豬圓環(huán)病毒3型LAMP檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用

姜辰龍，嚴(yán)秀文，張日騰，李 勇，姜 平，白 娟*(. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南京 0095；. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院農(nóng)業(yè)部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 0095)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus, PCV)屬于圓環(huán)病毒科圓環(huán)病毒屬成員。該病毒有兩個(gè)血清型，即PCV1和PCV2[1]。通常認(rèn)為，PCV1不具有致病性，偶見(jiàn)其引發(fā)的繁殖障礙，但其在豬群中廣泛感染。PCV2感染可引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)、豬皮炎腎病綜合征(porcine dermatitis nephropathy syndrome, PDNS)、豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease complex, PRDC)、母豬繁殖障礙綜合征、腹瀉及先天性震顫等多種臨床疾病，給全球養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，引起各國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的高度重視[2-3]。近年來(lái)，美國(guó)學(xué)者Phan、Palinski等首先發(fā)現(xiàn)繁殖障礙母豬、PDNS、豬心肌炎和多系統(tǒng)炎癥病變組織中存在一種新的豬圓環(huán)病毒，其Cap基因序列與PCV2的相似性僅24%～26%，命名為PCV3[4-5]。我國(guó)學(xué)者采用PCR方法從臨床發(fā)病豬肺和淋巴結(jié)組織樣品中檢出PCV3，證明我國(guó)也存在該病毒[6-7]。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)具有經(jīng)濟(jì)實(shí)用、高效、快速和簡(jiǎn)便等特點(diǎn)，已經(jīng)用于多種豬病原檢測(cè)，如豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征和豬偽狂犬病毒等[8-9]，但尚無(wú)PCV3 LAMP檢測(cè)方法報(bào)道。本研究根據(jù)PCV3基因序列，設(shè)計(jì)特異引物，成功建立了一種PCV3 LAMP檢測(cè)方法，56 ℃恒溫條件下35 min內(nèi)即可直接通過(guò)肉眼判定，并具有較高特異性和敏感性。

1 材料和方法

1.1 病毒、重組質(zhì)粒和病料

病毒：PCV3、PCV1、PCV2a、PCV2b、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬瘟病毒(CSFV)、豬流行性腹瀉病毒(PEDV)等均由本實(shí)驗(yàn)室分離保存。

重組質(zhì)粒：pMD19-T-Cap，含PCV3 ORF2基因，濃度為1.89×10-7ng·μL-1，基因拷貝數(shù)為5.22×1010copies·μL-1，由南京金思瑞生物技術(shù)有限公司構(gòu)建并提供。

豬臨床樣品：來(lái)源于2016—2017年江蘇、山東、浙江和福建省38個(gè)豬場(chǎng)，臨床上表現(xiàn)呼吸道癥狀，淋巴結(jié)和肺組織樣品68份。-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 病毒核酸提取

按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行抽提，采用TRIZOL試劑說(shuō)明書(shū)方法提取病毒核酸，置-20 ℃保存。

1.3 LAMP引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)PCV3 MO毒株(NCBI登錄號(hào):KX778720.1)Cap基因保守序列，運(yùn)用在線生物軟件(https://primere explorer.jp/)設(shè)計(jì)特異性引物，引物序列見(jiàn)表1，包括一對(duì)外引物F3和B3、一對(duì)內(nèi)引物FIP和BIP以及一對(duì)環(huán)引物L(fēng)oopF和LoopB，引物由Invitrogen公司合成。

表1LAMP擴(kuò)增引物

Table1PrimersusedinLAMPamplification

名稱Name引物序列(5′→3′)Primersequence位置/bpLocationF3TCCAGTTTTTTCCGGGACAT43?258B3AACACTTGGCTCCAAGACGFIPCTTTTTCTCCAGACCCACCCCA?AAAGCAGTGCTCCCCATTGBIPTTCCCGCCAGAATTGGTTTCGG?GCGGAAAGTTCCACTCGTAALFACACATATGACCCCACCGTLBGGTGAAGTAACGGCTGTGTTT

1.4 LAMP反應(yīng)體系

LAMP反應(yīng)體系25 μL，含10×Thermopol Buffer(NEB公司)2.5 μL、MgSO4(100 mmol·L-1)(NEB公司)1.5 μL、dNTP(10 mmol·L-1)(NEB公司)3.5 μL，內(nèi)引物FIP/BIP(40 μmol·L-1)各為1 μL，外引物F3/B3(5 μmol·L-1)各1 μL，環(huán)引物L(fēng)oopF/LoopB(10 μmol·L-1)各為1 μL，Bst DNA聚合酶(8 000 U·mL-1)(NEB公司)1.5 μL，甜菜堿(Betaine)(Sigma公司)2.0 μL，滅菌ddH2O 6.5 μL，模板DNA 1.5 μL。

1.5 LAMP反應(yīng)體系和條件優(yōu)化

按下列成分的濃度進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化：dNTP濃度梯度4、6、8、10和12 mmol·L-1；Mg2+濃度120、100、80、60和40 mmol·L-1；甜菜堿量4.0、3.0、2.0、1.0和0 μL；內(nèi)、外引物(μmol·L-1)比12∶1、10∶1、8∶1、6∶1和4∶1。

反應(yīng)溫度優(yōu)化：溫度設(shè)置(67、65、63、61、59和57 ℃)；反應(yīng)時(shí)間設(shè)置為(40、38、36、34和32 min)5個(gè)梯度，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物于1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果，根據(jù)條帶擴(kuò)增效果確定最佳反應(yīng)條件。

1.6 LAMP敏感性試驗(yàn)

將重組質(zhì)粒pMD19-T-Cap陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至106copies·μL-1，按10倍倍比稀釋至100.1copies·μL-1，用優(yōu)化好的PCV3-LAMP方法和常規(guī)RT-PCR方法同步進(jìn)行敏感性比較。并對(duì)以上結(jié)果分別用SYBR Green Ⅰ染料進(jìn)行顯色，篩選最佳染料。

1.7 LAMP特異性試驗(yàn)

取PRRSV、PRV、PCV1、PCV2和豬瘟病毒樣品，提取病毒基因組，用LAMP方法檢測(cè)，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

用Olige軟件分析LAMP目的片段中的酶切位點(diǎn)，篩選單一的HaeⅡ(識(shí)別GCGC)，進(jìn)行酶切反應(yīng)。20 μL酶切反應(yīng)體系包括：HaeⅡ(TaKaRa公司) 1.5 μL，LAMP產(chǎn)物1 μL，10×Buffer 2 μL，15.5 μL ddH2O。37 ℃反應(yīng)2 h，取15 μL的酶切產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行鑒定，酶切產(chǎn)物大小應(yīng)為184 bp。

1.8 PCR方法檢測(cè)PCV3

按Palinski等[5]方法進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性20 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。引物為5′-CCACAGAAGGCGCTATGTC-3′和5′-CCGCATAAGGGTCGTCTTG-3′，PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2 結(jié) 果

2.1 LAMP反應(yīng)體系和條件優(yōu)化

采用LAMP體系內(nèi)不同濃度組分，進(jìn)行反應(yīng)條件優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖1，確定25 μL最佳反應(yīng)體系成分為：10×Thermopol Buffer 2.5 μL，MgSO4(100 mmol·L-1)1.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1)3.5 μL，外引物F3/B3(4 μmol·L-1)各1 μL，內(nèi)引物FIP/BIP(40 μmol·L-1)各為1 μL，環(huán)引物L(fēng)F/LB(10 μmol·L-1)各為 1 μL，Bst DNA聚合酶(8 000 U·mL-1)1.5 μL，甜菜堿(Betaine)2 μL，滅菌ddH2O 6.5 μL，模板cDNA 1.5 μL。最佳反應(yīng)溫度為59 ℃，最短反應(yīng)時(shí)間為36 min。

A. dNTP濃度優(yōu)化; B.Mg2+優(yōu)化；C.甜菜堿優(yōu)化；D.內(nèi)外引物濃度比優(yōu)化；E.溫度優(yōu)化；F.時(shí)間優(yōu)化；M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；N.陰性對(duì)照A. Optimization of dNTP concentration; B. Mg2+ concentration; C. Betaine concentration; D. Ratio of forward and reverse primers concentration; E. Temperature; F. Reaction time; M. DNA marker DL2000；N. Negative control

圖1 PCV3 LAMP反應(yīng)體系和條件優(yōu)化結(jié)果Fig.1 Optimization of the reaction system and conditions of LAMP for detection of PCV3

反應(yīng)產(chǎn)物用SYBR Green Ⅰ(Invitrogen公司)染料進(jìn)行顯色比較。

2.2 可視性結(jié)果觀察

LAMP反應(yīng)過(guò)程中，dNTP析出的焦磷酸根離子與反應(yīng)溶液中的Mg2+結(jié)合，產(chǎn)生焦磷酸鎂白色沉淀(圖2A)。SYBR Green Ⅰ則通過(guò)結(jié)合到雙鏈DNA的小溝產(chǎn)生綠色熒光，而陰性呈現(xiàn)黃色(圖2B)。

2.3 LAMP敏感性試驗(yàn)

取PCV3重組質(zhì)粒pMD19-T-Cap(濃度為1.89×10-7ng·μL-1，基因拷貝數(shù)為5.22×1010copies·μL-1)，用蒸餾水做10倍梯度稀釋，采用LAMP和PCR檢測(cè)PCV3，結(jié)果為：常規(guī)PCR方法可檢測(cè)102copies·μL-1濃度的質(zhì)粒，LAMP反應(yīng)可檢測(cè)到10拷貝·μL-1濃度的質(zhì)粒，比常規(guī)PCR方法敏感10倍。

A.不加染料觀察；B. SYBR Green Ⅰ顯色結(jié)果A. LAMP positive products without stain components; B. LAMP positive products by adding SYBR Green Ⅰ

圖2 LAMP兩種染料可視化效果比較Fig.2 Observation of LAMP amplification products by adding 2 staining components

A.LAMP電泳結(jié)果; B.RT-PCR; C.LAMP-SYBR Green Ⅰ顯色。1～9. 107 ～100.01 基因拷貝·μL-1; 10. 陰性對(duì)照；M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A. LAMP results; B. RT-PCR; C. Visual of SYBR Green Ⅰ. 1-9. 107 ～100.01 copies·μL-1; 10. Negative control; M. DL2000 DNA marker

圖3 LAMP反應(yīng)敏感性試驗(yàn)Fig.3 Sensitivity of LAMP

2.4 LAMP特異性試驗(yàn)

取PCV3、PRRSV、PRV、PCV1、PCV2和豬瘟病毒樣品進(jìn)行PCV3 LAMP檢測(cè)，結(jié)果顯示，PCV3樣品LAMP擴(kuò)增可見(jiàn)梯形條帶，其他病原檢測(cè)均未見(jiàn)條帶(圖4A)。

取PCV3 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物，采用HaeⅡ酶切，1.5%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，出現(xiàn)約184 bp條帶和126 bp(圖4B)，與預(yù)期計(jì)算結(jié)果相符，證明擴(kuò)增正確。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

取68份臨床發(fā)病豬組織樣品，采用LAMP顯色法與常規(guī)PCR同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表2，表明LAMP檢測(cè)PCV3陽(yáng)性檢出率為30.9%(21/68)，常規(guī)PCR陽(yáng)性率為26.5%(18/68)，LAMP方法檢出率高于常規(guī)PCR檢測(cè)結(jié)果，LAMP與常規(guī)PCR符合率為95.6%(65/68)。

A.不同病原的LAMP檢測(cè)結(jié)果；B. LAMP反應(yīng)產(chǎn)物鑒定結(jié)果；1. 陰性對(duì)照；2. 豬瘟病毒； 3. 豬流行性腹瀉病毒；4. 豬圓環(huán)病毒1型；5. 豬圓環(huán)病毒2a和2b型；6. 豬偽狂犬病毒；7. 豬圓環(huán)病毒3型；8. 豬繁殖與呼吸綜合征；9. Hae Ⅱ酶切LAMP產(chǎn)物結(jié)果；M. DL2000 DNA 相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)A. LAMP detection of different pathogens results; B. Identification results of LAMP reaction products; 1. Negative control; 2. CSFV; 3. PEDV; 4. PCV1; 5. PCV2a+2b; 6. PRV; 7.PCV3; 8.PRRSV; 9. LAMP products digested with Hae Ⅱ; M. DL2000 DNA marker

圖4 LAMP特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 Spicificity assay of LAMP

表2LAMP與PCR檢測(cè)臨床樣品PCV3結(jié)果的比較

Table2ComparisonofLAMPwithPCRresultsforPCV3inclinicalsamples

檢測(cè)方法DetectionmethodLAMP陽(yáng)性數(shù)/份Positivenumber陰性數(shù)/份Negativenumber總數(shù)/份TotalRT?PCR陽(yáng)性數(shù)/份Positivenumber18018陰性數(shù)/份Negativenumber34750總數(shù)/份Total214768

3 討 論

在2003年以前PCV2a為主要流行毒株，而近年來(lái)PCV2b感染較為普遍。豬圓環(huán)病毒3型(PCV3)是一種新的病原，2016年10月，Palinski等[5]報(bào)道了從流產(chǎn)胎豬中檢測(cè)到高拷貝的PCV3基因組。國(guó)外報(bào)道該病毒感染可能與豬皮炎和母豬繁殖障礙相關(guān)，但其致病性還不十分清楚。該病毒的檢測(cè)方法主要有PCR方法、real-time PCR方法和核酸探針?lè)椒╗10-12]。PCR方法具有靈敏性和特異性高的特點(diǎn)。我國(guó)學(xué)者采用PCR方法進(jìn)行了大量樣品檢測(cè)[12]，但需要價(jià)格昂貴的PCR檢測(cè)儀器。Real-time PCR及核酸探針?lè)椒l件要求更高，很難普及推廣。

環(huán)介導(dǎo)的恒溫?cái)U(kuò)增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)，是Notomi等[13]于2000年發(fā)明的一種體外恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)，不需要昂貴的儀器設(shè)備，在等溫條件下就能快速完成反應(yīng)[14-15]。目前該項(xiàng)技術(shù)已被廣泛用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲(chóng)和動(dòng)物胚胎鑒定等檢測(cè)。本研究所建立LAMP檢測(cè)方法只需在恒溫59 ℃條件下反應(yīng)36 min即可完成擴(kuò)增，通過(guò)在反應(yīng)管中加入染料經(jīng)顏色變化判定結(jié)果，達(dá)到快速檢測(cè)的目的。在篩選熒光染料、提高檢測(cè)結(jié)果靈敏度的研究結(jié)果上發(fā)現(xiàn)，SYBR Green Ⅰ比HNB顯色效果更直觀，敏感性也更佳。該方法同樣具備較好的特異性，靈敏度與real-time PCR相當(dāng)。臨床樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，LAMP與傳統(tǒng)的PCR有較高的符合率，與龐笑語(yǔ)等[16]報(bào)道的結(jié)果相符。這表明PCV3已經(jīng)普遍存在于我國(guó)豬群體內(nèi)，因此加強(qiáng)該病流行病學(xué)監(jiān)測(cè)顯得至關(guān)重要。本研究建立的針對(duì)PCV3的LAMP檢測(cè)方法快速簡(jiǎn)便，可用于PCV3臨床檢測(cè)，具有較好的應(yīng)用前景。

由于該技術(shù)具備極高的靈敏度，故在檢測(cè)過(guò)程中會(huì)不可避免出現(xiàn)假陽(yáng)性污染問(wèn)題。因此LAMP的檢測(cè)環(huán)境需要嚴(yán)格分區(qū)，操作規(guī)程一定要嚴(yán)謹(jǐn)，多通風(fēng)。針對(duì)此類問(wèn)題，我們?cè)谝院蟮难芯恐幸矔?huì)繼續(xù)尋找改進(jìn)的措施。

4 結(jié) 論

根據(jù)PCV3 ORF2基因保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物并優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了PCV3 LAMP檢測(cè)方法，該方法最低檢測(cè)限為1.0×101copies·μL-1，與PRRSV、PRV、CSFV、PCV1和PCV2等均無(wú)交叉反應(yīng)。臨床樣品檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCV3陽(yáng)性率占30.9%，與PCR檢測(cè)結(jié)果符合率為95.6%(65/68)。提示相對(duì)傳統(tǒng)PCR方法而言，該方法敏感特異，簡(jiǎn)便快速，可用于PCV3檢測(cè)和臨床診斷。

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