為1.4%，表明方法具有良好的重現(xiàn)性。將His-CDs@NaTbF4-Cu儲備液在4℃儲存一定時間，然后用于檢測0.1 mmol·L-1組氨酸。儲備液儲存1個月后測定結果相對偏差小于1.9%，表明分析體系有較好的穩(wěn)定性。

圖7 （A）在不同濃度的組氨酸存在下His-CDs@NaTbF4-Cu溶液的熒光光譜;（B）His-CDs@NaTbF4-Cu的熒光強度與組氨酸濃度的關系曲線Fig.7 （A）Fluorescence spectra of His-CDs@NaTbF4-Cu solution in the presence of histidine with different concentrations;（B）Linear relationship of fluorescence intensity of His-CDs@NaTbF4-Cu with histidine concentration

生物樣品中主要的無機離子是Na+、Ca2+、Mg2+、CO32-、SO42-和 PO43-。 加入 1.0 mg 的上述離子后，僅帶來His-CDs@NaTbF4-Cu體系熒光強度小于5%的變化。這是因為上述離子本身不能與復合物發(fā)生反應形成穩(wěn)定化合物，也不能將Cu2+從其配合物中置換出來。對生物樣品而言，天然氨基酸最有可能干擾組氨酸的測定。圖8代表不同天然氨基酸存在下His-CDs@NaTbF4-Cu體系的熒光變化。從圖8可以看出，唯有組氨酸的加入能引起明顯的熒光變化。不同于其他氨基酸，組氨酸分子中含有咪唑基，咪唑基對過渡金屬離子具有強的配位能力，因此組氨酸與銅離子形成配合物的能力最強。由于其他氨基酸的引入并不能分解His-CDs@NaTbF4-Cu配合物，所以不干擾組氨酸測定。

表2 人體尿液中組氨酸的測定（N=5）Table 2 Analytical results of histidinein human urine （N=5）

圖8 不同天然氨基酸對體系熒光強度的影響Fig.8 Effect of natural amino acids on the fluorescence intensity of the system

2.5 人體尿液中組氨酸檢測

征集3位健康的自愿者，將他們的1.0 mL尿樣與0.2 mL乙腈充分混合，在3 500 r·min-1下離心10 min，收集的上清液用于組氨酸測定?；厥諏嶒炇窃谀驑又屑尤胍阎獫舛鹊慕M氨酸標準溶液，然后按實驗方法測定組氨酸濃度，并以此計算回收率。從表2可以看出，測定結果與LC-MS方法相一致，組氨酸回收率95.2%～104.5%，說明方法具有較好的準確性和精密度。

2.6 細胞成像

采用CCK-8方法對His-CDs@NaTbF4的細胞毒性進行測試。結果表明，His-CDs@NaTbF4濃度在0～1 mg·mL-1之間細胞活力保持基本不變，說明His-CDs@NaTbF4具有非常低的細胞毒性。

將Hela細胞在 His-CDs@NaTbF4中孵育 2 h，然后在共聚焦顯微鏡上進行熒光成像。如圖9所示，His-CDs@NaTbF4處理的細胞產生綠色熒光，說明His-CDs@NaTbF4已進入到細胞內部。然而，在同樣條件下用His-CDs處理的細胞熒光卻很弱?？梢姡琀is-CDs@NaTbF4低的細胞毒性和強的熒光發(fā)射，能廣泛應用于生物成像。

圖9 Hela細胞在His-CDs（左）和 His-CDs@NaTbF4（右）中孵育后的明場 （上）和熒光顯微照片 （下）Fig.9 Bright field image （up）and confocal fluorescence microscopy image （down）of the Hela cells incubated with His-CDs （left）and His-CDs@NaTbF4 （right）

3 結 論

以組氨酸功能化碳點為穩(wěn)定劑通過水熱合成得到一種粒徑小、結晶度高和易分散于水的稀土氟化物His-CDs@NaTbF4。碳點與稀土氟化物共價連接可實現(xiàn)能量由稀土氟化物向碳點的高效轉移，導致顯著的熒光增強效應。碳點-稀土氟化物復合物具有低的細胞毒性和強的熒光發(fā)射，可作為熒光探針廣泛應用于各種生物檢測與成像。研究結果還為開發(fā)基于稀土或碳點的功能材料提供了方法和理論指導。

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