猴源cathepsin基因shRNA文庫及其穩(wěn)定敲減細(xì)胞系的構(gòu)建

魏宇雙，劉姣揚(yáng)，韓瑩倩，郭珍珍，劉曉賀，巴 根，韓立強(qiáng)，王 江，褚貝貝，楊國宇(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部動(dòng)物生化與營養(yǎng)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是一種以豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)為病原體的疾病，可造成仔豬和育成豬呼吸障礙、母豬流產(chǎn)，具有較高的致死率，給全世界養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。目前關(guān)于PRRSV的研究多集中于病毒學(xué)特性、病毒的起源、進(jìn)化以及豬體對其產(chǎn)生的免疫應(yīng)答等方面[4-5]，而關(guān)于PRRSV如何依賴宿主因子完成吸附、入侵、RNA脫殼、核酸蛋白質(zhì)等生物大分子合成、子代病毒組裝和釋放生活周期的分子機(jī)制的研究尚不充分。

組織蛋白酶 (cathepsin) 是在各種動(dòng)物組織的細(xì)胞內(nèi)(特別是溶酶體部分)發(fā)現(xiàn)的一類蛋白酶，是半胱氨酸蛋白酶家族的主要成員，在生物界已發(fā)現(xiàn)20余種，人體中主要存在11種，是近年來備受關(guān)注的一類靶標(biāo)蛋白酶[6-7]。研究表明cathepsin與多種病理過程相關(guān)，例如cathepsin G通過切割白細(xì)胞介素6受體、水解活化細(xì)胞因子等途徑參與血管性炎癥、急性肺損傷等炎癥性疾病的發(fā)生[8]；由于cathepsin D的表達(dá)水平與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移之間的相關(guān)性，其表達(dá)水平的變化可以作為胃癌預(yù)后的判斷指標(biāo)之一[9]。而cathepsin在病毒復(fù)制周期中的作用也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，例如埃博拉病毒(Ebola virus, EBOV)入侵宿主細(xì)胞時(shí)，需要借助cathepsin B和cathepsin L使病毒表面糖蛋白構(gòu)象改變從而使病毒可以將遺傳物質(zhì)“注入”宿主細(xì)胞[10-11]；在肝癌細(xì)胞中，乙肝病毒的x基因 (HBx) 表達(dá)量與cathepsin S的表達(dá)量正相關(guān)，在瞬時(shí)過表達(dá)HBx的HepG2細(xì)胞中，HBx可能是通過上調(diào)cathepsin S的表達(dá)量促進(jìn)細(xì)胞增殖[12]；PRRSV通過激活NF-κB 通路和cathepsin L來上調(diào)乙酰肝素酶的表達(dá)，降解硫酸乙酰肝素從而促進(jìn)病毒的釋放[13]。由此，筆者推測其它組織蛋白酶也可能參與PRRSV的生活周期。本研究構(gòu)建了針對猴源cathepsin基因的shRNA真核慢病毒表達(dá)載體，與包裝質(zhì)粒 (pMD2.G, psPAX) 共同轉(zhuǎn)染 HEK293T/17細(xì)胞后收取慢病毒上清液，感染源于MA-104的非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞Marc145細(xì)胞系(對PRRSV易感)，獲得高效且穩(wěn)定敲減cathepsin基因的細(xì)胞株。該穩(wěn)定細(xì)胞系的建立為后續(xù)探究cathepsin在PRRSV生活周期中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

pLKO.1載體、慢病毒包裝載體psPAX2、pMD2.G、Ampicillin和Puromycin購自Sigma公司；人胚胎腎細(xì)胞HEK293T/17購自ATCC公司；猴胚胎腎上皮細(xì)胞Marc145來自河南省動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；PRRSV-GFP毒株由西北農(nóng)林科技大學(xué)周恩民教授饋贈(zèng)；DMEM、FBS以及胰酶購自Gibco；Prime Script RT Reagent Kit、SYBR Premix ExTaqⅡ、rTaq酶、DL10000 DNA Marker、DL2000 DNA Marker購自TaKaRa公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ-HF、AgeⅠ-HF及T4連接酶購自NEB公司；Lipofectamine?3000 Transfection Kit購自Promega公司；質(zhì)粒中提試劑盒為QIAGEN產(chǎn)品； TOP10大腸桿菌感受態(tài)為實(shí)驗(yàn)室自制。引物由上海生工生物工程有限公司合成；DNA測序由上海英濰捷基生物公司完成。

1.2 方法

1.2.1 猴源cathepsin基因shRNA重組質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定 RNA干擾 (RNA interference, RNAi) 是一種進(jìn)化上保守的抵御外來病毒或轉(zhuǎn)基因的防御機(jī)制[14-15]。將與靶基因mRNA同源的雙鏈RNA (double strand RNA, dsRNA) 導(dǎo)入細(xì)胞，shRNA的發(fā)卡結(jié)構(gòu)可被細(xì)胞切割成siRNA，然后siRNA 結(jié)合到RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合物上(RNA-induced silencing complex，RISC)，該復(fù)合物能夠結(jié)合到目的mRNA上并將其特異性地降解，從而產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型缺失[16-19]。本研究利用慢病毒載體把shRNA導(dǎo)入細(xì)胞，其在感染后可以整合到細(xì)胞的基因組上；并且載體中的U6 啟動(dòng)子確保了shRNA 長時(shí)間表達(dá)；這種整合的shRNA 序列可隨細(xì)胞DNA一起復(fù)制并被傳遞到子代細(xì)胞中去，從而使靶基因長期穩(wěn)定沉默。

首先，查找NCBI數(shù)據(jù)庫得到非洲綠猴(Chlorocebus sabaeus)的全部cathepsin基因；然后，使用Invitrogen公司在線軟件BLOCK-iT RNAi Designer，針對每種猴源cathepsin基因設(shè)計(jì)3條長度21 bp的shRNA序列，每條序列作用于不同靶點(diǎn)。shRNA退火形成雙鏈，與pLKO.1載體(經(jīng)EcoRⅠ-HF、AgeⅠ-HF處理)連接成重組質(zhì)粒(如圖1)；轉(zhuǎn)化大腸桿菌，37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，涂布于含100 μg·mL-1Ampicillin 的固體 LB 培養(yǎng)基倒置培養(yǎng)過夜。次日挑選陽性單克隆，以菌液為模板，PCR 擴(kuò)增鑒定插入片段。菌液PCR上游引物：5′-TCGACGGTATCGATCACGAGACTAG-3′；下游引物：5′-AATTGTGGATGAATACTGCCATTTG-3′。陽性結(jié)果經(jīng)上海英濰捷基生物公司測序正確后，按照中提試劑盒說明書抽提質(zhì)粒，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 shRNA表達(dá)原理Fig.1 Illustration of shRNA

1.2.2 慢病毒顆粒包裝 將HEK293T/17細(xì)胞以1.6×106·瓶-1的密度接種于T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度40%左右，按照Lipofectamine?3000 Transfection Kit說明書將重組質(zhì)粒與包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G共轉(zhuǎn)染。分別于48、72 h收取上清中的慢病毒，分裝凍存于-80 ℃。

1.2.3 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Marc145細(xì)胞系建立 以2×105·孔-1的密度接種Marc145細(xì)胞于6孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度30%～40%，棄去1 mL 培養(yǎng)基，加入1 mL慢病毒感染細(xì)胞。48 h 后用含10 μg·mL-1puromycin的DMEM完全培養(yǎng)基持續(xù)篩選至對照組細(xì)胞全部死亡。繼續(xù)使用含2 μg·mL-1puromycin的DMEM完全培養(yǎng)基篩選維持，待感染效果鑒定。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測 Trizol法抽提細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA；以實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法測定cathepsinmRNA 表達(dá)量的變化，得到敲減效率最高的細(xì)胞株。實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物見表1。

表1非洲綠猴cathepsin基因?qū)崟r(shí)熒光定量PCR引物序列

Table1Sequenceofquantitativereal-timePCRprimerforChlorocebussabaeuscathepsingenes

引物名稱Primername序列(5′→3′)Sequence上游引物Forwardprimer下游引物ReverseprimercathepsinACCCTGTGGTGCTTTGGCGGCGACCTCAGTGTCATTAGTTGcathepsinBCAGTGTCCCACCATCAAAGGCCATTACAGCCGTCCCcathepsinCGCGGCTTCCCATACCTCCCTCCATAGAAACCTCCCcathepsinDTGTGGAGGACCTGATTGCCGCTGGACTTGTCGCTGTTGTATcathepsinEGAATACTTCGGCACTATCTCCCACGGTCAGTCCTTCCACcathepsinFGAAGGCCAAGGTCTACATCATGCCATAGCCCACAAGCcathepsinGCCTGGTGCGAGACAACTTTGGATGGTCCGCTGATTcathepsinHACATACAGCACGGAGGAGTGGAAGGTGGGTAGGGAcathepsinKTTGCTGCTGAAACGAACATCCACCTTGCTGTTATcathepsinLATGAAGAAGGATGGAGGAGAAAGCCCAACAAGAACCcathepsinOCCAGCAGGTCATTGACTGTCAAAGGGCCAAAGGTAAGAcathepsinSCGGATTCTGTGGACTGGCGTGGCTTTGTAGGGATAcathepsinVGGGAATACAGCCAAGGGGCACCAGTCGCACTAAAAcathepsinWCCGCCTGGACATCTTTGTGGCTCTTCGGACCCTATcathepsinZAGGGAGAAGATGATGGCAGAACCTCGATGGCAAGGTTGTAT

1.2.5 PRRSV-GFP感染cathepsin shRNA-Marc145細(xì)胞株 將篩選得到cathepsin shRNA-Marc145細(xì)胞株以1×105·孔-1的密度接種于12孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度80%。感染PRRSV-GFP病毒 (MOI=1)，37 ℃吸附1 h后，用1%FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，置于倒置熒光顯微鏡觀察，并用酶標(biāo)儀檢測熒光結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 猴源cathepsin基因的shRNA靶序列

所構(gòu)建cathepsin基因shRNA 文庫包含15種猴源cathepsin基因，針對每種cathepsin基因分別設(shè)計(jì)的3個(gè)shRNA 靶點(diǎn)序列如表2。

表2猴源cathepsin基因shRNA靶序列

Table2TargetingsequenceofshRNAforChlorocebussabaeuscathepsingenes

目的基因Primername靶點(diǎn)(5′→3′)Targets靶點(diǎn)?1Target?1靶點(diǎn)?2Target?2靶點(diǎn)?3Target?3cathepsinAGGAGTACAAGAACAACAAACTGCACCTCCACTACTGGTTTGTGCTGCTTAGCTCACAGAAATAcathepsinBGGACAGGATCACTGTGGAATCGGATCACTGTGGAATCGAATCGGATCTGCATCCACACCAATGcathepsinCGCATCAAGGTGACCATTTACTGCGAGAATCCGTATACTAACCGGAACGGATGAGTGTGCAATTcathepsinDGCACGGACTCCAAGTATTACAGCCGCTACTACACTGTGTTTGGCAAATACAACAGCGACAAGTcathepsinEGGAGCTTGTCTGGGATCATTGGCTACGACCACTCCCATTTCTGCCCTTCCGACAAGATTAAGCcathepsinFGCCTGTCCGTCTTTGTCAATAGCGAGAAGGGTTACTACTACTGGGTTACTACTACTTGCATCGcathepsinGGGATTCCTCCAGAAGTCTTCAGGAGAACAATGAGAAGCTTCAGGACCATCCAGAATGACATCAcathepsinHGGAAGATAAATGCCCACAACAGCAACTGGAGGAAGATAAATGGCAAGGATGGTGATTGCAAGTcathepsinKGGAAGCAATATAACAGCAAGGGCAGTAATGACACCCTTTATAGCAACAAGCACTGGATAATTAcathepsinLGGGAAACACAGCTTCACAATGGCAGGTGATGAATGGCTTTCAGCCAGACTGTAGCAGTGAAGAcathepsinOGGGAGGCATTATACAGCATCAGCTCTAGTGGAGAAGCAAATCGGTCATTGACTGTTCGTATACcathepsinSGGTGTCTACTATGAACCATCCGGGAGACATGACCAGTGAAGAGGATATATTCGGATGGCAAGAcathepsinVGGGAAACATGGCTTCACAATGGGGAATACAGCCAAGGGAAACGCCATTCGTCCTTCCAGTTCTcathepsinWGGAGCAATACCTGTGGCATCAGCATCAATTTCTTGGATTTCGGCACAGAATTGCCCAGTACCTcathepsinZGCAACAGAAAGACTGGCTAACGGAGAAGATGATGGCAGAAATGGATCAACATCAAGAGGAAGG

2.2 猴源cathepsin 基因shRNA 重組質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定

用限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ-HF和AgeⅠ-HF對pLKO.1 載體進(jìn)行雙酶切，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離出7 500 bp 左右的目的條帶(如圖2)，回收該條帶得到pLK0.1酶切產(chǎn)物。猴源cathepsin基因shRNA 文庫共包含45對shRNA 寡核苷酸鏈退火雜交后形成雙鏈DNA，亞克隆至pLKO.1得到45個(gè)pLKO.1-cathepsinshRNA 重組質(zhì)粒。該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10 感受態(tài)，挑取陽性單克隆，菌液PCR鑒定得到273 bp產(chǎn)物的陽性菌(圖3)，測序。

M. DL10000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.陰性對照；2. pLKO.1質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物M. DL10000 marker; 1. Negative control; 2. The double-restriction endonuclease digestion products of pLKO.1 plasmids

圖2 pLKO.1質(zhì)粒的雙酶切Fig.2 Restriction enzymes digestion of pLKO.1 plasmids

M. DL2000相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)(DL2000 marker)；1. cathepsin A-1 shRNA-pLKO.1; 2. cathepsin A-2 shRNA-pLKO.1; 3. cathepsin O-1 shRNA-pLKO.1; 4. cathepsin O-2 shRNA-pLKO.1; 5. cathepsin D-1 shRNA-pLKO.1; 6.cathepsin D-2 shRNA-pLKO.1; 7.cathepsin Z-1 shRNA-pLKO.1; 8. cathepsin Z-2 shRNA-pLKO.1; 9.cathepsin B-1 shRNA-pLKO.1; 10. cathepsin B-2 shRNA-pLKO.1; 11. cathepsin C-1 shRNA-pLKO.1; 12. cathepsin C-2 shRNA-pLKO.1; 13. cathepsin E-1 shRNA-pLKO.1; 14. cathepsin E-2 shRNA-pLKO.1; 15. cathepsin F-1 shRNA-pLKO.1; 16. cathepsin F-2 shRNA-pLKO.1; 17. cathepsin G-1 shRNA-pLKO.1; 18. cathepsin G-2 shRNA-pLKO.1; 19. cathepsin H-1 shRNA-pLKO.1; 20. cathepsin H-2 shRNA-pLKO.1; 21. cathepsin L-1 shRNA-pLKO.1; 22. cathepsin L-2 shRNA-pLKO.1; 23. cathepsin K-1 shRNA-pLKO.1; 24. cathepsin K-2 shRNA-pLKO.1; 25. cathepsin S-1 shRNA-pLKO.1; 26. cathepsin S-2 shRNA-pLKO.1; 27. cathepsin V-1 shRNA-pLKO.1; 28. cathepsin V-2 shRNA-pLKO.1; 29. cathepsin W-1 shRNA-pLKO.1; 30. cathepsin W-2 shRNA-pLKO.1; 31. cathepsin A-3 shRNA-pLKO.1; 32. cathepsin B-3 shRNA-pLKO.1; 33. cathepsin C-3 shRNA-pLKO.1; 34. cathepsin D-3 shRNA-pLKO.1; 35. cathepsin E-3 shRNA-pLKO.1; 36. cathepsin F-3 shRNA-pLKO.1; 37. cathepsin G-3 shRNA-pLKO.1;38. cathepsin H-3 shRNA-pLKO.1; 39. cathepsin L-3 shRNA-pLKO.1; 40. cathepsin K-3 shRNA-pLKO.1; 41. cathepsin O-3 shRNA-pLKO.1; 42. cathepsin S-3 shRNA-pLKO.1; 43. cathepsin V-3 shRNA-pLKO.1; 44. cathepsin W-3 shRNA-pLKO.1; 45. cathepsin Z-3 shRNA-pLKO.1

圖3 重組質(zhì)粒的PCR鑒定Fig.3 PCR results of recombinant plasmid (portion)

2.3 cathepsin 基因敲減效率

慢病毒感染Marc145細(xì)胞48 h，用含10 μg·mL-1puromycin的DMEM完全培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞至對照組細(xì)胞死亡，換含2 μg·mL-1puromycin DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)維持。抽提對照細(xì)胞和敲減細(xì)胞全部RNA反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析cathepsinmRNA表達(dá)量。以β-actin作內(nèi)參，比較對照細(xì)胞與不同靶點(diǎn)敲減cathepsin基因的細(xì)胞mRNA表達(dá)量(如圖4)，選出敲減效率最高的細(xì)胞株(圖5)，各cathepsinshRNA-Marc145細(xì)胞株中cathepsinmRNA的表達(dá)量均明顯下降，表明成功構(gòu)建cathepsin基因敲減細(xì)胞系。為證明該細(xì)胞系的穩(wěn)定性，選取同一細(xì)胞株不同代次細(xì)胞進(jìn)行敲減效率檢測(圖6)，發(fā)現(xiàn)不同代次細(xì)胞敲減效率穩(wěn)定。進(jìn)一步證明所構(gòu)建細(xì)胞系高效且穩(wěn)定敲減cathepsin基因。

與shControl相比，**.P<0.001，***.P<0.000 1Compared with shControl, **.P<0.001，***.P<0.000 1

圖4 cathepsin基因不同靶點(diǎn)的敲減效率比較Fig.4 Comparison of knockdown efficiency of cathepsin genes at different targets

與shControl相比，**.P<0.001，***.P<0.000 1Compared with shControl, **.P<0.001，***.P<0.000 1

圖5 cathepsin shRNA-Marc145細(xì)胞株相應(yīng)cathepsin mRNA相對表達(dá)量Fig.5 The relative mRNA expression of cathepsin in Marc145 cell lines

shControl. 對照; shCTS A P3. cathepsin A shRNA-Marc145細(xì)胞株第3代細(xì)胞; shCTS A P8. cathepsin A shRNA-Marc145細(xì)胞株第8代細(xì)胞; shCTS A P12. cathepsin A shRNA-Marc145細(xì)胞株第12代細(xì)胞; shCTS D P3. cathepsin D shRNA-Marc145細(xì)胞株第3代細(xì)胞; shCTS D P9. cathepsin D shRNA-Marc145細(xì)胞株第9代細(xì)胞: shCTS D P22. cathepsin D shRNA-Marc145細(xì)胞株第22代細(xì)胞; shCTS V P3. cathepsin V shRNA-Marc145細(xì)胞株第3代細(xì)胞; shCTS V P10. cathepsin V shRNA-Marc145細(xì)胞株第10代細(xì)胞; shCTS V P18. cathepsin V shRNA-Marc145細(xì)胞株第18代細(xì)胞，與shControl相比，**.P<0.001, ***.P<0.000 1shControl. Control; shCTS A P3. The 3rd generation of cathepsin A shRNA-Marc145 cell line; shCTS A P8. The 8th generation of cathepsin A shRNA-Marc145 cell line; shCTS A P12. The 12th generation of cathepsin A shRNA-Marc145 cell line; shCTS D P3. The 3rd generation of cathepsin D shRNA-Marc145 cell line; shCTS D P9. The 9th generation of cathepsin D shRNA-Marc145 cell line: shCTS D P22. The 22nd generation of cathepsin D shRNA-Marc145 cell line; shCTS V P3. The 3rd generation of cathepsin V shRNA-Marc145 cell line; shCTS V P10. The 10th generation of cathepsin V shRNA-Marc145 cell line; shCTS V P18. The 18th generation of cathepsin V shRNA-Marc145 cell line.Compared with shControl, **.P<0.001, ***.P<0.000 1

圖6 不同代次cathepsin shRNA-Marc145細(xì)胞株相應(yīng)cathepsin mRNA相對表達(dá)量(部分)Fig.6 The relative mRNA expression of cathepsin in different generations of Marc145 cell lines (partial)

2.4 cathepsin L shRNA-Marc145細(xì)胞抑制PRRSV-GFP復(fù)制

將篩選得到的cathepsinshRNA-Marc145細(xì)胞接種于12孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度80%，按上述方法用PRRSV-GFP分別感染shControl-Marc145細(xì)胞和cathepsinL shRNA-Marc145細(xì)胞，48 h后置于熒光顯微鏡觀察，發(fā)現(xiàn)cathepsinL shRNA-Marc145細(xì)胞中PRRSV熒光強(qiáng)度明顯下降(圖7B)，酶標(biāo)儀檢測結(jié)果與熒光結(jié)果一致(圖7A)，表明敲減cathepsinL會(huì)顯著抑制PRRSV-GFP的增殖。

3 討 論

非洲綠猴體內(nèi)可以表達(dá)cathepsin A、B、C、D、E、F、G、H、K、L、O、S、V、W、Z，本研究設(shè)計(jì)了針對這些cathepsin基因的shRNA引物(表2)，構(gòu)建得到了45個(gè)重組質(zhì)粒，命名為pLKO.1-cathepsin shRNA(圖2、圖3)。利用該重組質(zhì)粒包裝慢病毒顆粒并感染Marc145細(xì)胞，篩選鑒定出45株穩(wěn)定且高效敲減cathepsin的細(xì)胞株，命名為cathepsin shRNA-Marc145細(xì)胞株(圖4～6)。這些細(xì)胞系經(jīng)PRRSV-GFP病毒感染，初步篩選出對PRRSV復(fù)制有影響的cathepsin(圖7)。Guo等[13]的研究表明PRRSV感染誘導(dǎo)乙酰肝素和cathepsin L表達(dá)，調(diào)節(jié)乙酰肝素轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞表面降解HS，從而促進(jìn)PRRSV子代病毒的釋放，這說明cathepsin L在PRRSV的釋放中發(fā)揮著重要作用。筆者的試驗(yàn)也證實(shí)了這一點(diǎn)，如圖7所示，敲減cathepsinL會(huì)顯著抑制PRRSV的增殖。因其他有效果cathepsin的分子機(jī)制正在進(jìn)一步解析中，所以在本文中沒有顯示。

PRRSV是高度變異的單股正鏈RNA囊膜病毒，其毒株的多樣加劇了藍(lán)耳病的臨床復(fù)雜性[20-21]。因此，單純針對其囊膜抗原研制的疫苗很難滿足生產(chǎn)上的防控需求[22-23]。研究顯示，PRRSV復(fù)制周期的每一步都依賴于宿主細(xì)胞蛋白：病毒首先結(jié)合細(xì)胞表面的硫酸類肝素和葡萄糖胺聚糖；然后囊膜蛋白與CD163結(jié)合使病毒發(fā)生細(xì)胞內(nèi)化；最后在網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)下形成內(nèi)吞體進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)[24-26]。進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的病毒粒子需進(jìn)一步脫殼釋放出RNA，進(jìn)行病毒的復(fù)制、組裝以及釋放。所以，通過調(diào)控宿主靶向蛋白來抑制病毒復(fù)制的思路成為一個(gè)新的研究方向[27]。

****.P<0.000 1

圖7 cathepsin L基因敲減抑制PRRSV-GFP復(fù)制Fig.7 cathepsin L knockdown inhibits PRRSV-GFP replication

本研究所探究的組織蛋白酶作為細(xì)胞中重要的蛋白酶類，同胞外蛋白酶一樣，可以重塑胞外基質(zhì)、降解胞內(nèi)不必要的細(xì)胞器及蛋白質(zhì)、降解胞內(nèi)基質(zhì)、傳遞細(xì)胞信號、調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[28-32]，極有可能在病毒與宿主的相互作用起關(guān)鍵作用。因此，未來工作的重點(diǎn)將集中在回答以下問題：1)PRRSV的表面蛋白是否需要經(jīng)細(xì)胞cathepsin切割，暴露出真正的抗原表位與細(xì)胞受體結(jié)合？2)PRRSV的核衣殼需要哪種cathepsin發(fā)揮功能，才能使位于其中的病毒RNA釋放到細(xì)胞核周區(qū)域？3)病毒RNA指導(dǎo)合成的病毒蛋白質(zhì)，是否需要細(xì)胞cathepsin的功能形成正確的空間結(jié)構(gòu)以有利于子代病毒的組裝？4)具體的分子機(jī)制又是如何？

綜上所述，本研究所構(gòu)建的猴源cathepsin基因穩(wěn)定且高效敲減細(xì)胞系，為進(jìn)一步篩選對PRRSV復(fù)制有影響的cathepsin奠定了基礎(chǔ)，為研究宿主細(xì)胞與PRRSV相互作用的分子機(jī)制提供了新的見解，這可能有助于我們進(jìn)一步了解PRRSV的發(fā)病機(jī)制。

4 結(jié) 論

本研究利用了RNAi原理，成功構(gòu)建了猴源cathepsin基因的shRNA文庫，并以對PRRSV易感的非洲綠猴胚胎腎上皮細(xì)胞Marc145為模型，篩選出了穩(wěn)定敲減細(xì)胞株。所構(gòu)建的shRNA文庫中共有45個(gè)單克隆，涉及15種cathepsin基因；篩選出的細(xì)胞株經(jīng)Q-PCR鑒定，cathepsin基因mRNA的表達(dá)量均顯著下降，可以用于探究組織蛋白酶在PRRSV吸附、入侵、脫殼、生物合成、組裝以及釋放中的作用。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] ZHOU Z, WU J J, ZHANG S, et al. Analysis of genetic variation of two nadc30-like strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in China[J].OpenVirolJ, 2017, 11:90-97.

[2] WHITWORTH K M,ROWLAND R R R,EWEN C L,et al. Gene-edited pigs are protected from porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].NatBiotechnol, 2016, 34(1):20-22.

[3] 郭振華,陳鑫鑫,李 睿,等.中國豬繁殖與呼吸綜合征病毒流行歷史及現(xiàn)狀[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2018, 49(1):1-9.

GUO Z H,CHEN X X,LI R,et al.The prevalent history and current status of porcine reproductive and respiratory syndrome in China[J].ActaVeterinariaetZootechnicaSinica, 2018, 49(1):1-9.(in Chinese)

[4] LI X D,BAO H Y,WANG Y,et al.Widespread of NADC30-like PRRSV in China:another Pandora’s box for Chinese pig industry as the outbreak of highly pathogenic PRRSV in 2006?[J].InfectGenetEvol, 2017, 49:12-13.

[5] CHEN N H, LIU Q R,QIAO M M,et al.Whole genome characterization of a novel porcine reproductive and respiratory syndrome virus 1 isolate:genetic evidence for recombination between Amervac vaccine and circulating strains in mainland China[J].InfectGenetEvol, 2017, 54:308-313.

[6] 曾廣智,譚寧華,賈銳銳,等.組織蛋白酶及其抑制劑研究進(jìn)展[J].云南植物研究,2005,27(4):337-354.

ZENG G Z,TAN N H,JIA R R,et al.Cathepsins:structures,functions and inhibitors[J].ActaBotanicaYunnanica, 2005, 27(4):337-354.(in Chinese)

[7] XU X,GREENLAND J R,GOTTS J E,et al.Cathepsin L helps to defend mice from infection with influenza A[J].PLoSOne,2016,11(10):e0164501.

[8] 陳 駒,彭禮飛.組織蛋白酶G在炎癥性疾病發(fā)生發(fā)展中作用的研究進(jìn)展[J].山東醫(yī)藥, 2017, 57(21):98-101.

CHEN J,PENG L F.Research progress on the role of cathepsin g in the development of inflammatory diseases[J].ShandongMedicalJournal, 2017, 57(21):98-101.(in Chinese)

[9] TSUTSUMI S,OGINO I,MIYAJIMA M,et al.Role of cathepsin K in the development of chronic subdural hematoma[J].JClinNeurosci, 2017, 45:343-347.

[10] 高秋月,肖露平,李海燕,等.埃博拉病毒及其免疫研究進(jìn)展[J].生物學(xué)教學(xué),2009,34(7):7-9.

GAO Q Y,XIAO L P,LI H Y,et al.Advances in researches on ebola virus and its immunology[J].BiologyTeaching,2009,34(7):7-9.(in Chinese)

[11] ZHOU N,PAN T,ZHANG J S,et al.Glycopeptide antibiotics potently inhibit cathepsin L in the late endosome/lysosome and block the entry of ebola virus,middle east respiratory syndrome coronavirus (MERS-CoV),and severe acute respiratory syndrome coronavirus (SARS-CoV)[J].JBiolChem,2016,291(17):9218-9232.

[12] 張 智,郭 鵬,孫 興,等.HBx基因上調(diào)組織蛋白酶S對HepG2細(xì)胞的影響[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2017,97(30):2357-2361.

ZHANG Z, GUO P, SUN X, et al.Effects of up-regulation of cathepsin S by HBx gene on HepG2 cell[J].NationalMedicalJournalofChina, 2017, 97(30):2357-2361.(in Chinese)

[13] GUO C H,ZHU Z B,GUO Y,et al.Heparanase upregulation contributes to porcine reproductive and respiratory syndrome virus release[J].JVirol,2017,91(15):e00625-17.

[14] 尚仁福,吳立剛.RNA干擾的機(jī)制及其應(yīng)用[J].生命科學(xué),2016,28(5):576-583.

SHANG R F,WU L G.Mechanism and application of RNA interference[J].ChineseBulletinofLifeSciences, 2016, 28(5):576-583.(in Chinese)

[15] MOHR S E, SMITH J A,SHAMU C E,et al.RNAi screening comes of age:improved techniques and complementary approaches[J].NatRevMolCellBiol,2014,15(9):591-600.

[16] 董 骎,高 洪,嚴(yán)玉霖,等.shRNA介導(dǎo)的基因沉默表達(dá)載體構(gòu)建方法及應(yīng)用[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊,2015(5):18-19,22.

DONG Q,GAO H,YAN Y L,et al.Construction and application of gene silencing expression vector mediated by shRNA[J].ShanghaiJournalofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine, 2015(5): 18-19,22.(in Chinese)

[17] 梁 艷.慢病毒載體在RNA干擾中的應(yīng)用進(jìn)展[J].國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 31(11):1282-1284.

LIANG Y. Advances in the application of lentiviral vector in RNA interference[J].InternationalJournalofLaboratoryMedicine, 2010, 31(11):1282-1284. (in Chinese)

[18] DYKXHOORN D M,NOVINA C D,SHARP P A.Killing the messenger:short RNAs that silence gene expression[J].NatRevMolCellBiol, 2003, 4(6):457-467.

[19] WU J Y,HUANG W Z,HE Z Y.Dendrimers as carriers for siRNA delivery and gene silencing:a review[J].SciWorldJ, 2013, 2013:630654.

[20] JEONG J,CHOI K,KANG I,et al.Evaluation of a 20 year old porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) modified live vaccine (Ingelvac?PRRS MLV) against two recent type 2 PRRS virus isolates in South Korea[J].VetMicrobiol, 2016, 192:102-109.

[21] FABLET C,MAROIS-CRéHAN C,GRASLAND B,et al.Factors associated with herd-level PRRSV infection and age-time to seroconversion in farrow-to-finish herds[J].VetMicrobiol, 2016, 192:10-20.

[22] ROTOLO M L, GIMéNEZ-LIROLA L, JI J, et al. Detection of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)-specific IgM-IgA in oral fluid samples reveals PRRSV infection in the presence of maternal antibody[J].VetMicrobiol, 2018, 214:13-20.

[23] ROBINSON S R,RAHE M C,GRAY D K,et al.Porcine reproductive and respiratory syndrome virus neutralizing antibodies provideinvivocross-protection to PRRSV1 and PRRSV2 viral challenge[J].VirusRes, 2018, 248:13-23.

[24] 田德斌,袁世山.豬繁殖與呼吸綜合征病毒侵入細(xì)胞過程研究進(jìn)展[J].中國動(dòng)物傳染病學(xué)報(bào), 2011, 19(3):68-74.

TIAN D B,YUAN S S.Research progress on how porcine reproductive and respiratory syndrome virus enter into cell[J].ChineseJournalofAnimalInfectiousDiseases, 2011, 19(3):68-74.(in Chinese)

[25] YANG H Q,ZHANG J,ZHANG X W,et al.CD163 knockout pigs are fully resistant to highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus[J].AntiviralRes,2018,151:63-70.

[26] 宋曉暉,王淑娟,張衍海,等.CD163受體在PRRSV入侵過程中的作用機(jī)制[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2013,34(4):111-115.

SONG X H,WANG S J,ZHANG Y H,et al.Mechnism of receptor CD163 in PRRSV invasion process[J].ProgressinVeterinaryMedicine, 2013, 34(4):111-115. (in Chinese)

[27] POHL M O,VON RECUM-KNEPPER J,RODRIGUEZ-FRANDSEN A,et al.Identification of Polo-like kinases as potential novel drug targets for influenza a virus[J].SciRep,2017,7:8629.

[28] REISER J,ADAIR B,REINHECKEL T.Specialized roles for cysteine cathepsins in health and disease[J].JClinInvest, 2010, 120(10):3421-3431.

[29] HSING L C,RUDENSKY A Y.The lysosomal cysteine proteases in MHC class II antigen presentation[J].ImmunolRev, 2005, 207(1):229-241.

[30] TURK V,STOKA W,VASILJEVA O,et al.Cysteine cathepsins:from structure,function and regulation to new frontiers[J].BiochimBiophysActa, 2012, 1824(1):68-88.

[31] 彭舟揚(yáng)帆,李亞培,曾萍玉,等.組織蛋白酶在高血壓中作用的研究進(jìn)展[J].中南大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版,2017,42(12):1447-1451.

PENG Z Y F,LI Y P,ZENG P Y,et al.Progress in the study on roles of cathepsin in hypertension[J].JournalofCentralSouthUniversity:MedicalScience, 2017, 42(12):1447-1451. (in Chinese)

[32] 鄭 賢,鄧勇志.組織蛋白酶在心臟重塑中作用的研究進(jìn)展[J].中華實(shí)驗(yàn)外科雜志,2016,33(3):858-861.

ZHENG X, DENG Y Z. Role of cathepsins in cardiac remodeling[J].ChineseJournalofExperimentalSurgery, 2016, 33(3):858-861. (in Chinese)