豬圓環(huán)病毒3型TaqMan 熒光定量PCR方法的建立和初步應(yīng)用

李 暢，庫旭鋼，王俊偉，李 靜，朱 玲，何啟蓋*(1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點實驗室，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070)

豬圓環(huán)病毒(PCV)是一種單股環(huán)狀負(fù)鏈的DNA病毒，為圓環(huán)病毒科，圓環(huán)病毒屬成員，包括圓環(huán)病毒1型(PCV1)和圓環(huán)病毒2型(PCV2)兩種基因型[1]。PCV1是一種豬腎上皮細(xì)胞(PK-15)污染物，無致病性[2]。PCV2在20世紀(jì)90年代首次發(fā)現(xiàn)于加拿大的斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)病豬中，被認(rèn)為是圓環(huán)病毒相關(guān)疾病(PCVAD)的主要病原，主要導(dǎo)致斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(PDNS)、繁殖障礙等，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟損失[3]。

2016年以來，多篇報道稱通過宏基因組等技術(shù)從皮炎腎病綜合征和繁殖障礙豬的病料以及口腔液中鑒定出一種新型豬圓環(huán)病毒，即豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)[4-7]。根據(jù)已有的報道，PCV3在美國、中國和韓國呈流行趨勢，且可能存在跨國傳播情況[5,7-8]。

鑒于PCV2和PCV3感染能導(dǎo)致相似的臨床癥狀，因此，十分有必要建立一種快速、高效、敏感、特異的檢測方法來區(qū)分PCV3和其他病毒感染。熒光定量PCR技術(shù)憑借其快速、簡便、高效、特異、穩(wěn)定等特點在目前的病原檢測工作中被廣為應(yīng)用[9]。

本研究主要目的在于建立一種快速、高效、特異檢測PCV3的實時熒光定量PCR方法，并用該方法對湖北地區(qū)病料進行PCV3檢測，評估PCV3在該地區(qū)的流行情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品，毒株和菌株 臨床檢測樣品為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物疫病診斷中心門診臨床病死豬的DNA樣品。豬圓環(huán)病毒2b亞型(porcine circovirus type 2b，PCV2b)、豬圓環(huán)病毒2d亞型(porcine circovirus type 2d，PCV2d)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、豬輪狀病毒(porcine rotavirus，PoRV)、副豬嗜血桿菌(Haemophilusparasuis，Hps)，豬胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，App)、豬支氣管敗血波氏桿菌(Brodetellabronchiseptica，Bb)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)等均由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑和儀器 Viral-DNA Kit(病毒DNA提取試劑盒，D3892)購自美國OMEGA公司；TIANamp Genomic DNA Kit(血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒，DP304)購自北京天根生化科技有限公司；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit(質(zhì)粒小提試劑盒，EM101)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；Biomiga Gel/PCR Extraction Kit(膠/PCR產(chǎn)物回收試劑盒，DC3511)購自美國Biomiga公司；HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus)購自上海翊圣生物科技有限公司；iTaqTMUniversal Probes Supermix(172-5134)、384孔PCR反應(yīng)板、96孔PCR反應(yīng)板以及S1000TMThermal Cycler(PCR儀)均購自美國Bio-Rad公司、ViiATM7 實時熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建 根據(jù)NCBI上已公布的PCV3基因組序列(登錄號:MF079254、 MF079253、KY996345、KY996340、KY996338、KY778777、KY075994、KY075988、KX966193、KX898030、KX778720等)以及相應(yīng)的Cap基因序列，設(shè)計引物(表1)，以PCV3陽性樣品DNA為模板，擴增得到Cap基因片段(645 bp)，將該片段連接到pMDTM18-T Vector載體上，篩選陽性克隆并擴大培養(yǎng)相應(yīng)菌液，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，并使用Nano drop測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，計算拷貝數(shù)，并稀釋成1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1。

1.1.4 定量引物和探針的設(shè)計與合成 下載GenBank中已公布的PCV3序列，比較其與PCV1、PCV2的相似性，并根據(jù)其保守區(qū)域使用Primer Premier 5軟件設(shè)計4對引物(表2)，使用SYBR熒光定量PCR驗證其能否有效地檢測該片段。根據(jù)SYBR熒光定量PCR結(jié)果，選定引物對F2/R2和F3/R3擴增序列的交集區(qū)域，設(shè)計一條TaqMan探針(表2)。引物和探針均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1本研究中使用的PCV3ORF2基因的引物

Table1TheprimersforPCV3ORF2geneinthisstudy

引物或探針Primer/Probe序列Sequence產(chǎn)物長度/bpProductsize熔解溫度/℃MeltingtemperaturePCV3?F15′?CGGGATCCATGAGACACAGAGCTATATTC?3′64555．9PCV3?R15′?GGAATTCTTAGAGAACGGACTTGTAACGA?3′55．2

表2本研究中所使用的定量引物和探針

Table2SequenceofqPCRprimersandTaqManprobeinthisstudy

引物或探針Primer/Probe序列Sequence產(chǎn)物長度/bpProductsize熔解溫度/℃MeltingtemperaturePCV3?F15′?CGGACTTGTAACGAATCCAAACT?3′7855．9PCV3?R15′?GGAGCATTTATGTCCCGGAAA?3′55．2PCV3?F25′?TATTCATTAGGAGGCCCACA?3′14252．6PCV3?R25′?GCAGTTTCCCATTCGTTTAG?3′52．1PCV3?F35′?GGAGACGACGACGCCACAG?3′14460．3PCV3?R35′?CGTGCCAGGGCTTGTTATTC?3′56．7PCV3?F45′?GCGGAAAGTTCCACTCGTAA?3′11455．3PCV3?R45′?GAAGAGGCTTTGTCCTGGGT?3′56．6PCV3?Probe5′?FAM?ACTCCACCATGAACGTCATTTCC?TAMRA?3′57．7

1.2 方法

1.2.1 熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 以1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，以FI/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4為引物，按照說明書使用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus)鑒定四對引物能否有效地檢測PCV3。再按照SYBR定量PCR的結(jié)果，根據(jù)F2/R2和F3/R3引物對所擴增區(qū)域的公共序列部分，設(shè)計TaqMan探針。再以1.29×105拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，在10 μL的PCR反應(yīng)體系中，分別加入終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00 μmol·L-1的引物F2/R2和終濃度為0.25、0.50、1.00、2.00 μmol·L-1的Probe，按照說明書使用iTaqTMUniversal Probes Supermix，根據(jù)結(jié)果選定最佳的引物濃度和探針濃度。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建 按照說明書使用iTaqTMUniversal Probes Supermix，加入最佳濃度的引物和探針，以1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進行熒光定量PCR反應(yīng)。將所得結(jié)果中的Ct值為Y軸、1.29 × lg(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，拷貝·μL-1)為X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 敏感性和特異性試驗 以1.29×100～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，用本研究所構(gòu)建的熒光定量PCR和本實驗室所使用的常規(guī)PCR[4]進行檢測，確定兩種方法的敏感性并作比較；以陽性PCV2b、PCV2d、PEDV、PRRSV、PoRV、HPS、App、Bb、Pm DNA或者cDNA為模板，進行熒光定量PCR以確定該方法的特異性。

1.2.4 重復(fù)性試驗 分別以1.29×102、1.29×105、1.29×108拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，進行3次批內(nèi)和批間熒光定量PCR，根據(jù)結(jié)果中的Ct值計算批次內(nèi)變異系數(shù)和批次間變異系數(shù)，并以此判定該方法的重復(fù)性。

1.2.5 臨床樣品的檢測 應(yīng)用本研究建立的TaqMan熒光定量PCR方法和常規(guī)PCR方法檢測2016—2017年間湖北省及周邊地區(qū)所收集的124份DNA樣品，將Ct值小于30的樣品判定為陽性，同時使用本實驗室建立的PCV2熒光定量PCR方法檢測樣品中的PCV2[10]，以此評估PCV3和PCV2在該地區(qū)的流行情況。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR引物和探針的選定

以1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，分別以FI/R1、F2/R2、F3/R3、F4/R4為引物，按照說明書使用HieffTMqPCR SYBR?Green Master Mix (Low Rox Plus)鑒定四對引物能否有效地檢測PCV3，得到4條標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖略)，均呈良好的線性關(guān)系，證明四對引物均能有效檢測PCV3。因為F2/R2和F3/R3所擴增產(chǎn)物的序列具有交叉區(qū)域，故根據(jù)此交叉區(qū)域設(shè)計探針。

2.2 熒光定量PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

以提高擴增效率和敏感度為標(biāo)準(zhǔn)，以1.29×105拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，對F2/R2引物濃度和探針濃度進行優(yōu)化。優(yōu)化后的反應(yīng)體系(10 μL)：2× iTaqTMUniversal Probes Supermix 5 μL，F(xiàn)2/R2(10 μmol·L-1)各0.5 μL，TaqMan Probe(5 μmol·L-1)0.5 μL，待檢模板(100 ng最優(yōu))2 μL，補加Nuclease-free water至10 μL。反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建

利用優(yōu)化后的定量PCR反應(yīng)對1.29×102～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進行定量，以Ct值為Y軸，1.29 × lg(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒，拷貝·μL-1)為X軸構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)方程為：Y=-3.258X+36.721，相關(guān)系數(shù)R2為0.996(圖1)，擴增效率為100.72%，說明Ct值與模板量之間呈良好的線性關(guān)系。本方法判定標(biāo)準(zhǔn)：Ct值低于30，且出現(xiàn)典型的擴增曲線的樣品為陽性；Ct值大于32或無有效Ct值的樣品為陰性。

圖1 PCV3 TaqMan探針熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of PCV3 ORF3 genes by TaqMan probe real-time PCR

2.4 敏感性和特異性試驗

以1.29×101～1.29×109拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，分別使用本研究所建立的熒光定量PCR方法和普通PCR方法擴增，檢驗定量PCR和常規(guī)PCR的敏感性并做對比，結(jié)果顯示定量PCR方法的最低檢出量為1.29×102拷貝·μL-1(圖2A)，而常規(guī)PCR在1.29×104拷貝·μL-1時僅能從凝膠電泳圖上看到微弱的目的條帶(圖2B)，表明本研究所建立的定量PCR方法敏感性是常規(guī)PCR的1 000倍左右。

用建立的PCV3熒光定量PCR方法檢測PCV2b、PCV2d、PEDV、PRRSV、PoRV、Hps， App、Bb、Pm DNA或者cDNA樣品，均未出現(xiàn)陽性擴增現(xiàn)象，表明該方法特異性良好(圖3)。

2.5 重復(fù)性試驗

選取1.29×102、1.29×105、1.29×108拷貝·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，用本研究所建立的熒光定量PCR分別進行3次批內(nèi)重復(fù)和3個批間檢測，各個濃度的Ct值、批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)見表3，該方法批內(nèi)重復(fù)和批間重復(fù)變異系數(shù)均小于1.5%，說明本研究所建立的熒光定量PCR方法具有良好的重復(fù)性。

2.6 臨床樣品的檢測

結(jié)果顯示，常規(guī)PCR檢測出樣品中PCV3陽性率為1.62% (2/124)，本研究所建立定量方法的陽性率為8.06% (10/124)，這與袁萬哲研究團隊使用TaqMan熒光定量PCR檢測的PCV3陽性率12.5%(14/112)基本一致[11]，但是顯著低于馬靜云研究團隊使用SYBR熒光定量PCR檢測的PCV3陽性率86.70% (176/203)[12]，這可能與樣品來源有關(guān)，本研究中所用樣品來自科前生物股份有限公司，而其他方法檢測的樣品主要源于具有典型病癥的豬。檢測陽性樣品和PCV3標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒均呈現(xiàn)正常的“S”形擴增曲線，陰性對照無擴增曲線。樣品中PCV2的陽性率為72.78% (90/124)，PCV2和PCV3共感染率為8.06% (10/124)。

A.熒光定量PCR方法結(jié)果(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度1.29×109～1.29×101拷貝·μL-1)；B.普通PCR方法結(jié)果(標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度1.29×107～1.29×100拷貝·μL-1)；M. DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；P. 陽性對照；N.陰性對照A. Result of real-time qPCR (standard plasmid concentration: 1.29×109 - 1.29×101 copies·μL-1); B. Result of common PCR (standard plasmid concentration: 1.29×107 - 1.29×100 copies·μL-1); M. DNA marker; P. Positive control; N. Negative control

圖2 敏感性試驗Fig.2 Sensitivity test

PCV3樣品為陽性；PCV2b、PCV2d、PEDV、PRRSV、PoRV、Hps、App、Bb、Pm DNA或者cDNA樣品均為陰性PCV3 samples were positive; PCV2b, PCV2d, PEDV, PRRSV, PoRV, Hps, App, Bb, Pm DNA or cDNA samples were negative

圖3 特異性檢驗Fig.3 The specificity test

3 討 論

2016年以來，中國、美國、韓國、波蘭等多個國家均報道稱通過宏基因組等技術(shù)發(fā)現(xiàn)PCV3，其在各國的流行情況呈上升趨勢，并且各國之間PCV3的同源性和序列相似性很高，提示PCV3可能存在跨國傳播情況[5-8]。PCV3感染能導(dǎo)致和PCV2感染相似的臨床癥狀，并且在PDNS(皮炎腎炎綜合征)豬的心、腎、肺、淋巴結(jié)組織以及皮膚組織等處均能檢測到病毒核酸的存在[4-5]。本實驗室前期構(gòu)建的常規(guī)PCR方法[8]，靈敏度亟待提高，因此有必要建立一種敏感性更高的檢測方法來檢測PCV3。

表3熒光定量PCR的批內(nèi)和批間重復(fù)檢測結(jié)果

Table3Theintra-andinter-assayCVsforCtvaluesresultofreal-timeqPCR

重復(fù)性試驗Reproducibilitytest標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度/(拷貝·μL-1)StandardplasmidconcentrationCt值(x±s)Ctvalue(x±s)變異系數(shù)(CV)/%Coefficientofvariation批內(nèi)重復(fù)1．29×10230．97±0．210．69Intra?assay1．29×10521．04±0．231．081．29×10810．33±0．121．16批間重復(fù)1．29×10230．30±0．351．16Inter?assay1．29×10520．41±0．301．471．29×10810．62±0．161．47

熒光定量PCR技術(shù)憑借其快速、高效、特異和穩(wěn)定等特點在目前的病原檢測工作中被廣為應(yīng)用[9]。目前最常用的熒光定量方法主要分為兩種，SYBR染料為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法和TaqMan探針為基礎(chǔ)的熒光定量PCR方法。相比于染料法熒光定量PCR方法，TaqMan探針定量PCR技術(shù)擁有更高的敏感性[13-14]，故本研究中采用兩種定量方法相結(jié)合的方式，先采用染料法對初設(shè)計的多對定量引物進行初步篩選，再根據(jù)篩選結(jié)果，設(shè)計TaqMan探針，建立TaqMan探針定量PCR檢測方法雛形并逐步優(yōu)化完善。本研究中引物和探針的設(shè)計基于NCBI中已公布的所有PCV3全基因序列以及相應(yīng)的PCV3Cap基因序列，并且將所設(shè)計引物和探針與Sus scrofa Refseq mRNA數(shù)據(jù)庫，PCV1、不同基因型PCV2、PEDV等多種豬病原體基因序列進行比對，確保本研究定量方法的特異性。本研究所建立的TaqMan熒光定量PCR最低檢出限量為1.29×102拷貝·μL-1，明顯高于本實驗室之前使用的常規(guī)PCR方法[8]，與袁萬哲研究團隊建立TaqMan熒光定量PCR(1.02 × 102拷貝·μL-1)[11]和馬靜云研究團隊建立的SYBR熒光定量PCR[12]靈敏性(1.73×102拷貝·μL-1)相近，均能特異性地檢測PCV3，且穩(wěn)定性更高。

利用本研究所建立的TaqMan熒光定量PCR方法檢測2016-2017年間湖北省及其周邊地區(qū)豬場的病豬，核酸樣品中PCV3單獨存在情況和PCV2/PCV3共存在情況，PCV3的單獨感染率為8.06% (10/124)，PCV2/3共感染率為8.06% (10/124)；在之前的研究中PCV2/PCV3共感染分別是12.5%(14/112)[11]和15.8%(35/222)[8]。以上研究均證明PCV2感染和PCV3的感染之間存在密切的聯(lián)系，兩者之間的共感染機制研究仍有待深入研究。臨床中的PCV3感染情況需要持續(xù)監(jiān)測，PCV3的病毒分離以及PCV3與PCV2的共感染機制需要更多的關(guān)注。

4 結(jié) 論

成功建立PCV3 TaqMan熒光定量PCR檢測方法，能夠靈敏準(zhǔn)確的檢測臨床樣品中PCV3的存在情況，為PCV3的監(jiān)測和防控提供了有力的手段。

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