腸炎沙門菌luxS缺失株的構建及其生物學特性研究

于艷超，王莉莉，潘 巧，辛九慶，王秀梅* (.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，長春 308；.中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所 動物支原體創(chuàng)新團隊，哈爾濱 50069)

腸炎沙門菌(SalmonellaentericaSerovar Enteritidis)是具有廣泛宿主侵害性的人獸共患病原菌之一，可引起人和動物腸道或全身性疾病。大量應用抗生素導致沙門菌的耐藥性逐年增強[1]。因此，如何有效預防腸炎沙門菌感染已經(jīng)成為公共安全領域關注的焦點[2]。

細菌通過感應自身合成的自誘導信號分子(autoinducer, AI)，調(diào)控某些基因的表達，進而調(diào)控特定環(huán)境行為的過程，稱為群體感應(quorum sensing,QS)[3]。AI-2/LuxS感應系統(tǒng)在革蘭陰性菌和革蘭陽性菌中廣泛存在，S-核糖基高半胱氨酸酶(S-ribosylhomocysteinase, LuxS)是自誘導信號分子AI-2合成的關鍵酶[4]，該系統(tǒng)主要通過調(diào)控病原菌的毒力基因表達、生物被膜形成和藥物敏感性等生物學特性來實現(xiàn)對病原菌的調(diào)控。盡管AI-2/LuxS系統(tǒng)已經(jīng)在沙門菌中鑒定，但該系統(tǒng)對腸炎沙門菌生物學特性的調(diào)控目前還沒有相關報道。因此，本文通過構建AI-2/LuxS系統(tǒng)關鍵基因luxS缺失株，研究該系統(tǒng)對腸炎沙門菌生長特性、生物被膜形成能力和藥物敏感性等的作用，初步探究AI-2/LuxS系統(tǒng)對腸炎沙門菌生物學特性的影響，為深入研究該系統(tǒng)對腸炎沙門菌的調(diào)控提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及質(zhì)粒

禽腸炎沙門菌SE-SM32株由本實驗室分離鑒定并保存，EscherichiacoliATCC25922菌株由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所張萬江副研究員惠贈；E.coliDH5α及BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自南京諾唯贊生物科技有限公司；DF-1細胞、質(zhì)粒 pKD46、pKD3、pCP20、pET-28a均由本實驗室保存；Caco-2細胞購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；pMD18-T載體購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 主要試劑和儀器

DMEM培養(yǎng)基購自Hyclone公司；胎牛血清(FBS)購自Clark公司；電轉(zhuǎn)化儀購自Bio-Rad 公司；限制性內(nèi)切酶和T4 DNA ligase均購自NEB公司。

1.3 引物的設計

根據(jù)SE-SM32菌株luxS 基因的測序結果(結果未展示)，利用軟件Primer Premier 5.0設計luxS基因重組引物及鑒定引物(表1)。l1/l2用于擴增含luxS基因同源臂的氯霉素抗性基因的片段，luxS -F/R用于luxS基因突變的檢測，csgB-RT-F/R和csgD-RT-F/R分別用于熒光定量PCR擴增生物被膜形成相關基因csgB和csgD。引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

表1本研究所用的引物序列

Table1Primersusedinthisstudy

引物Primer引物序列(5′→3′)Sequence長度/bpLengthl1GCGCACATCACGCTCCAGAATATGACGGGCAATGTCCTGCGCTTCACTGATTAACGGCTGACATGGGAATTAG1049l2CGATGAACACCCCGCATGGCGACGCAATCACCGTGTTTGATCTGCGTTTTAGCGATTGTGTAGGCTGGAGluxS?FCAGTTCCTGCAGTTTTTCTTTC516luxS?RAGATAGCTTCGCAGTCGATCAcsgB?RT?FTGTTGACAATACTGGGTGCG143csgB?RT?RATTATCCGTGCCGACTTGACcsgD?RT?FACGCACTCAGGAAATTACCG147csgD?RT?RTGTCTTAACCGTATTCTCGCTG

1.4 電擊感受態(tài)細胞的制備

將pKD46 質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至 SM32 株中，構建重組菌SM32/pKD46。將該菌株于30 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日按1∶100轉(zhuǎn)接到30 mL含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，30 ℃繼續(xù)振蕩培養(yǎng)至OD600 nm為 0.2～0.3時，加入L-阿拉伯糖至終濃度為30 mmol·L-1，誘導菌體重組蛋白表達，離心收集菌體，按照常規(guī)方法制備電轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞[5]。

1.5 SE-SM32△luxS 基因缺失株的構建及鑒定

參考文獻的方法[6]，利用Red同源重組方法構建缺失株。以pKD3為模板，利用引物luxS-F/R PCR擴增出含有l(wèi)uxS基因同源臂和氯霉素抗性的luxS-pKD3片段并進行膠回收。然后將其電轉(zhuǎn)到含有pKD46質(zhì)粒的SE-SM32感受態(tài)細胞中，在Gam、Bet和Exo這三種λ噬菌體重組酶作用下發(fā)生一次同源重組, 重組產(chǎn)物SM32ΔluxS::cat經(jīng)PCR鑒定成功后，電轉(zhuǎn)入pCP20質(zhì)粒，通過質(zhì)粒pCP20去除氯霉素抗性基因，37 ℃培養(yǎng)后挑取單克隆，通過PCR擴增和測序鑒定luxS基因缺失成功。

1.6 luxS缺失株穩(wěn)定性

參考文獻的方法評價luxS缺失株穩(wěn)定性[7]，SM32ΔluxS在LB無抗性平板上連續(xù)劃線傳代，并分別于第1、5、10、15、20和25代時，挑取單菌落用鑒定引物進行PCR鑒定，測定缺失株中l(wèi)uxS基因是否發(fā)生回復突變。

1.7 藥物敏感性測試

按照美國臨床檢驗標準委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI)推薦的微量稀釋法進行藥物敏感性測定和結果判定[8]。測定了8種抗生素對菌株的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations, MICs)，包括環(huán)丙沙星(0.031 25～32 μg·mL-1)、諾氟沙星(0.25～256 μg·mL-1)、左氧氟沙星(0.062 5～64 μg·mL-1)、氨芐西林(0.125～128 μg·mL-1)、四環(huán)素(0.125～128 μg·mL-1)、多西環(huán)素(0.125～128 μg·mL-1)、氯霉素(0.125～128 μg·mL-1)和氟苯尼考(0.125～128 μg·mL-1)。在第1孔中加入180 μL MH培養(yǎng)基，第2—12孔中分別加入100 μL MH培養(yǎng)基。然后在第1孔中加入20 μL 的藥物，吹打混勻后吸出100 μL加入到第2孔中，依次倍比稀釋至第12孔。再將稀釋好的菌液分別加入第1—11孔內(nèi)，第12孔不加菌液作為陰性對照。37 ℃培養(yǎng)20 h，每次做3個重復，EscherichiacoliATCC25922作為質(zhì)控菌株，同時測定其MIC值。

1.8 生長曲線測定

參照Chaudhari和Kariyawasam[9]的方法，測定SM32、SM32ΔluxS生長曲線。將細菌培養(yǎng)至OD600 nm=1，種子液按1∶100接種于20 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 180 r·min-1培養(yǎng)，間隔1 h取樣一次，每次取1 mL菌液，連續(xù)測定13 h內(nèi)細菌OD600 nm的吸光度，記錄結果并繪制生長曲線，生長曲線試驗重復三次。

1.9 激光共聚焦觀察細菌生物被膜

參照文獻方法[10]，利用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察細菌生物被膜的形態(tài)，SM32、SM32ΔluxS各200 μL分別加入激光共聚焦皿中37 ℃培養(yǎng)24 h后，PBS洗3次，以除去松散附著的細菌，加1 mL 4%多聚甲醛，固定細菌，室溫靜置30 min，PBS洗3次。然后利用SYTO 9核酸染料進行染色。室溫靜置避光孵育15 min，PBS洗3次以洗去多余染料。激光掃描共聚焦顯微鏡觀察其在熒光模式下的變化。

1.10 Real-time PCR檢測生物被膜形成相關基因csgB和csgD的轉(zhuǎn)錄

以甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內(nèi)參基因，用Real-time PCR對csgB和csgD基因的轉(zhuǎn)錄進行相對定量。參照ABI Power SYBR試劑盒說明書選用反應體系及擴增條件。反應體系20 μL：Realtime PCR Marster Mix 10 μL，模板1 μL，Primer 1 (10 pmol·L-1) 0.5 μL，Primer 2 (10 pmol·L-1) 0.5 μL，ddH2O 8 μL。擴增條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 1 min；循環(huán)次數(shù) 40 次。同時增加熔解曲線反應條件，檢測引物特異性。數(shù)據(jù)分析采用2-△△Ct(Livak)法[11]，計算基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。

1.11 細胞黏附侵襲試驗

參考文獻方法[12]，測定細菌對DF-1細胞和Caco-2細胞的黏附侵襲。將親本株SM32和缺失株SM32ΔluxS接種至LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600 nm=0.6～0.8，收集細菌于4 ℃離心5 min，離心力為6 000 r·min-1，無菌PBS洗3次，再用DMEM重懸菌體沉淀。同時將細胞鋪24孔板，37 ℃培養(yǎng)至半融合狀態(tài)，并調(diào)整每孔的細胞密度為 2×106個，按感染復數(shù)MOI為1∶200的比例加入細菌，共同孵育2 h。隨后用無菌PBS清洗3次以除去未黏附的細菌，在已黏附細菌的細胞內(nèi)加入0.5% Triton X-100裂解液200 μL，室溫裂解10 min后加入800 μL PBS。細胞懸浮液在PBS中連續(xù)進行10倍稀釋，涂布在LB瓊脂板上過夜培養(yǎng)后，計算細菌的黏附數(shù)。細菌侵襲試驗的方法中，細胞培養(yǎng)、感染和計數(shù)的操作方法與前述黏附試驗相同。細胞與細菌共同孵育后加入慶大霉素至終質(zhì)量濃度100 μg·mL-1，37 ℃孵育1 h以殺死細胞外的細菌，用0.5%Triton X-100裂解被細菌侵襲的細胞，倍比稀釋涂板計數(shù)。每組試驗均重復三次，每次試驗三個重復。

1.12 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)使用GraphPad PRISM 5.0軟件分析，當兩個試驗組進行比較時使用t檢驗分析，P<0.05時判定為顯著性差異。

2 結 果

2.1 沙門菌luxS基因缺失株的構建

以pKD3質(zhì)粒為模板，利用引物l1/l2擴增出含有氯霉素抗性基因的融合PCR產(chǎn)物luxS-pKD3，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小約為1 049 bp，與預期結果相符(圖1A)，將其電轉(zhuǎn)入含有pKD46質(zhì)粒的SE菌株中，在含有氯霉素的LB平板上，37 ℃過夜培養(yǎng)后篩選陽性克隆，經(jīng)luxS-F/R引物鑒定，陽性克隆條帶大小為1 453 bp，親本株條帶大小為516 bp(圖1B)，利用質(zhì)粒pCP20消除抗性基因，再次使用luxS-F/R引物對抗性消失的克隆進行檢測，此時菌株條帶大小約為220 bp(圖1C)。PCR及測序結果表明，氯霉素抗性基因成功去除，獲得SM32ΔluxS缺失株。

A.融合片段的擴增(M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1. 陰性對照; 2. 融合片段luxS-pKD3)；B.引物luxS-F/R鑒定SM32ΔluxS::cat(M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1.SM32；2、3. SM32ΔluxS::cat)；C.引物luxS-F/R鑒定SM32ΔluxS(M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1.SM32；2.SM32ΔluxS::cat；3～5. SM32ΔluxS)A. Fusion fragment amplification (M. DNA molecular mass standards; 1. Negative control; 2. Fusion fragment, luxS-pKD3); B. Identification of SM32ΔluxS:: cat by primer luxS-F/R (M. Plasmid standards; 1. SM32; 2, 3. SM32ΔluxS::cat); C. Identification of SM32ΔluxS by primer luxS-F/R (M. DNA molecular mass standards; 1. SM32;2.SM32-ΔluxS::cat; 3-5. SM32ΔluxS)

圖1 luxS缺失株的鑒定Fig.1 Identification of the luxS mutant strain

2.2 SM32ΔluxS體外遺傳穩(wěn)定性

SM32ΔluxS缺失株體外連續(xù)傳代，取第 1、5、10、15、20、25 代單菌落用鑒定引物luxS-F/R 進行 PCR 鑒定，結果均可擴增約220 bp的目的片段，未發(fā)生回復突變，表明缺失株luxS基因能夠在體內(nèi)穩(wěn)定遺傳(圖2)。

2.3 藥敏試驗

利用微量稀釋法測定親本株和缺失株對8種抗菌藥物的最小抑菌濃度，結果如表2所示，與親本株相比，△luxS突變株的藥物敏感性均有不同程度的提高，對氟喹諾酮類的敏感性提高 128～256 倍，對β-內(nèi)酰胺類提高8倍，四環(huán)素類提高2～4倍，氯霉素類提高4～8倍，表明luxS基因突變提高了腸炎沙門菌對部分藥物的敏感性。

2.4 生長曲線

連續(xù)測定了親本株和缺失株在13 h內(nèi)的生長曲線，如圖3所示，缺失株SM32ΔluxS生長速度略快于親本株SM32，在最初的0～2 h內(nèi)，親本株與缺失菌株生長速率大致相同，在3～13 h時，缺失菌株生長速率有所增加。

2.5 生物被膜形成能力測定

如圖4所示，激光共聚焦圖像較直觀地呈現(xiàn)了親本株和缺失株的生物被膜形態(tài)，其中綠色代表活菌，如圖4A所示，野生菌的生物被膜比較疏松，不能聚集成團；而luxS基因缺失株的生物被膜形成更多聚集體，聚集成團且結構致密 (圖4B)，其生物被膜形成能力明顯強于親本株。隨后選取生物被膜形成相關基因csgB、csgD進行了轉(zhuǎn)錄水平的檢測，發(fā)現(xiàn)與野生菌相比，缺失株中的csgB、csgD的表達水平未發(fā)生明顯變化(數(shù)據(jù)未展示)，表明luxS對腸炎沙門菌生物被膜的影響與csgB和csgD基因無關，可能通過其他機制引起。

2.6 細胞黏附、侵襲試驗

分別測定了親本株和缺失株對不同細胞系的黏附和侵襲能力，如圖5所示，與親本株相比，缺失株SM32ΔluxS 對DF-1細胞的黏附和侵襲能力均提高約14倍。為了驗證luxS缺失在其他細胞系中也存在黏附侵襲能力增強的作用，同時選用Caco-2細胞進行重復試驗，結果顯示缺失株對Caco-2細胞的黏附能力增加約3.8 倍，侵襲能力增加約3.7 倍，而且差異顯著(P<0.000 1，見圖5、圖6)。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；1～6. SM32ΔluxS；7. SM32；8.陰性對照M. DNA molecular mass standards;1-6. SM32ΔluxS; 7. SM32; 8. Negative control

圖2 luxS突變基因的穩(wěn)定性Fig.2 Stability of luxS mutant gene

表2氟喹諾酮類、β-內(nèi)酰胺類、四環(huán)素類、氯霉素類抗生素對親本株和缺失株的最小抑菌濃度

Table2MICsoffluoroquinolones,β-lactams,tetracyclineandchloramphenicolantibioticsforparentalstrainandmutantstrainsμg·mL-1

進行3次重復，每次重復設3個平行組，生長曲線代表其中一次重復試驗The experiments were performed three times independently in triplicates. The representative growth curve from one of three independent experiments is shown

圖3 SM32和SM32ΔluxS生長曲線Fig.3 The growth curves of SM32 and SM32ΔluxS

A.親本株SM32;B.缺失株SM32ΔluxSA. Parental strain SM32; B. The mutant strain SM32ΔluxS

圖4 激光共聚焦觀測生物被膜Fig.4 Confocal laser scanning of biofilms

試驗進行3次重復，每次重復設3個平行組。誤差線代表3次重復試驗的標準差。***.P<0.000 1The experiment was repeated 3 times, each repeated set of 3 parallel groups. The error bars represent the standard deviations of 3 replicates.***.P<0.000 1

圖5 SM32和SM32ΔluxS黏附、侵襲DF-1細胞Fig.5 Adhesion and invasion of DF-1 cells by SM32 and SM32ΔluxS

試驗進行3次重復，每次重復設3個平行組。誤差線代表3次重復試驗的標準差。***.P<0.000 1The experiment was repeated 3 times, each repeated set of 3 parallel groups. The error bars represent the standard deviations of 3 replicates.***.P<0.000 1

圖6 SM32和SM32ΔluxS黏附、侵襲Caco-2細胞Fig.6 Adhesion and invasion of Caco-2 cells by SM32 and SM32ΔluxS

3 討 論

根據(jù)自誘導信號分子的性質(zhì)及感應模式，群體感應系統(tǒng)目前主要有以下4種： AI-1/LuxIR系統(tǒng)、AI-3/QseC系統(tǒng)、AI-2/LuxS系統(tǒng)和AIP/Agr系統(tǒng)，前兩種系統(tǒng)在革蘭陰性菌中存在，AIP/Agr系統(tǒng)在革蘭陽性菌中存在[13]。AI-2/LuxS系統(tǒng)是最廣泛存在的群體感應系統(tǒng)，首次在海洋微生物哈氏弧菌中調(diào)控生物發(fā)光被發(fā)現(xiàn)[14]，已被報道調(diào)控許多致病菌毒力基因的表達，細菌生長，生物被膜形成和運動性[3]。盡管LuxS系統(tǒng)在沙門菌中已被鑒定，但其許多生物學功能仍不明確。本研究結果顯示，LuxS系統(tǒng)對腸炎沙門菌的生物學特性也有影響。

黏附和侵入宿主細胞是病原微生物引起感染的關鍵步驟，脂多糖、菌毛、毒力島等多種毒力因子可以促進這一復雜過程。本試驗中l(wèi)uxS缺失株對兩種細胞系DF-1細胞及Caco-2細胞的黏附侵襲能力均增加，說明缺失株黏附侵襲能力的增加與細胞系無關，這暗示luxS基因可能通過調(diào)控具有黏附侵襲功能的毒力因子，使缺失菌株對細胞黏附侵襲能力發(fā)生改變。傷寒沙門菌中，luxS缺失降低了SPI-1毒力島基因的表達而影響了菌株的侵襲力[15]。但腸炎沙門菌luxS缺失株侵襲力的增加是否與SPI-1毒力島基因有關，還需進一步的研究。

生物被膜是促進定植、免疫逃避和抗菌藥耐藥的關鍵結構，其形成在許多細菌中受luxS的影響[16]。本研究中l(wèi)uxS缺失后菌株的生物被膜形成能力顯著增強，說明luxS對腸炎沙門菌生物被膜形成也有影響。與我們的結果一致，Yoshida等[17]發(fā)現(xiàn)鏈球菌缺失luxS基因后生物被膜形成增加，進一步研究發(fā)現(xiàn)，luxS基因缺失后產(chǎn)生的葡糖基轉(zhuǎn)移酶清除了大量可發(fā)酵碳水化合物并生成非水溶性葡聚糖，導致生物被膜增厚。我們推測腸炎沙門菌缺失luxS后，生物被膜的增加也可能與葡糖基轉(zhuǎn)移酶有關，但其機制仍待進一步的研究。

此外，AI-2/LuxS系統(tǒng)以未知機制參與細菌藥物敏感性變化，如AI-2/LuxS系統(tǒng)參與中間鏈球菌的藥物敏感性[18]，滅活luxS基因提高了咽炎鏈球菌對紅霉素和氨芐西林的敏感性[19]。與上述研究相似，本試驗中l(wèi)uxS基因缺失引起缺失株對環(huán)丙沙星、氨芐西林和氯霉素等敏感性顯著提高，但缺失株的生長活性不受影響，說明luxS基因?qū)晁幬锩舾行缘挠绊懣赡芘c某些耐藥機制有關。已經(jīng)報道E.coli的QS系統(tǒng)通過AcrAB外排泵調(diào)控環(huán)丙沙星耐藥[20]，本研究中環(huán)丙沙星、氨芐西林和氯霉素為AcrAB-TolC外排泵的底物，據(jù)此推測，luxS缺失引起的腸炎沙門菌藥物敏性的增加也可能與AcrAB多藥外排泵有關。

4 結 論

luxS基因缺失不影響耐藥腸炎沙門菌的生長活性，但引起其藥物敏感性、生物被膜形成能力及對DF-1細胞和Caco-2細胞黏附侵襲能力等明顯增加，這些結果可為深入研究LuxS系統(tǒng)對腸炎沙門菌生物學特性的調(diào)控提供基礎數(shù)據(jù)。

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