廣西某市屠宰豬淋巴結(jié)豬圓環(huán)病毒3型的病原檢測(cè)及遺傳演化分析

季程遠(yuǎn)，王蔚怡，馮選榕，姚 靜，黃 欣，馮園青，覃一峰，方慶勵(lì)，陳 櫻，歐陽康，韋祖樟，黃偉堅(jiān)(廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，南寧 530004)

豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus，PCV)是一種呈二十面體對(duì)稱、無囊膜的單股環(huán)狀負(fù)鏈DNA病毒。它是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒，成熟的病毒粒子平均直徑約為17 nm[1-2]。PCV主要分為三種血清型，PCV1、PCV2和PCV3。PCV1基因組序列為1 759 bp，包含7個(gè)開放閱讀框(ORFs)，即ORF1～ORF7；PCV2基因組序列為1 767或1 768 bp，包含11個(gè)開放閱讀框，即ORF1～ORF11[3]。各個(gè)開放閱讀框之間大小相距甚多，正鏈上包括ORF1、ORF5、ORF7、ORF10，負(fù)鏈上包括ORF2、ORF3、ORF4、ORF6、ORF8、ORF9、ORF11，雖然圓環(huán)病毒非常短小，但是這些開放閱讀框之間會(huì)有部分堿基重疊，這樣就可以充分利用病毒有限的遺傳物質(zhì)；PCV3基因組序列為2 000 bp，目前只確定了ORF1和ORF2，對(duì)于它的更多的開放閱讀框作用功能還沒有定論[4-5]。ORF1主要負(fù)責(zé)與病毒復(fù)制相關(guān)蛋白的編碼(Rep蛋白)，ORF2主要負(fù)責(zé)病毒衣殼蛋白的編碼(Cap蛋白)[6]。

PCV1雖普遍存在于豬群中，但是對(duì)豬沒有致病性[7]；PCV2被認(rèn)為是斷奶仔豬綜合征(postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)的主要病原，導(dǎo)致斷奶仔豬生長(zhǎng)緩慢，消瘦等，甚至一些呼吸道疾病、腸道疾病、繁殖障礙等也被證實(shí)與PCV2相關(guān)[8-10]；PCV3是2016年新發(fā)現(xiàn)的豬環(huán)狀病毒，與豬皮炎腎病綜合征(porcine dermatitis and nephropathy syndrome)相關(guān)，且會(huì)導(dǎo)致母豬死亡率和流產(chǎn)率升高[11]。

為了解PCV3在健康豬群中的感染情況，本研究對(duì)廣西某市屠宰場(chǎng)健康豬淋巴結(jié)進(jìn)行PCR檢測(cè)。對(duì)陽性樣品進(jìn)行全序列擴(kuò)增并分析比對(duì)序列，進(jìn)一步了解PCV3的遺傳變異情況，為廣西地區(qū)PCV3的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 2017年6月—2017年8月來自廣西某市屠宰場(chǎng)的淋巴結(jié)181份，進(jìn)行PCV3檢測(cè)。

1.1.2 主要試劑 PCR用預(yù)混酶購自Vazyme；DH5α感受態(tài)細(xì)胞、DNA抽提試劑盒購自康為世紀(jì)公司；氨芐西林鈉粉末購自Soarbio；pMD18-T載體、BanHⅠ內(nèi)切酶 、Hind Ⅲ內(nèi)切酶、DNA MarkerDL2000購自TaKaRa；DNA純化、質(zhì)粒小提試劑盒購自O(shè)MEGA。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì) PCV3的檢測(cè)引物是根據(jù)PCV3基因上保守片段設(shè)計(jì)的一對(duì)引物命名為PCV3-2F/PCV3-1R，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為649 bp；PCV3全基因引物分為PCVG2-F/G2-R和PCVG4-F/G4-R，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度分別是1 075和1 337 bp。引物使用終濃度為10 pmol·μL-1，稀釋后-20 ℃保存。引物序列和片段長(zhǎng)度如表1所示。

表1本研究所用引物列表

Table1Listofprimersusedinthisstudy

引物名稱Primers引物序列(5′→3′)Sequence片段長(zhǎng)度/bpProductsizePCV3?2F/1RACTTAGAGAACGGACTTGTAACGAA649AAATGAGACACAGAGCTATATTCAGPCVG2?F/G2?RTTGCACTTGTGTACAATTATTGCG1075ATCTTCAGGACACTCGTAGCACCACPCVG4?F/G4?RTCCACGGAGGTCTGTAGGG1337GATTCGTTACAAGTCCGTTCTC

1.2.2 病毒基因組DNA提取 取適量送檢組織病料置于碾缽中充分碾磨至糊狀，加入2～3 mL滅菌PBS(pH 7.42)混勻，將混合液吸至干凈的1.5 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱反復(fù)凍融3次。按照DNA提取試劑盒說明書，提取病毒基因組DNA，提取的DNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 DNA純化回收及重組質(zhì)粒鑒定 DNA純化回收按照試劑盒說明步驟操作，將膠回收產(chǎn)物與pMD18-T載體按其說明書進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化入DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑選單個(gè)菌落接種含有Amp(100 μg·mL-1)的LB培養(yǎng)基，放入37 ℃恒溫?fù)u床中以200 r·min-1培養(yǎng)12～14 h。按質(zhì)粒小提試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，用BamHⅠ、Hind Ⅲ內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒酶切鑒定，將酶切鑒定正確的質(zhì)粒送往上海杰李生物有限公司測(cè)序。

1.2.4 序列比對(duì)分析 通過DNAStar軟件編輯測(cè)序結(jié)果，將剪輯完成的核苷酸片段放到NCBI-Blast網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，得到的結(jié)果進(jìn)行初步分析。

2 結(jié) 果

2.1 淋巴結(jié)中PCV3病原檢測(cè)

對(duì)于廣西某市屠宰豬181份淋巴結(jié)進(jìn)行PCV3的病原檢測(cè)， PCV3電泳結(jié)果表明，陽性條帶在650 bp左右，與預(yù)期片段相一致，如圖1。其中PCV3陽性共44份。

1～3.擴(kuò)增的目的片段;N.陰性對(duì)照;M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-3.PCR product of fragments of PCV3; N. The negative sample; M. DNA marker (DL2000)

圖1 PCV3檢測(cè)結(jié)果Fig.1 The detecting results of PCV3

2.2 PCV3全基因的擴(kuò)增

用引物PCVG2F/R、PCVG4F/R對(duì)已經(jīng)確認(rèn)為PCV3陽性的樣品進(jìn)行全基因擴(kuò)增，分別得到長(zhǎng)度約為1 100和1 300 bp的片段，與預(yù)期片段相一致，見圖2、3。

2.3 PCV3 全基因核苷酸序列的遺傳演化分析

運(yùn)用MEGA5.2軟件將本研究的6株P(guān)CV3全基因核苷酸序列與國(guó)內(nèi)外26株P(guān)CV3全基因序列共同建立遺傳演化樹，結(jié)果如圖4。從圖中可以看出，世界各地的PCV3毒株主要分為兩大分支，其中有4株(GXDX2-14、GXDX2-2、GXDX1-82和GXDX2-15)位于其中一個(gè)分支，GXDX2-4和GXDX2-1位于另外一個(gè)分支。其中GXDX2-15毒株雖然和GXDX2-14、GXDX2-2、GXDX1-82這三株位于同一大的分支，但是與他們的距離比較遠(yuǎn)，說明它們的親緣關(guān)系可能有點(diǎn)遠(yuǎn)，其獨(dú)立在一個(gè)小分支上，反而和另一大分支上的GXDX2-4距離比較近。

1、2.擴(kuò)增的目的片段;N. 陰性對(duì)照;M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1, 2. PCR product of fragments of PCV3 genome; N.The negative sample; M. DNA marker (DL2000)

圖2 PCV3-G2的克隆Fig.2 Clones of the PCV3-G2

1～3.擴(kuò)增的目的片段;N. 陰性對(duì)照;M. DL2000 DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)1-3. PCR product of fragments of PCV3 genome; N.The negative sample; M. DNA marker (DL2000)

圖3 PCV3-G4的克隆Fig.3 Clones of the PCV3-G4

●.本研究所獲的PCV3全序列；■.首條PCV3全序列●. Full sequence of the PCV3 obtained by this study; ■. The complete sequence of the first PCV3

圖4 PCV3 全基因核苷酸序列的遺傳演化樹Fig.4 Genetic phylogenetic tree of PCV3 complete gene nucleotide sequence

2.4 國(guó)內(nèi)外PCV3全基因序列進(jìn)行同源性分析

運(yùn)用MegAlign軟件將本研究所獲的6株P(guān)CV3全基因序列與國(guó)內(nèi)外26株P(guān)CV3全基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)本研究得到的6株P(guān)CV3毒株之間相似性最高，在98.6%～99.4%，其中GXDX2-14與GXDX2-15相似性為99.4%，相似性較低的是GXDX1-82與GXDX2-1、GXDX1-82與GXDX2-4。與國(guó)內(nèi)外其他26條PCV3毒株比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毒株間相似性最高為99.6%(美國(guó)株KX458235.1與GXDX2-14)，相似性最低為98.6%(美國(guó)株KX778720與GXDX2-4)。國(guó)內(nèi)外PCV3全基因的相似性在98.6%～99.9%，說明目前世界各國(guó)的PCV3全基因序列相似性都比較高，遺傳關(guān)系比較近。

2.5 PCV3 ORF2基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹分析

對(duì)本研究6株毒株和國(guó)內(nèi)外26株P(guān)CV3毒株的ORF2進(jìn)行遺傳演化的分析，主要是依據(jù)ORF2的遺傳演化情況來對(duì)PCV3進(jìn)行分型。ORF2基因與全基因生成的進(jìn)化樹有所區(qū)別，但從圖6中可以看出，還是主要分為兩大分支。從圖中可以發(fā)現(xiàn)GXDX2-1、GXDX2-4、GXDX2-14和GXDX2-15同處于一大分支上，其中GXDX2-14和GXDX2-15與美國(guó)株KX458235.1、韓國(guó)株KY996345.1同處于一個(gè)小的分支，GXDX2-1和GXDX2-4同處于一個(gè)小的分支,在同一分支的還有三株韓國(guó)株KY996343.1、KY996339.1、KY996341.1，說明它們具有更近的親緣性。GXDX2-14和GXDX2-15在一個(gè)小分支上，與它們遺傳距離較近的有美國(guó)株KX458235.1、韓國(guó)株KY996345.1。GXDX1-82、GXDX2-2和美國(guó)株KX778720、韓國(guó)株KY996337.1、中國(guó)湖北株KY354038處于同一大分支上，分為二亞型，親緣性較近；而GXDX1-82和GXDX2-2又同處于一個(gè)小的分支下，親緣性更為接近。

圖5 國(guó)內(nèi)外PCV3全基因核苷酸序列同源性分析Fig.5 Homology analysis of nucleotide sequence of PCV3 whole gene at worldwide

●.本研究所獲的PCV3 ORF2 序列；■.首次發(fā)現(xiàn)的PCV3 ORF2序列●. ORF2 sequence of the PCV3 obtained by this study; ■. ORF2 sequence of the first PCV3

圖6 PCV3 ORF2基因核苷酸序列的遺傳進(jìn)化樹Fig.6 Genetic evolution of the nucleotide sequence of the PCV3 ORF2 gene

2.6 國(guó)內(nèi)外PCV3 ORF2基因序列同源性比較

本研究中6株P(guān)CV3的ORF2基因序列與國(guó)內(nèi)外26株P(guān)CV3的ORF2基因序列進(jìn)行同源性比較(圖7)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6株P(guān)CV3毒株的ORF2基因序列之間相似性最高可達(dá)99.8%(GXDX2-14與GXDX2-15)，相似性最低為97.2%(GXDX1-82與GXDX2-1)。這6株的ORF2基因序列與國(guó)內(nèi)外其他26株ORF2基因序列比較結(jié)果顯示，相似性為97.5%～99.7%。而國(guó)內(nèi)外所有ORF2基因序列相似性比較來看，相似性最高為100%(如中國(guó)福建株KY075987和中國(guó)河南株KY075988)。

2.7 PCVs ORF2基因的核苷酸序列遺傳演化分析

將本實(shí)驗(yàn)室已有的13條PCV2 ORF2基因和7條PCV3 ORF2基因以及從NCBI下載的PCV1 ORF2基因做成遺傳進(jìn)化樹，如圖8。從圖中可以看出，PCV1、PCV2和PCV3親緣性都比較遠(yuǎn)。雖然PCV1和PCV2都在同大一分支上，但是在分支中距離相差很遠(yuǎn)。PCV3在另外一個(gè)大分支上，且明顯與其他兩個(gè)型距離更遠(yuǎn)。說明PCV1、PCV2和PCV3三個(gè)基因型遺傳關(guān)系都比較遠(yuǎn)。

2.8 PCVs Cap蛋白的同源性比較

圖9中1～4株為PCV1 Cap蛋白；5～17株為PCV2 Cap蛋白；18～23株為PCV3 Cap蛋白。PCV1 Cap蛋白與PCV2 Cap蛋白之間的相似性為67.2%～69.8%；PCV1 Cap蛋白與PCV3 Cap蛋白之間的相似性為26.1%～27.0%；PCV2 Cap蛋白與PCV3 Cap蛋白之間的相似性為26.5%～29.9%。據(jù)此推測(cè)PCV2與PCV3交叉保護(hù)性極低。

圖7 國(guó)內(nèi)外PCV3 ORF2基因序列相似性比較Fig.7 Comparison of PCV2 ORF2 gene homology at home and abroad

3 討 論

近年來，世界各地生豬養(yǎng)殖業(yè)中關(guān)于PCV2感染的報(bào)道依然層出不窮，其可導(dǎo)致豬免疫功能下降，生長(zhǎng)發(fā)育受阻，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大額度經(jīng)濟(jì)損失[12]。而在2016年出現(xiàn)的豬圓環(huán)病毒新的血清型PCV3，更是給豬圓環(huán)病毒的防控增加了難度[13-14]。目前在健康屠宰豬群中關(guān)于PCV2的隱性感染已經(jīng)有所報(bào)道，而關(guān)于PCV3在健康屠宰豬群中的感染還未有報(bào)道。本研究通過調(diào)查廣西某市健康屠宰豬群PCV3的感染情況，并對(duì)PCV3進(jìn)行序列分析、比對(duì)，以了解病毒的遺傳演化和流行情況，對(duì)疾病防控以及疫苗研究等具有重要的指導(dǎo)意義。

本研究克隆得到的6株P(guān)CV3全基因組序列長(zhǎng)度均為2 000 bp，6株毒株之間相似性為98.6%～99.4%。與國(guó)內(nèi)外其他26條毒株比對(duì)發(fā)現(xiàn)，相似性為98.6%～99.6%。無論是廣西內(nèi)PCV3全基因組的相似性比對(duì)，還是國(guó)內(nèi)外PCV3全基因組的相似性比對(duì)，PCV3毒株之間相似性都非常高。通過構(gòu)建PCV3全基因的遺傳進(jìn)化樹可以發(fā)現(xiàn)，PCV3主要分為兩大分支，本試驗(yàn)擴(kuò)增得到的PCV3全基因在兩大分支中都有分布。PCV3 ORF2基因的相似性為97.2%～100%，相比較PCV2而言，PCV3的相似性更高，更為保守。從PCV3 ORF2基因的遺傳進(jìn)化樹來看，GXDX2-1、GXDX2-4、GXDX2-14和GXDX2-15同位于一亞型，GXDX1-82與GXDX2-2同位于二亞型。并且在一亞型中，似乎還可以分為兩個(gè)基因型，但由于PCV3為新發(fā)現(xiàn)病毒，GenBank上的基因序列還不夠多，無法對(duì)其下結(jié)論。

此外本研究構(gòu)建了PCV1、PCV2和PCV3全基因核苷酸序列進(jìn)化樹，從進(jìn)化樹中可以看出, PCV1和PCV2處于同一大分支，而PCV3處于另一分支。通過對(duì)PCVs的Cap蛋白進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)PCV2 Cap蛋白與PCV3 Cap蛋白之間的相似性僅為26.5%～29.9%，推測(cè)PCV2與PCV3交叉保護(hù)性極低。目前市場(chǎng)有眾多商品化的PCV2疫苗，對(duì)PCV2的防控起到一定的作用，但已有的PCV2疫苗無法對(duì)PCV3提供有效的免疫保護(hù)作用[15]，所以對(duì)PCV3的防控任重而道遠(yuǎn)。

●.首次發(fā)現(xiàn)的PCV3序列●. Sequence of the first PCV3

圖8 PCVs ORF2基因的核苷酸序列遺傳演化Fig.8 Genetic evolution of the nucleotide sequence of the PCVs ORF2

圖9 PCVs Cap蛋白的相似性比較Fig.9 Comparison of PCVs Cap homology

4 結(jié) 論

擴(kuò)增了6株豬圓環(huán)病毒3型全基因組序列，遺傳進(jìn)化分析可分為兩大型，彼此之間較為保守。通過對(duì)PCVs Cap蛋白的同源性進(jìn)行比對(duì)分析，推測(cè) PCV2與PCV3不具有交叉保護(hù)性。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] TISCHER I, GELDERBLOM H, VETTERMANN W, et al. A very small porcine virus with circular single-stranded DNA[J].Nature, 1982,295(5844):64-66.

[2] FRANZO G,TUCCIARONE C M,DOTTO G, et al. International trades, local spread and viral evolution: The case of porcine circovirus type 2 (PCV2) strains heterogeneity in Italy[J].InfectGenetEvol, 2015, 32:409-415.

[3] MOROZOV I, SIRINARUMITR T, SORDEN S D, et al. Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndrome[J].JClinMicrobiol, 1998, 36(9):2535-2541.

[4] MAHé D, BLANCHARD P, TRUONG C, et al. Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes[J].JGenVirol, 2000, 81:1815-1824.

[5] LIU Q, WILLSON P, ATTOH-POKU S, et al. Bacterial expression of an immunologically reactive PCV2 ORF2 fusion protein[J].ProteinExprPurif, 2001, 21(1):115-120.

[6] NAWAGITGUL P, MOROZOV I, BOLIN S R, et al. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein[J].JGenVirol, 2000, 81(Pt 9):2281-2287.

[7] TISCHER I, RASCH R, TOCHTERMANN G. Characterization of papovavirus-and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines[J].ZentralblBakteriolOrigA, 1974, 226(2):153-167.

[8] HARMS P A, SORDEN S D, HALBUR P G, et al. Experimental reproduction of severe disease in CD/CD pigs concurrently infected with type 2 porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].VetPathol, 2001, 38(5):528-539.

[9] CHOI C, KIM J, KANG I J, et al. Concurrent outbreak of PMWS and PDNS in a herd of pigs in Korea[J].VetRec, 2002, 151(16):484-485.

[10] HINES R K, LUKERT P D. Porcine circovirus as a cause of congenital tremors in newborn pigs[C]//Proceedings of America Association Swine Prsctitioners. Chicago:America Association Swine Prsctitioners,1994:344-345.

[11] PALINSKI R, PIEYRO P, SHANG P C, et al. A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure[J].JVirol, 2016, 91(1):e01879-16.

[12] GRAU-ROMA L, FRAILE L, SEGALéS J. Recent advances in the epidemiology,diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type 2[J].VetJ, 2011, 187(1):23-32.

[13] KU X,CHEN F,LI P,et al.Identification and genetic characterization of porcine circovirus type 3 in China[J].TransboundEmergDis, 2017, 64(3):703-708.

[14] CHEN G H, MAI K J, ZHOU L, et al. Detection and genome sequencing of porcine circovirus 3 in neonatal pigs with congenital tremors in South China[J].TransboundEmergDis, 2017, 64(6):1650-1654.

[15] 賀會(huì)利, 李 軍, 潘 艷, 等. 廣西首例豬圓環(huán)病毒3型的發(fā)現(xiàn)及其衣殼蛋白序列分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 48(8):1499-1503.

HE H L, LI J, PAN Y, et al. The first report of porcine circovirus type 3 infection in Guangxi and sequence analysis of its capsid protein[J].JournalofSouthernAgriculture, 2017, 48(8):1499-1503. (in Chinese)