針對不同形式豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5重組蛋白的抗體中和活性比較

馮 延，郭 嘉，許瑞勤，馬思續(xù)，魏鳳靈，張留君，楊國宇，夏平安，張改平(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)基因組全長約15.3 kb，為不分節(jié)段的單股正鏈RNA。目前在編碼區(qū)中至少已經(jīng)有10個開放閱讀框(open reading frame, ORF)被證實(shí)，分別為ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6、ORF7和ORF5a，并且在部分開放閱讀框之間存在一定的相互重疊[1]。ORF1占全基因全長的80%，可分為ORF1a和ORF1b，主要負(fù)責(zé)編碼與病毒復(fù)制相關(guān)的復(fù)制酶等非結(jié)構(gòu)蛋白[2]。ORF2～7位于病毒基因組3′端，負(fù)責(zé)編碼病毒的結(jié)構(gòu)蛋白，其中ORF5、ORF6、ORF7編碼的囊膜糖蛋白(GP5)、基質(zhì)蛋白(M)及核衣殼蛋白(N)為病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，是病毒構(gòu)架的主要組成部分；ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4編碼的囊膜有關(guān)的糖蛋白GP2a、GP2b、GP3、GP4為PRRSV的次要結(jié)構(gòu)蛋白，而對于ORF5編碼的GP5a蛋白的功能作用目前尚不完全清楚[1,3-4]。

目前PRRSV的GP2、GP3、GP4、GP5和M蛋白均被鑒定含有中和表位，其中GP5被認(rèn)為是誘導(dǎo)中和抗體及交叉免疫保護(hù)的主要靶蛋白，一直以來都是PRRSV基因工程疫苗研究的熱點(diǎn)基因，研究發(fā)現(xiàn)GP5至少含有5個B細(xì)胞表位和2個T細(xì)胞表位，可誘導(dǎo)中和抗體的產(chǎn)生，并且抗體的中和作用與血清中針對GP5的抗體滴度相關(guān)[5-6]。GP5蛋白的胞外區(qū)同時存在一個誘騙表位A(decay epitope, aa 27—30)和一個中和表位B(aa 37—45)，A表位作為優(yōu)勢表位可以阻礙B表位的暴露并阻止B表位抗體的產(chǎn)生[7-8]，其機(jī)制尚有待研究。然而諸多研究表明，以單獨(dú)的GP5蛋白構(gòu)建的基因工程亞單位疫苗，以及GP5/M構(gòu)建的亞單位疫苗，雖然能夠提供一定的免疫保護(hù)，但這種免疫保護(hù)只發(fā)生在同源毒株之間[6,9-10]，并且保護(hù)能力有限，與弱毒疫苗株相比其誘導(dǎo)的免疫保護(hù)依然較弱。

豬是PRRSV的唯一天然宿主。在體外培養(yǎng)的眾多細(xì)胞系中，PRRSV只在非洲綠猴腎細(xì)胞系MA104及其衍生Marc-145中生長。病毒在侵入宿主細(xì)胞時是通過細(xì)胞膜表面的受體分子與病毒表面的蛋白相互作用介導(dǎo)的。然而在有些情況下，抗體不但不能阻止病毒的感染，反而協(xié)助病毒侵入靶細(xì)胞，增強(qiáng)病毒的感染力和復(fù)制能力，這一現(xiàn)象就被稱作抗體依賴性增強(qiáng)作用(antibody-dependent enhancement，ADE)。PRRSV就存在ADE現(xiàn)象[11]，機(jī)體內(nèi)抗PRRSV的抗體可以通過Fc受體結(jié)合到巨噬細(xì)胞表面，從而形成免疫復(fù)合物，使Fc受體陽性細(xì)胞病毒的感染作用增強(qiáng)，因此非中和抗體反而對PRRSV的感染起到促進(jìn)作用[12]。PRRSV自然感染后機(jī)體針對GP5中和表位的抗體產(chǎn)生往往較遲且水平低下，不能及時有效地清除病毒，這些非中和抗體很可能會進(jìn)一步介導(dǎo)PRRSV的ADE作用，造成持續(xù)性感染，這一特性也給疫苗的研究和使用造成了巨大困難。

目前，PRRSV GP5在誘導(dǎo)機(jī)體免疫保護(hù)中的作用是基于Marc-145細(xì)胞中和試驗(yàn)的研究結(jié)果，并不能真實(shí)反映出其在臨床感染中的實(shí)際保護(hù)效果。因此，本研究旨在通過大腸桿菌和桿狀病毒/昆蟲表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)PRRSV去掉跨膜區(qū)和信號肽的截短GP5蛋白以及通過桿狀病毒/昆蟲表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)全長的GP5蛋白，進(jìn)而制備抗血清并檢測三種抗重組蛋白抗血清在PAM細(xì)胞上中和同源及異源PRRSV毒株的活性并分析其差異，從不同表達(dá)系統(tǒng)探討GP5蛋白抗體的中和活性，以期為PRRSV亞單位疫苗的研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、菌株、血清與質(zhì)粒載體

大腸桿菌DH5α、BL21(DE3)、Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)供體質(zhì)粒pFastBac-HTA、PRRSV VR2332株和HeN-3株(MegAlign分析兩毒株GP5基因同源性為89.1%)、豬抗PRRSV VR2332陽性血清(PRRSV VR2332全病毒免疫健康豬制備保存，ELISA效價為1∶12 800)、鼠抗PRRSV VR2332陽性抗血清(PRRSV VR2332全病毒免疫小鼠制備保存，ELISA效價為1∶12 800)、Marc-145細(xì)胞、Sf9細(xì)胞均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物實(shí)驗(yàn)室保存。感受態(tài)DH10Bac購自北京索萊寶科技有限公司(中國北京)。

1.2 主要試劑

2×TaqMix、2×Pfu Master Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司(中國北京)；限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶購自TaKaRa(中國大連)，BAC質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)mega(美國)；抗6×His單抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司(中國北京)；細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900ⅡSFM、轉(zhuǎn)染試劑CellfectinⅡ Reagent購自Invitrogen(美國)。

1.3 PRRSV GP5蛋白的截短原核表達(dá)

利用Marc-145細(xì)胞增殖PRRSV VR2332 毒株(GenBank登錄號：U87392.3)，以其ORF5基因序列為模板，應(yīng)用生物學(xué)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)一對擴(kuò)增包含PRRSV ORF5全基因片段的特異引物(表1)，通過RT-PCR方法擴(kuò)增出完整的ORF5基因，連接至pMD18-T載體構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-ORF5并進(jìn)行測序。根據(jù)ORF5基因的測序結(jié)果，使用分子生物學(xué)信息網(wǎng)站www.cbs.dtu.dk中的TMHMM工具預(yù)測GP5蛋白的跨膜區(qū)分別位于第7—29、66—88和107—125位氨基酸。同時以SignalP 4.1 Server預(yù)測其信號肽位于1—31 aa。通過重疊延伸PCR技術(shù)對GP5蛋白的信號肽和跨膜區(qū)進(jìn)行缺失處理，表達(dá)第32—65 aa的近N-端序列和第126—200 aa的近C-端序列(以下分別簡稱ORF5N和ORF5C)，設(shè)計(jì)兩對引物(表1)，在ORF5NR與ORF5CF之間包含25 bp的反向互補(bǔ)序列(以下劃線標(biāo)注)，并在兩個多肽之間引入了3個串聯(lián)的柔性氨基酸(Gly-Ser-Ser)序列以消除因多肽的串聯(lián)對其構(gòu)象造成的影響(以黑體標(biāo)注)，擴(kuò)增出缺失跨膜區(qū)(aa 66—125)和信號肽(aa 1—31)序列的ORF5基因片段并連接至原核表達(dá)載體pET-32a，構(gòu)建原核表達(dá)載體pET-ORF5NC。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中表達(dá)蛋白。

1.4 PRRSV GP5蛋白的全長和截短蛋白的真核表達(dá)

通過桿狀病毒/昆蟲表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)全長的重組GP5蛋白和缺失跨膜區(qū)、信號肽的重組GP5蛋白。根據(jù)1.3所獲得的ORF5基因片段，再次設(shè)計(jì)兩對引物(表1)，其中一對引物以質(zhì)粒pD18T-ORF5為模板，擴(kuò)增出完整的ORF5基因片段(ORF5-1)；另一對引物以質(zhì)粒pET-ORF5NC為模板，擴(kuò)增出缺失跨膜區(qū)、信號肽的ORF5基因片段(ORF5NC)，分別連接至pFastBac-HTA供體質(zhì)粒，將獲得的兩種重組供體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至含有桿狀病毒穿梭質(zhì)粒的DH10-Bac細(xì)胞，經(jīng)三重抗性和藍(lán)白斑篩選，獲得兩種重組穿梭質(zhì)粒Bacmid-ORF5和Bacmid-ORF5NC。在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Cellfectin Ⅱ Reagent的介導(dǎo)下，將重組Bacmid穿梭載體轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，獲得重組桿狀病毒AcMNPV-ORF5和AcMNPV-ORF5NC；將兩種重組桿狀病毒分別感染Sf9細(xì)胞以期獲得蛋白的表達(dá)。

1.5 三種重組蛋白抗血清以及PAM細(xì)胞的制備

將三種重組蛋白作為免疫原，分別免疫昆明小鼠制備三種抗血清。每只小鼠抗原用量為75 μg(200 μL)，初次免疫時將純化的重組蛋白與弗氏完全佐劑按1∶1.2的體積分別乳化均勻，首免2周后使用弗氏不完全佐劑與重組蛋白乳化均勻，采用背部皮下多點(diǎn)注射小鼠，以后每隔一周免疫一次，共免疫4次。以各重組蛋白和PRRSV全病毒作為ELISA包被抗原，檢測抗血清的效價。

從PRRSV核酸與抗體雙陰性的4周齡健康仔豬中無菌摘取肺，制備肺泡巨噬細(xì)胞懸液，500 g離心20 min，棄去上清，細(xì)胞以含有1 000 IU·L-1青、鏈霉素的PBS液輕柔重懸洗滌2次，最后將PAM細(xì)胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中。

表1引物序列及相關(guān)信息

Table1Primersequencesandrelevantinformation

擴(kuò)增片段名稱Amplifiedfragmentname引物序列(5′→3′)Primersequences酶切位點(diǎn)Restrictionenzyme擴(kuò)增片段長度/bpAmplifiedfragmentlengthORF5ORF5F：ATGTTGGAGAAATGCTTGACCG603ORF5R：CTAAGGACGACCCCATTGTTCORF5NORF5NF：CGCGGATCCAGCAACGACAGCAGCTCCCATBamHⅠ127ORF5NR：GCAAACCTGGAAGAGCCCTCCACTGCCCAATCORF5CORF5CF：CAGTGGAGGGCTCTTCCAGGTTTGCAAAGAAT248ORF5CR：CCGCTCGAGAGGACGACCCCATTGTTCCGXhoⅠORF5?1ORF5F：CGCGGATCCGATGTTGGAGAAATGCTTGACCGBamHⅠ618ORF5R：CCGCTCGAGACCTAAGGACGACCCCATTGTTCXhoⅠORF5NCORF5NF：CGCGGATCCGAGCAACGACAGCAGCTCCCATBamHⅠ353ORF5CR：CCGCTCGAGACAGGACGACCCCATTGTTCCGXhoⅠ

下劃線表示反向互補(bǔ)序列，黑體部分為柔性氨基酸

Underline represents reverse complementary sequence, the blackbody part represents the flexible amino acid

調(diào)整細(xì)胞濃度至106·mL-1。向24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入0.5 mL的細(xì)胞懸液，并輕搖細(xì)胞培養(yǎng)板使細(xì)胞均勻分布，于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h使細(xì)胞貼壁，而后棄去未貼壁的細(xì)胞，以滅菌的PBS輕柔洗滌細(xì)胞一次，每孔加入0.5 mL的含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37 ℃、5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.6 抗GP5重組蛋白抗體在PAM細(xì)胞上的中和活性分析

將達(dá)到效價的抗重組蛋白血清和陰性血清滅活處理后，均做2、4、8、16、32倍的系列稀釋，分別與等體積的含200個TCID50的同源毒株P(guān)RRSV VR2332和異源毒株P(guān)RRSV HeN-3作用1 h后，接種于單層的PAM細(xì)胞，同時設(shè)立鼠PRRSV陽性血清對照、接毒細(xì)胞對照、正常細(xì)胞對照和血清毒性對照。48 h后收獲樣品，以段二珍[13]建立的PRRSV實(shí)時定量PCR方法檢測各孔中PRRSV拷貝數(shù)；采用雙因素方差分析法(Two-way ANOVA)對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析比較，以王冬梅[14]建立的中和抗體檢測方法確定中和活性。

2 結(jié) 果

2.1 PRRSV 截短GP5蛋白的原核表達(dá)

將成功構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-ORF5NC重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌BL21中，以最佳的IPTG誘導(dǎo)濃度和最佳的誘導(dǎo)表達(dá)時間成功表達(dá)出大小約31 ku的截短重組GP5蛋白(N-端融合有大小為17.6 ku的6×His蛋白標(biāo)簽)，與預(yù)期蛋白大小相符。以尿素法純化包涵體蛋白并復(fù)性，分別以鼠抗His單克隆抗體和PRRSV陽性血清為一抗對重組蛋白進(jìn)行Western blotting檢測，結(jié)果顯示，重組蛋白可以被鼠抗His單克隆抗體和豬抗PRRSV陽性血清(圖1: 7、8泳道)所識別，表明重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。

2.2 PRRSV 全長和截短GP5蛋白的真核表達(dá)

兩種重組蛋白在Sf9細(xì)胞中成功獲得了不溶性表達(dá)。以SDS-PAGE和Western blotting對兩種重組桿狀病毒所表達(dá)的蛋白進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，Sf9細(xì)胞中分別表達(dá)了大小約為22 ku的全長GP5重組蛋白和大小為17 ku的截短GP5重組蛋白，與預(yù)期蛋白大小相符，正常細(xì)胞和野生型病毒感染細(xì)胞對照中均未檢測到特異性條帶。大量表達(dá)的兩種重組蛋白經(jīng)Ni+柱親和層析方法進(jìn)行純化，并通過SDS-PAGE以及ImageJ軟件進(jìn)行灰度分析，其中AcMNPV-ORF5表達(dá)純化產(chǎn)物為90.3%，AcMNPV-ORF5表達(dá)純化產(chǎn)物為92.6%。同時，分別以抗His單克隆抗體和豬抗PRRSV陽性血清對重組蛋白進(jìn)行Western blotting分析(圖1: 1～6泳道)。

2.3 抗不同類型PRRSV GP5重組蛋白抗體的中和活性分析

2.3.1 三種重組蛋白抗血清的ELISA效價檢測 以方陣滴定法對三種重組蛋白的最佳抗原包被濃度進(jìn)行摸索，發(fā)現(xiàn)原核截短的GP5蛋白最佳包被濃度為5 μg·mL-1，真核全長和真核截短的GP5蛋白的最佳包被濃度均為2.5 μg·mL-1。以最佳的重組蛋白抗原包被濃度包被ELISA平板，檢測三種重組蛋白抗血清的效價，以待檢測孔OD450 nm≥0.3且P/N值≥2.1作為判定標(biāo)準(zhǔn)，測得抗原核截短GP5蛋白、抗真核全長GP5蛋白和抗真核截短GP5蛋白抗血清的ELISA效價分別為1∶25 600、1∶12 800和1∶12 800。當(dāng)以PRRSV全病毒作為ELISA包被抗原檢測抗血清時，測得抗原核截短GP5蛋白、抗真核全長GP5蛋白和抗真核截短GP5蛋白抗血清的ELISA效價分別為1∶200、1∶800和1∶1 600。結(jié)果表明，三種重組蛋白抗血清均具有良好的反應(yīng)原性。

M. 蛋白質(zhì)相對分子量標(biāo)準(zhǔn)；1. 以6×His單抗檢測重組蛋白AcMNPV-ORF5；2. 以豬PRRSV VR2332陽性血清檢測重組蛋白AcMNPV-ORF5；3. 正常Sf9細(xì)胞總蛋白；4. 以6×His單抗檢測重組蛋白AcMNPV-ORF5NC；5. 以豬PRRSV陽性血清檢測重組蛋白AcMNPV-ORF5NC；6. 經(jīng)野生型桿狀病毒感染后的Sf9細(xì)胞總蛋白；7. 以6×His單抗檢測純化的原核表達(dá)GP5重組蛋白；8. 以豬抗PRRSV VR2332陽性血清檢測純化的原核表達(dá)GP5重組蛋白M. Protein marker; 1. Recombinant protein of AcMNPV-ORF5 with anti-6×His mAb as the first antibody; 2. Recombinant protein of AcMNPV-ORF5 with PRRSV VR2332 porcine serum as the first antibody; 3. Total cellular proteins of Sf9; 4. Recombinant protein of AcMNPV-ORF5NC with anti-6×His mAb as the first antibody; 5. Recombinant protein of AcMNPV-ORF5NC with PRRSV porcine serum as the first antibody; 6. Total cellular proteins of Sf9 infected with AcMNPV; 7. Recombinant GP5 protein through prokaryotic expression system with anti-6×His mAb as the first antibody; 8. Recombinant GP5 protein through prokaryotic expression system with PRRSV VR2332 porcine serum as the first antibody

圖1 以6×His單抗和豬抗PRRSV VR2332陽性血清檢測GP5重組蛋白的Western blotting結(jié)果Fig.1 Western blotting analysis of recombinant proteins by anti-6×His mAb and PRRSV VR2332-positive serum

2.3.2 抗三種GP5重組蛋白抗體對同源株P(guān)RRSV VR2332的中和活性 結(jié)果表明，三種抗血清均不能中和同源株P(guān)RRSV VR2332對PAM細(xì)胞的感染。雖然真核截短GP5抗血清在1∶2和1∶4倍稀釋時對同源病毒復(fù)制表現(xiàn)出略微的抑制性，但是相比陰性血清并沒有顯著差異；原核截短GP5蛋白抗血清在1∶2 倍稀釋、真核全長GP5蛋白抗血清在1∶2倍稀釋、真核截短GP5蛋白抗血清在1∶8、1∶16、1∶32倍稀釋時顯著增強(qiáng)了同源病毒的感染能力(圖2a～c)。對照組的鼠抗PRRSV VR2332陽性抗血清可以中和同源株P(guān)RRSV VR2332的感染，中和效價為1∶8(圖2d)。

2.3.3 抗三種GP5重組蛋白抗體對異源株P(guān)RRSV HeN-3的中和活性 結(jié)果顯示，三種抗血清均不能中和異源株P(guān)RRSV HeN-3對PAM細(xì)胞的感染。雖然真核截短GP5蛋白抗血清在1∶2倍稀釋、真核全長GP5蛋白抗血清在所有系列稀釋時對異源病毒復(fù)制都表現(xiàn)出略微的抑制性，但是相比陰性血清并沒有顯著差異(圖3a～c)。原核截短GP5蛋白抗血清反而顯著增強(qiáng)了異源毒株的感染能力，真核截短GP5蛋白在1∶4倍稀釋時也顯著增強(qiáng)了病毒的感染。對照組的PRRSV陽性抗血清不可以中和異源株P(guān)RRSV HeN-3的感染，反而使病毒的感染能力增強(qiáng)(圖3d)。

3 討 論

PRRSV GP5蛋白長期以來被認(rèn)為是誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的主要蛋白[15]。國內(nèi)外的相關(guān)研究均報(bào)道了中和抗體在抵抗PRRSV感染中的重要作用[16-17]，制備誘導(dǎo)高滴度中和抗體的疫苗在PRRSV的預(yù)防上具有重要意義。以桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)GP5蛋白用于PRRSV亞單位疫苗的研究也有一定的報(bào)道[18]。

a. 抗原核截短GP5蛋白抗血清中和同源株P(guān)RRSV VR2332活性的檢測；b. 抗真核全長GP5蛋白抗血清中和同源株P(guān)RRSV VR2332活性的檢測；c. 抗真核截短GP5蛋白抗血清中和同源株P(guān)RRSV VR2332活性的檢測；d. 鼠源抗PRRSV VR2332陽性血清中和同源株P(guān)RRSV VR2332活性的檢測；***.P<0.001a. Neutralizing activity of mouse anti-pET-GP5NC serum against PRRSV VR2332; b. Neutralization activity of mouse anti-AcMNPV-GP5 serum against PRRSV VR2332; c. Neutralization activity of mouse anti-AcMNPV-GP5NC serum against PRRSV VR2332; d. Neutralization activity of mouse anti-PRRSV VR2332 serum against PRRSV VR2332；***.P<0.001

圖2 三種GP5重組蛋白抗血清與同源株P(guān)RRSV VR2332的中和活性比較Fig.2 Neutralizing activity of mouse sera to the three recombinant proteins against PRRSV VR2332

a.抗原核截短GP5蛋白抗血清中和異源株P(guān)RRSV HeN-3活性的檢測；b.抗真核全長GP5蛋白抗血清中和異源株P(guān)RRSV HeN-3活性的檢測；c.抗真核截短GP5蛋白抗血清中和異源株P(guān)RRSV HeN-3活性的檢測；d.鼠源抗PRRSV VR2 332陽性血清中和異源株P(guān)RRSV HeN-3活性的檢測；*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001a. Neutralizing activity of mouse anti-pET-GP5NC serum against PRRSV HeN-3; b. Neutralizing activity of mouse anti-AcMNPV-GP5 serum against PRRSV HeN-3; c. Neutralizing activity of mouse anti-AcMNPV-GP5NC serum against PRRSV HeN-3; d. Neutralizing activity of mouse anti-PRRSV VR2332 serum against PRRSV HeN-3；*.P<0.05;**.P<0.01;***.P<0.001

圖3 三種GP5重組蛋白抗血清與異源株P(guān)RRSV HeN-3的中和活性比較Fig.3 Neutralizing activity of mouse sera to the three recombinant proteins against PRRSV HeN-3

Xu等[19]以桿狀病毒表面展示系統(tǒng)將PRRSV GP5蛋白和豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)的衣殼蛋白共展示在桿狀病毒囊膜表面，將重組病毒免疫豬，免疫血清中可檢測到高水平的抗GP5蛋白的ELISA抗體，但具有較低水平的中和活性；早期的研究發(fā)現(xiàn)，在一定量補(bǔ)體存在的情況下，感染PRRSV后康復(fù)期的豬血清可部分中和PRRSV對Marc-145細(xì)胞的感染[20]。但以上研究均是基于Marc-145細(xì)胞的中和試驗(yàn)結(jié)果。由于臨床上PRRSV只感染PAM細(xì)胞，而PAM細(xì)胞同時含有Marc-145細(xì)胞所不具有的Fc受體和唾液酸黏附素受體(Sn/CD169)，可以介導(dǎo)PRRSV 的ADE效應(yīng)，所以，基于Marc-145細(xì)胞的中和試驗(yàn)結(jié)果并不能真實(shí)反映其抗體的中和作用，因此有必要基于PAM細(xì)胞的中和試驗(yàn)來研究抗GP5蛋白抗體的中和活性。本試驗(yàn)通過桿狀病毒/昆蟲表達(dá)系統(tǒng)分別表達(dá)了全長和缺失信號肽、跨膜區(qū)的截短GP5蛋白，同時用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了截短的GP5蛋白，通過免疫小鼠獲得抗血清，并將三種抗GP5蛋白血清及抗PRRSV全病毒血清在PAM細(xì)胞上進(jìn)行了同源和異源毒株的中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示，雖然三種GP5重組蛋白的抗血清ELISA效價較高，但均沒有檢測到其中和活性，而抗全病毒的陽性抗血清，如果按照100%抑制標(biāo)準(zhǔn)，對同源和異源毒株也沒有中和活性，如果按照70%抑制標(biāo)準(zhǔn)，對同源毒株具有部分中和活性，效價為1∶8，對異源毒株的中和效價<1∶2，甚至還介導(dǎo)了ADE效應(yīng)，增強(qiáng)了病毒感染，這與基于Marc-145細(xì)胞的中和試驗(yàn)研究結(jié)果并不完全一致，說明了基于Marc-145細(xì)胞的中和試驗(yàn)研究結(jié)果與實(shí)際情況存在明顯差異。

最近的一些研究表明，GP5蛋白的主要中和表位可能更多是構(gòu)象表位[6, 21-22]，鑒于人工表達(dá)的GP5重組蛋白無法獲得構(gòu)象型中和抗原表位，其誘導(dǎo)的抗體無疑不具有有效的中和活性。本研究結(jié)果顯示真核表達(dá)的抗全長和截短GP5蛋白血清均無中和活性，而PRRSV全病毒陽性抗血清對同源毒株的感染具有部分中和活性，提示PRRSV全病毒中主要誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生的中和表位并不完全在GP5蛋白上，目前被鑒定存在中和表位的PRRSV蛋白還有GP2a、GP3、GP4和M蛋白[9, 23-25]。另外，GP5蛋白的信號肽中存在有高度變異的誘騙表位A，其作為優(yōu)勢表位可以阻礙中和表位B的暴露并阻止B表位抗體的產(chǎn)生[7-8]，這可能也是影響真核表達(dá)全長GP5蛋白抗血清免疫原性的原因之一。本試驗(yàn)中三種GP5重組蛋白的部分濃度抗血清還可以增加病毒的復(fù)制水平，可能是GP5重組蛋白在免疫小鼠時產(chǎn)生的非中和抗體所占比重較大，促使了PRRSV的ADE效應(yīng)產(chǎn)生，致使特異性的中和抗體無法發(fā)揮中和作用。本研究中的抗PRRSV全病毒陽性血清對異源毒株不具有中和活性，反而增強(qiáng)了病毒的感染，說明PRRSV誘導(dǎo)的抗體雖然能夠提供一定的免疫保護(hù)，但這種免疫保護(hù)只發(fā)生在同源毒株之間，對異源毒株并沒有效果，反而會介導(dǎo)ADE效應(yīng)發(fā)生。

4 結(jié) 論

利用三種不同形式的豬繁殖與呼吸綜合征病毒GP5重組蛋白抗血清和PRRSV全病毒高免血清在PAM細(xì)胞上進(jìn)行了同源和異源毒株的中和試驗(yàn)，結(jié)果顯示三種GP5重組蛋白抗血清沒有中和活性，全病毒抗血清對同源毒株具有部分中和作用，而對異源毒株則沒有中和活性，反而會介導(dǎo)ADE效應(yīng)發(fā)生，研究表明PRRSV誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體的中和表位并不完全在GP5蛋白上，而在GP5蛋白上的中和表位可能更多是構(gòu)象表位，這將為以GP5為目標(biāo)基因制備PRRSV亞單位疫苗的研究提供進(jìn)一步參考。

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