干擾和穩(wěn)定表達(dá)GP5對豬繁殖與呼吸綜合征病毒感染早期復(fù)制的影響

宋林林，賈存瑜，韓熙夢，周恩民*，穆 楊*(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，楊凌 712100；2.農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)陜西科學(xué)觀測實(shí)驗(yàn)站，楊凌 712100)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRS)是世界上對養(yǎng)豬業(yè)生產(chǎn)影響最嚴(yán)重的疾病之一，該病于1987年在美國首次被發(fā)現(xiàn)。30年多來，科研人員就PRRS的病原、起源、演化、機(jī)體免疫應(yīng)答等方面進(jìn)行了大量研究，并取得了一系列的研究成果[1-4]，免疫接種、提高飼養(yǎng)管理水平、抗病育種、捕殺感染豬等措施在防控PRRS方面都發(fā)揮了積極的作用[4-6]，但目前仍然沒有一種可完全有效根除該病的方法。ORF5 編碼的GP5蛋白是PRRSV最主要的結(jié)構(gòu)蛋白與免疫保護(hù)性抗原，針對GP5 的研究可以為PRRSV致病機(jī)制的剖析積累資料。

RNA干擾(RNA interference, RNAi)指在進(jìn)化過程中由高度保守的雙鏈RNA誘發(fā)的同源mRNA高效特異降解現(xiàn)象。小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)是一段長20～25個核苷酸的雙鏈RNA，主要參與RNAi現(xiàn)象，可專一性調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。利用RNAi 降低病毒對細(xì)胞和易感動物的感染已經(jīng)用于多種病毒的研究，如口蹄疫病毒[7]、偽狂犬病病毒[8]、PRRSV[9-10]等。構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)某一病毒蛋白的細(xì)胞系是研究病毒蛋白功能的一種常用方法[11]。本研究構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP5的Marc-145細(xì)胞系，同時設(shè)計合成針對PRRSV ORF5 的特異性siRNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后用病毒感染細(xì)胞，研究穩(wěn)定表達(dá)GP5和敲低GP5表達(dá)對PRRSV復(fù)制的影響及機(jī)制，以期為GP5功能及PRRSV致病機(jī)制的研究積累資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞、病毒、質(zhì)粒和載體 Marc-145細(xì)胞系購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心；PRRSV SD16株(GenBank Access No. JX087437.1)、pMD18-T-GP5質(zhì)粒由西北農(nóng)林科技大學(xué)重大動物疫病病原感染和致病機(jī)制團(tuán)隊(duì)保存；E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞、pMD18-T載體為TaKaRa公司產(chǎn)品；piggyBacTMTransposon vector system 購自SBI公司。

1.1.2 siRNA Scrambled siRNA、siRNA GP5-404、siRNA GP5-471、siRNA GP5-525(表1)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計合成。

1.1.3 主要試劑 RNAiso plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit、PrimeSTAR HS DNA Polymerase、ExTaqVersion 2.0 plus dye購自寶生物工程(大連)有限公司，EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、EasyPure Quick Gel Extraction Kit購自Transgen Biotech.，T4 DNA連接酶、BamH Ⅰ、EcoR Ⅰ為New England Biolabs產(chǎn)品，F(xiàn)astStart Universal SYBR Green Master為Roche公司產(chǎn)品，PageRuler預(yù)染蛋白marker(10-170 ku)、BCA protein assay kit、LipofectamineTM3000為Thermo Scientific公司產(chǎn)品；嘌呤霉素(puromycin)為Merck公司產(chǎn)品；抗PRRSV N蛋白單抗6D10、抗PRRSV 豬血清、抗GP5鼠血清由西北農(nóng)林科技大學(xué)重大動物疫病病原感染和致病機(jī)制團(tuán)隊(duì)制備、保存；抗 α-tubulin (Catalog# T6074)抗體購自Sigma-Aldrich；HRP-標(biāo)記的羊抗鼠IgG(Catalog# 115-035-003)、Texas Red-標(biāo)記的羊抗豬IgG(Catalog# 114-075-003)為Jackson ImmunoResearch公司產(chǎn)品；Cell counting kit-8(cck-8)和NP40裂解液購自碧云天生物技術(shù)公司；猴源干擾素α(IFN-α)、IFN-β、IFN-γ ELISA檢測試劑盒購自Cusabio公司。

表1siRNA名稱與對應(yīng)的序列

Table1NamesandsequencesofsiRNA

siRNA名稱NameofsiRNA靶標(biāo)Target鏈Strand序列(5′→3′)SequencesscrambledsiRNANoSenseUUCUUCGAACGUGUCACGUTTAntisenseACGUGACACGUUCGGAGAATTsiRNAGP5?404PRRSVSenseGCUACUCUUGUACCAGAUATTSD16ORF5AntisenseUAUCUGGUACAAGAGUAGCTTsiRNAGP5?471PRRSVSenseGCCCGUCAUUGUGGAGAAATTSD16ORF5AntisenseUUUCUCCACAAUGACGGGCTTsiRNAGP5?525PRRSVSenseCCUCAAGAGAGUUGUGCUUTTSD16ORF5AntisenseAAGCACAACUCUCUUGAGGTT

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP5細(xì)胞的構(gòu)建與鑒定 以 pMD18-T-GP5為模板，用引物GP5-F和GP5-R(表2)進(jìn)行擴(kuò)增，回收目的條帶后利用EcoR Ⅰ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)將目的片段定向插入PiggyBacTMVector System的 PB Transposon vector，鑒定正確的重組載體命名為pPB-GP5。將狀態(tài)良好的Marc-145細(xì)胞按2×105個細(xì)胞·孔-1接種于6孔細(xì)胞板，培養(yǎng)至80%左右融合度時按文獻(xiàn)方法用donor質(zhì)粒(pPB-GP5或空載體質(zhì)粒PB Transposon vector)和helper質(zhì)粒(PiggyBac Transposase vector)進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、篩選、亞克隆、保存及鑒定[12-13]，將鑒定正確的表達(dá)GP5和標(biāo)簽蛋白GFP的細(xì)胞命名為Marc-145-GP5，將僅表達(dá)標(biāo)簽蛋白GFP的細(xì)胞命名為Marc-145-GFP。

1.2.2 細(xì)胞增殖測定 調(diào)整細(xì)胞濃度，以每孔2×103個細(xì)胞接種96孔板培養(yǎng)，按cck-8試劑盒說明分別于培養(yǎng)的1、2、3、4、5、6和 7 d 測定細(xì)胞增殖情況，每個時間點(diǎn)設(shè)置6個重復(fù)孔，同時設(shè)Marc-145和Marc-145-GFP對照，并按照公式

PDT=[log 2/(logNt-logN0)]×t,

(Nt=培養(yǎng)th時的細(xì)胞數(shù)，N0=初期接種的細(xì)胞數(shù))計算細(xì)胞群體倍增時間(population doubling time, PDT)[13-15]。

1.2.3 PRRSV GP5表達(dá)對病毒復(fù)制的影響 將Marc-145、Marc-145-GP5和Marc-145-GFP按每孔1×105接種于6孔細(xì)胞板，培養(yǎng)至80%融合度時按0.1 MOI接種PRRSV SD16株，接毒后12、24、36、48 h分別收集細(xì)胞和培養(yǎng)液上清，每個時間點(diǎn)設(shè)3個重復(fù)。收集的細(xì)胞一部分提取總RNA，采用RT-qPCR檢測N基因mRNA表達(dá)水平；另一部分按NP40裂解液說明裂解細(xì)胞準(zhǔn)備樣品進(jìn)行12%分離膠 SDS-PAGE，以6D10 (3 ng·μL-1) 為一抗，HRP-標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(80 ng·μL-1)為二抗進(jìn)行Western blot檢測，確定病毒復(fù)制情況。收集的上清一部分用不含血清的DMEM作10倍倍比稀釋，按Reed-Muench法用Marc-145細(xì)胞測定病毒滴度(TCID50·mL-1)，另一部分用于干擾素表達(dá)水平檢測。

1.2.4 IFN表達(dá)水平檢測 分別取此前收集的培養(yǎng)24和48 h的上清，用猴源IFN-α、IFN-β和IFN-γ ELISA 試劑盒檢測各樣品中各IFN蛋白的表達(dá)情況。

1.2.5 siRNA轉(zhuǎn)染及其對病毒復(fù)制影響的檢測 將狀態(tài)良好的Marc-145細(xì)胞按5×104·孔-1鋪于24孔細(xì)胞板，培養(yǎng)至70%左右融合度時參照試劑說明用LipofectamineTM3000將特異性siRNA和Scrambled siRNA分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，同時設(shè)立空白對照。分別在轉(zhuǎn)染后6和12 h按 0.1 MOI 接種PRRSV SD16，感染后24 h 收集細(xì)胞，一部分提取基因組RNA，采用RT-qPCR 檢測GP5 mRNA的表達(dá)水平[16]，另一部分按NP40裂解液說明裂解細(xì)胞準(zhǔn)備樣品進(jìn)行12%分離膠SDS-PAGE，以抗N蛋白單抗6D10(3 ng·μL-1)為一抗，HRP-標(biāo)記的羊抗鼠 IgG(80 ng·μL-1)為二抗進(jìn)行Western blot檢測[12]，確定病毒的復(fù)制情況。

表2引物及其序列

Table2Primersandtheirsequences

引物名稱Primer’sname引物序列(5′→3′)Primer’ssequencesGP5?FCGGAATTCATGTTGGGGAAGTGCTTGACCGP5?RCGGGATCCCTAGAGACGACCCCATTGTTCORF7?FAGATCATCGCCCAACAAAACORF7?RGACACAATTGCCGCTCACTAORF5?FTGGTGTATCGTGCCGTCTTATCORF5?RAGTCTCCACTGCCCAGTCAAAβ?actin?FCGGGAAATCGTGCGTGACβ?actin?RATGCCCAGGAAGGAAGGTTG

下劃線標(biāo)記分別是EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)

Underlined letters are restriction enzyme digestion sites ofEcoRⅠ andBamHⅠ, respectively

2 結(jié) 果

2.1 穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP5 細(xì)胞的篩選與鑒定

轉(zhuǎn)染后經(jīng)嘌呤霉素篩選和3次亞克隆獲得了全部表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞克隆，為了確定外源基因在細(xì)胞中的表達(dá)，提取Marc-145-GP5、Marc-145-GFP 和 Marc-145細(xì)胞總RNA 利用引物GP5-F和GP5-R采用RT-PCR進(jìn)行檢測，從 Marc-145-GP5細(xì)胞樣品中可以擴(kuò)增到GP5基因，而從Marc-145-GFP和 Marc-145樣品中沒有擴(kuò)增條帶(圖1A)，Western blot檢測結(jié)果也顯示，在 Marc-145-GP5細(xì)胞中可檢測到 GP5蛋白的表達(dá)， 但Marc-145-GFP 和 Marc-145細(xì)胞中沒有，而內(nèi)參蛋白α-tubulin在3種細(xì)胞中的表達(dá)基本一致(圖1B)；IFA結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察可以看到，從Marc-145-GFP細(xì)胞樣品可以觀察到綠色的GFP熒光，而Marc-145-GP5細(xì)胞中既有綠色的GFP熒光也有紅色的GP5熒光，而且GP5主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)中， Marc-145細(xì)胞中兩種熒光都沒有(圖1C)；說明ORF5已插入到 Marc-145 細(xì)胞基因組中。

2.2 GP5表達(dá)不影響Marc-145細(xì)胞增殖

為確定表達(dá)GP5是否會對Marc-145細(xì)胞增殖產(chǎn)生影響，利用顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)顯示，Marc-145-GP5 和Marc-145-GFP 與Marc-145細(xì)胞一樣培養(yǎng)約2 d可形成單層，且形態(tài)與Marc-145細(xì)胞基本一致(圖2A)；利用cck-8試劑盒檢測細(xì)胞增殖活性，結(jié)果顯示從細(xì)胞接種到細(xì)胞進(jìn)入生長的平臺期，其增殖曲線與Marc-145的基本一致(圖2B)，計算培養(yǎng)48、72、96和120 h的PDT，結(jié)果顯示3種細(xì)胞的沒有明顯差異(圖2C)。Marc-145-GP5 和 Marc-145-GFP 培養(yǎng)50代以上仍然增殖活躍，說明GP5表達(dá)不影響Marc-145的增殖。

2.3 GP5穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)PRRSV在Macr-145細(xì)胞中的復(fù)制

為確定GP5的穩(wěn)定表達(dá)對PRRSV復(fù)制的影響，將Marc-145-GP5、Marc-145-GFP和Marc-145 接種24孔板，培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)80% 左右融合度時接種0.1 MOI PRRSV SD16，每天觀察出現(xiàn)的細(xì)胞病變(cytopathic effect，CPE)，發(fā)現(xiàn)接毒后36 h Marc-145-GP5細(xì)胞上出現(xiàn)了典型的CPE，且比Marc-145細(xì)胞和Marc-145-GFP 細(xì)胞上的明顯(圖3)。采用RT-qPCR檢測接毒后不同時間細(xì)胞中的PRRSVN基因拷貝數(shù)發(fā)現(xiàn)，接毒后12、24和36 h Marc-145-GP5中N基因拷貝數(shù)顯著或極顯著高于Marc-145細(xì)胞和Marc-145-GFP細(xì)胞中的，到48 h時，N基因拷貝數(shù)顯著下降(圖4A)，N基因拷貝數(shù)的峰值出現(xiàn)在病毒感染后36 h，但上清液中病毒滴度到感染后48 h一直處于比較高的水平(圖4B)，感染后48 h N蛋白的免疫印跡檢測進(jìn)一步說明GP5的穩(wěn)定表達(dá)在PRRSV感染早期可以促進(jìn)病毒的復(fù)制(圖4C)。

2.4 IFN表達(dá)檢測

為了探究GP5穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)PRRSV SD16復(fù)制的可能原因，收集培養(yǎng)24和48 h或病毒感染24 和48 h的培養(yǎng)上清，用ELISA試劑盒檢測樣品中IFN-α、IFN-β和 IFN-γ的蛋白含量。結(jié)果顯示，與Marc-145細(xì)胞和Marc-145-GFP細(xì)胞相比，Marc-145-GP5 細(xì)胞表達(dá)的IFN-α、IFN-β和IFN-γ的量均明顯降低(圖5)，0.1 MOI PRRSV 感染后24 h，Marc-145-GP5細(xì)胞上清中IFN-β的量為273.92±43.48 pg·mL-1，而Marc-145-GFP細(xì)胞和Marc-145細(xì)胞的分別為(873.37±67.14)pg·mL-1和(1 119.07±56.90)pg·mL-1(圖5B)。因此IFN表達(dá)下調(diào)可能是GP5穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)PRRSV復(fù)制的原因之一，是否還有其他因素參與，有待進(jìn)一步研究。

A. RT-PCR 鑒定；B. Western blot 鑒定；C. 激光共聚焦顯微鏡分析GP5的表達(dá)與定位A. Identification with RT-PCR；B. Western blot analysis of GP5 expression in Marc-145-GP5, Marc-145-GFP, and parental Marc-145 cells after culture 48 h using anti-GP5 or α-tubulin primary antibodies (control)；C. Cellular localization of GP5 in Marc-145-GP5 cells following immunohistochemical detection

圖1 穩(wěn)定表達(dá)GP5細(xì)胞的鑒定Fig.1 Validation of GP5 in Marc-145 cells

A. 顯微鏡觀察(200×)；B. 細(xì)胞增殖曲線，n=6；C. 根據(jù)公式：PDT=[log 2/(log Nt -logN0)]×t (Nt=培養(yǎng)t h時的細(xì)胞數(shù)，N0=接種的細(xì)胞數(shù))計算的對數(shù)生長期3種細(xì)胞的PDTA. Cell morphology observed under 200×magnification；B. Cell growth curves were plotted using average cell numbers across 7 days of culture time，n=6；C. The PDT of Marc-145-GP5, Marc-145-GFP, and Marc-145 cells were determined at 48, 72, 96, 120 h after seeding according the formula: PDT =[log 2/(log Nt -logN0)]×t(Nt=number of cells after t hours of culturing, N0=number of cells seeded) 圖2 GP5表達(dá)不影響Marc-145細(xì)胞的增殖Fig.2 Expression of PRRSV GP5 does not influence Marc-145 cell growth characteristics

圖3 PRRSV接種后36 h 細(xì)胞上出現(xiàn)的CPE(200×)Fig.3 CPE were observed at 36 h after PRRSV SD16 infection (Magnification 200×)

A. RT-qPCR檢測接毒后不同時間的N基因拷貝數(shù)；B. 病毒滴度檢測結(jié)果；C. Western blot檢測接毒后48 h N蛋白的表達(dá)(左)以及灰度分析結(jié)果(右)，*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001A. N gene copies of PRRSV SD16 were quantified by RT-qPCR；B. Viral titers in supernatant were titrated on Marc-145 cells with 10-fold serial dilutions；C. N protein expression at 48 h post infection was detected by Western blot (left) and N protein expression levels were quantitatively analyzed and were compared with α-tubulin expression by use of Image J (right). *. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001

圖4 GP5 穩(wěn)定表達(dá)促進(jìn)PRRSV感染早期病毒的復(fù)制Fig.4 PRRSV replication was promoted in Marc-145-GP5 cells

2.5 針對 PRRSV ORF5編碼區(qū)的特異性siRNA能抑制病毒在Marc-145細(xì)胞上的增殖

為了進(jìn)一步確定GP5對病毒復(fù)制的影響，針對ORF5的編碼區(qū)設(shè)計合成siRNA，轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后再接種病毒，檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA后6和12 h接種PRRSV， 3對特異性 siRNAs (siRNA GP5-404、siRNA GP5-471 和siRNA GP5-525)均能顯著抑制GP5 mRNA的表達(dá)，而且轉(zhuǎn)染siRNA后12 h接種病毒的抑制效果更明顯(圖6A和圖6B)；其中100 nmol·L-1的 siRNA GP5-471的抑制效果最好，與scrambled siRNA 處理的對照組相比，GP5 mRNA 表達(dá)水平降低超過70% (1.026±0.050vs0.291±0.044,P=9.809×10-5)(圖6C)；對N蛋白的免疫印跡檢測和相對表達(dá)分析顯示干擾GP5的表達(dá)顯著抑制病毒的復(fù)制(圖6D和圖6E)。

3 討 論

本研究構(gòu)建并篩選到穩(wěn)定表達(dá)PRRSV GP5的Marc-145細(xì)胞系，RT-PCR、Western blot 和免疫組化結(jié)合激光共聚焦顯微鏡觀察均證實(shí)GP5在細(xì)胞中獲得穩(wěn)定表達(dá)(圖1)。雖然在采用Western blot檢測GP5表達(dá)時出現(xiàn)兩條印跡條帶，但這與報道的GP5存在不同糖基化形式一致[17]。形態(tài)觀察和采用cck-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)GP5穩(wěn)定表達(dá)不影響Marc-145-GP5細(xì)胞的增殖(圖2)。Wang等[18]指出，穩(wěn)定表達(dá)某一病毒蛋白可能會改變細(xì)胞中病毒的產(chǎn)量甚至改變病毒的嗜性。本研究在獲得穩(wěn)定表達(dá)GP5細(xì)胞系的基礎(chǔ)上，用PRRSV SD16 株感染 Marc-145-GP5 細(xì)胞，感染后不同時間觀察細(xì)胞上出現(xiàn)的CPE并檢測細(xì)胞中N基因拷貝數(shù)和上清液中的病毒滴度，發(fā)現(xiàn)在感染的早期(48 h內(nèi))Marc-145-GP5細(xì)胞組的CPE比對照細(xì)胞組的明顯(圖3)，其N基因拷貝數(shù)和病毒滴度在感染后36 h也持續(xù)顯著高于對照細(xì)胞組，雖然到病毒感染后48 h，Marc-145-GP5細(xì)胞組的N基因拷貝數(shù)比對照細(xì)胞組的低，但病毒滴度仍然高于對照組的(圖4)，到感染后60和72 h，Marc-145-GP5細(xì)胞組的N基因拷貝數(shù)和病毒滴度就與對照組沒有差異了(數(shù)據(jù)未顯示)。對感染后 48 h N蛋白表達(dá)水平的免疫印跡檢測進(jìn)一步說明穩(wěn)定表達(dá)GP5在PRRSV感染的早期可以促進(jìn)病毒的復(fù)制，這一結(jié)果與在Marc-145細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)Nsp2可以促進(jìn)病毒復(fù)制的結(jié)果一致[18]。但在筆者團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建的另一個穩(wěn)定表達(dá)GP5的細(xì)胞系Marc-145-GP5Flag中，GP5表達(dá)通過誘導(dǎo)IFN-β的生成抑制病毒的復(fù)制[19]。為了探究出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因，本研究采用ELISA試劑盒檢測正常培養(yǎng) 24和48 h 以及病毒感染 24和48 h上清中的IFN-α、IFN-β和 IFN-γ水平發(fā)現(xiàn)，與Marc-145-GFP 和 Marc-145 細(xì)胞組相比，無論病毒感染與否，Marc-145-GP5細(xì)胞組的IFN-α、IFN-β和IFN-γ表達(dá)水平在 24和 48 h 都是下調(diào)的(圖5)。那么，都是穩(wěn)定表達(dá) GP5的細(xì)胞系，為什么會出現(xiàn)相反的結(jié)果呢？仔細(xì)分析發(fā)現(xiàn)，研究團(tuán)隊(duì)前期構(gòu)建Marc-145-GP5Flag細(xì)胞系采用的是慢病毒載體系統(tǒng)，在GP5的羧基端融合了Flag標(biāo)簽，而本研究構(gòu)建細(xì)胞系采用的是piggyBacTMTransposon載體系統(tǒng)，此載體系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是篩選細(xì)胞系時借助的GFP標(biāo)簽在目的蛋白被表達(dá)后與目的蛋白是分離的，因此標(biāo)簽蛋白不會對目的蛋白功能的發(fā)揮產(chǎn)生影響。而且筆者推測，在Marc-145-GP5細(xì)胞中，穩(wěn)定表達(dá)的GP5可能參與了感染早期病毒粒子的組裝，因此導(dǎo)致病毒粒子的生成加快，至于這種推測是否成立以及為什么不同的載體系統(tǒng)構(gòu)建的細(xì)胞系會獲得不同的結(jié)果，具體原因還有待進(jìn)一步研究。

研究表明，PRRSV感染在體內(nèi)外均可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[20-21]，發(fā)揮功能的主要是GP5氨基端的119個氨基酸殘基形成的功能域[22]。然而，Lee等[23]指出前者報道的GP5誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡可能是非典型的，是由融合在GP5氨基端的His標(biāo)簽或抗原標(biāo)簽引起的，這些額外的標(biāo)簽擾亂了GP5氨基端信號肽的功能，導(dǎo)致被修飾的GP5出現(xiàn)胞內(nèi)功能紊亂(intracellular trafficking of the modified protein)，而且研究者使用的牛痘病毒可能也是造成這種非典型細(xì)胞凋亡的原因之一。本研究使用 piggyBacTMTransposon 載體系統(tǒng)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá) GP5的細(xì)胞系，piggyBacTMTransposon 載體系統(tǒng)是一種非病毒DNA傳遞系統(tǒng)，包含PB Transposon vector 和 PiggyBac Transposase vector，Transposase指導(dǎo) PB Transposon結(jié)合到基因組的TTAA 位點(diǎn)，且在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中GFP標(biāo)簽蛋白和目的蛋白是分離的[24-26]。這種情況下，標(biāo)簽蛋白的可能影響就被去除了，而且筆者已經(jīng)證實(shí) PRRSV SD16 的 GP5不能引起細(xì)胞凋亡[13]，引起細(xì)胞凋亡的是PRRSV的Nsp4和Nsp10[27]。

*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001

圖5 ELISA 方法檢測IFN-α、IFN-β、IFN-γ蛋白表達(dá)水平Fig.5 Interferon protein expression levels were detected with ELISA method

A、B. RT-qPCR 檢測siRNA轉(zhuǎn)染后6 h(A)和12 h(B)接種PRRSV對GP5 mRNA表達(dá)的影響；β-actin為內(nèi)參基因，PRRSV對照組的GP5 mRNA表達(dá)被設(shè)定為1；C. RT-qPCR檢測不同濃度siRNA GP5-471的抑制效果；D、E. Western blot檢測siRNA對N蛋白表達(dá)的影響(左)及其灰度分析(右)；n=3；*. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001A, B. RT-qPCR results show the inhibition on GP5 mRNA expression when inoculating PRRSV at 6 h (A) and 12 h (B) after siRNA treatment. β-actin served as an internal control. Gene expression in the PRRSV control was set to 1；C. RT-qPCR results show the inhibition efficiency of 50, 100, and 200 nmol·L-1 siRNA GP5-471；D, E. Western blot data shows that siRNA targeting GP5 coding region of PRRSV SD16 inhibits N protein expression. α-tubulin was used as an internal control (Left). N protein expression levels were quantitatively analyzed and were compared with α-tubulin expression by use of Image J (Right). n=3. *. P<0.05；**. P<0.01；***. P<0.001

圖6 針對GP5編碼區(qū)的siRNA抑制 PRRSV在MARC-145細(xì)胞中的復(fù)制Fig.6 siRNAs targeting GP5 coding regions inhibit PRRSV SD16 replication in Marc-145 cells

研究指出，將表達(dá)IFN-α的重組腺病毒Ad5-IFN-α與 Ingelvac PRRS?ATP 同時給豬注射，可以摧毀(abolished)疫苗毒在豬體內(nèi)的復(fù)制[28]，在CRL-2843-CD163細(xì)胞中過表達(dá)豬 2′,5′-寡腺苷酸合成酶(OASs)可以通過促進(jìn) IFN-α和IFN-β 等細(xì)胞因子的表達(dá)抑制PRRSV復(fù)制[29]。本研究中，與Marc-145 細(xì)胞組相比，Marc-145-GP5細(xì)胞組的IFN-α、IFN-β和IFN-γ 蛋白表達(dá)水平均下調(diào)，提示在穩(wěn)定表達(dá) GP5的Marc-145-GP5 細(xì)胞中，干擾素表達(dá)下調(diào)可能是PRRSV復(fù)制被抑制的原因之一，其具體的詳細(xì)機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

GP5是PRRSV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，在感染性病毒粒子的組裝、病毒侵染宿主細(xì)胞等方面發(fā)揮著重要作用。在確定了過表達(dá)GP5 可以在病毒感染早期促進(jìn)病毒復(fù)制后，本研究進(jìn)一步設(shè)計合成針對ORF5編碼區(qū)的特異性siRNA，采用RNA干擾技術(shù)在siRNA轉(zhuǎn)染Marc-145細(xì)胞后6和12 h 分別接種PRRSV SD16株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)特異性siRNA能從轉(zhuǎn)錄水平顯著干擾GP5 mRNA的表達(dá)(圖6A、B、C)和N蛋白表達(dá)(圖6D、E)，說明抑制GP5表達(dá)在病毒感染早期可以顯著抑制病毒復(fù)制，進(jìn)一步表明GP5 能調(diào)控病毒復(fù)制。

本研究無論是過表達(dá)GP5還是干擾ORF5的轉(zhuǎn)錄，均是在體外水平進(jìn)行，要確定PRRSV感染豬體后，GP5在豬體內(nèi)是否也可以發(fā)揮相同的效應(yīng)，還需要采用豬體試驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

4 結(jié) 論

在Marc-145細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)GP5可以通過下調(diào)IFN的表達(dá)在PRRSV感染早期促進(jìn)病毒復(fù)制，利用特異性siRNA干擾GP5表達(dá)可以抑制PRRSV復(fù)制，GP5對PRRSV復(fù)制具有調(diào)控作用。

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