TPL2促進(jìn)口蹄疫病毒在BHK-21細(xì)胞復(fù)制

魏南南，徐守興，史喜娟，盧炳州，張克山，鄭海學(xué)，劉湘濤(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部畜禽病毒學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口蹄疫參考實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046)

口蹄疫(foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD)是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV)引起的急性、烈性、高度接觸性傳染病，易感動(dòng)物是牛、羊、豬等偶蹄動(dòng)物。FMDV屬于小RNA病毒科(Picornaviridae)口蹄疫病毒屬(Aphthovirus)的單股正鏈RNA病毒[1]。已知FMDV有七種血清型FMDV(A、O、Asia1、C、SAT1、SAT2和SAT3)和多個(gè)亞型[2-3]?？谔阋卟《景琑NA基因組，其由二十面體衣殼包圍，衣殼由四種結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3和VP4各60個(gè)分子構(gòu)成。FMDV基因組全長(zhǎng)約為8.5 kb，包含一個(gè)大的開放閱讀框，被翻譯為一個(gè)多聚蛋白前體。病毒的多聚蛋白被病毒編碼的蛋白酶(Lpro和3Cpro)處理，產(chǎn)生15種不同的蛋白以及多種前體物質(zhì)[4]，其中包括3種結(jié)構(gòu)蛋白(VP0、VP1和VP3)以及8種非結(jié)構(gòu)蛋白(L、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D)[5]。

絲裂原活化蛋白激酶(MAPKs)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是細(xì)胞內(nèi)主要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。MAPKs在大量炎癥和疾病的發(fā)病機(jī)制中扮演至關(guān)重要的角色，同時(shí)也是免疫、癌變和細(xì)胞凋亡途徑的調(diào)節(jié)劑[6]。MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在病原誘導(dǎo)宿主保護(hù)性反應(yīng)中發(fā)揮重要功能，研究發(fā)現(xiàn)許多病毒可以直接利用這些途徑利于其自身復(fù)制[7]。TPL2(tumor progression locus 2)又稱COT(cancer Osaka thyroid)/MAP3K8，是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶。TPL2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在先天性和適應(yīng)性免疫以及在癌癥中作為潛在的原癌基因起著重要作用[6]。研究表明TPL2在穩(wěn)態(tài)條件下結(jié)合p50(NF-κB1)的前體蛋白p105，其可以阻斷TPL2的激活[8-9]。Toll樣受體或TNF受體超家族的配體，可以激活I(lǐng)KKα/β也能導(dǎo)致p105蛋白的水解，釋放TPL2，并允許未知激酶激活TPL2[10-11]。活化的TPL2直接磷酸化MAP2K MEK，然后激活MAPK ERK[12]。除了這個(gè)主要功能之外，TPL2還涉及MAPK8(JNK)、MAPK14(p38)和轉(zhuǎn)錄因子NFAT和NF-κB的活化[13]。因此，TPL2可以在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后調(diào)控一些基因表達(dá)包括促炎細(xì)胞因子和二級(jí)介質(zhì)，以及抗炎性細(xì)胞因子[14]。在LPS刺激巨噬細(xì)胞中，TPL2的缺失會(huì)使TNF-α的產(chǎn)生減少； TPL2-/-小鼠同WT小鼠相比，對(duì)李斯特菌、結(jié)核分枝桿菌和流感病毒的易感程度增加[15-16]；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)LPS或TLR9的配體CpG刺激TPL2缺失的巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞導(dǎo)致IL-1β的產(chǎn)生減少[17]； TPL2可能通過調(diào)節(jié)抗原呈遞細(xì)胞APC中IL-12和IL-23的表達(dá)從而參與平衡Th1/ Th17分化[18]。TPL2在先天免疫中的作用僅限于細(xì)菌感染模型，使用病毒病原體進(jìn)行的相關(guān)研究比較少。

TPL2與FMDV的致病性仍不清楚，為明確TPL2在FMDV致病過程中發(fā)揮的作用，本研究對(duì)FMDV易感BHK-21細(xì)胞的TPL2基因進(jìn)行感染試驗(yàn)，利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)評(píng)價(jià)FMDV感染BHK-21細(xì)胞，又分別進(jìn)行過表達(dá)和RNAi，利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blotting技術(shù)評(píng)價(jià)FMDV的復(fù)制，證實(shí)TPL2可以促進(jìn)FMDV復(fù)制，為進(jìn)一步深入研究FMDV的免疫機(jī)制積累了數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

口蹄疫毒株A/GDMM/CHA/2013和BHK-21細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室提供；兔抗TPL2多抗購于Abcam公司(ab137589)；鼠抗Flag單抗、HRP標(biāo)記山羊抗鼠IgG二抗和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購于Santa Cruz公司；鼠抗β-actin單抗購于Thermo Scientific公司(MA1-140)；抗FMDV全血清由本實(shí)驗(yàn)室制備，Western blotting檢測(cè)可顯出VP0、VP1和VP3蛋白條帶。

大腸桿菌Trans5α感受態(tài)、LATaqDNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶KpnⅠ和XbaⅠ、T4 DNA連接酶、Trizol試劑、RNA酶抑制劑(RRI)、Oligo(dT)引物、隨機(jī)引物、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)、SYBR Permix ExTaqⅡ和蛋白預(yù)染Marker均購于寶生物工程大連有限公司；5×First Buffer、0.1 mol·L-1DTT、反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV和LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑均購于Invitrogen公司；Opti-MEM、0.25% EDTA胰酶和新生牛血清(FBS)均購于Gibco公司；MEM 細(xì)胞培養(yǎng)液和PBS溶液購于Hyclone公司；ECL顯色劑購于Thermo Scientific公司；NP-40裂解液和PMSF購于碧云天公司；TPL2干擾序列由上海吉瑪制藥有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 TPL2真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建 設(shè)計(jì)并合成TPL2引物，引入酶切位點(diǎn)KpnⅠ和XbaⅠ，以真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV3-N-Flag為載體，構(gòu)建pCMV3-TPL2-Flag表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和序列測(cè)定。

1.2.2 TPL2 RNAi設(shè)計(jì)與合成 設(shè)計(jì)并合成TPL2 RNAi序列。分別設(shè)計(jì)了3對(duì)針對(duì)TPL2基因的RNAi序列，引物序列見表1，由上海吉瑪制藥有限公司合成。

表1本試驗(yàn)用到的干擾、引物序列

Table1RNAiandprimersequencesusedinthisstudy

基因Gene干擾、引物序列(5′→3′)RNAiandprimersequencesTPL2?354Forward：GCAUUUAAAUGUGUCGGAATTReverse：UUCCGACACAUUUAAAUGCTTTPL2?855Forward：GCAUGAGAACAUUGCUGAATTReverse：UUCAGCAAUGUUCUCAUGCTTTPL2?1500Forward：GGACUCUGCCCUCUUUGAATTReverse：UUCAAAGAGGGCAGAGUCCTTNegativeForward：UUCUCCGAACGUGUCACGUTTcontrolReverse：ACGUGACACGUUCGGAGAATTTPL2Forward：AAGACATTGCTGGTGACTGCAGTReverse：GGATTCAAGGCTTCGTGTTTCAGAPDHForward：GAGAAACCTGCCAAGTATGATGACReverse：AGAGTGGGAGTTGCTGTTGAAGFMDVForward：CACTGGTGACAGGCTAAGGReverse：CCCTTCTCAGATTCCGAGT

1.2.3 細(xì)胞的轉(zhuǎn)染和細(xì)胞感染 將細(xì)胞消化后鋪于細(xì)胞板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～90%時(shí)，將質(zhì)粒與LipofectamineTM3000中的LipofectamineTM3000試劑(兩者按照比例為1 μg∶2 μL)分別加至Opti-MEM中，同時(shí)還需將LipofectamineTM3000中的P3000試劑加至有質(zhì)粒的Opti-MEM中(兩者按照比例為1 μg∶2 μL)，如果轉(zhuǎn)染為siRNA無需將P3000試劑加至有siRNA的Opti-MEM，之后直接將兩者混合，靜止15 min；將Opti-MEM混合物直接加至細(xì)胞中；將細(xì)胞重新置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)24 h。

轉(zhuǎn)染24 h后，用無血清的MEM將細(xì)胞清洗兩遍，以去除細(xì)胞中殘留的血清，用1 MOI FMDV感染BHK-21細(xì)胞，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育1 h之后，棄去含有病毒的培養(yǎng)基，換成2%FBS MEM維持液，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.4 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 采用Triozl裂解法提取細(xì)胞的總RNA，并反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板用于實(shí)時(shí)定量PCR，反轉(zhuǎn)錄體系20.0 μL：4 μL 5×First buffer，2 μL 0.1 mol·L-1DTT，1 μL oligo(dT)，0.5 μL Radom primers，1 μL RNA酶抑制劑RRI，1 μL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，1 μL dNTPs，4.5 μL DEPC水，5 μL RNA模板。反應(yīng)程序：25 ℃ 10 min，37 ℃ 60 min，70 ℃ 15 min。

1.2.5 TPL2過表達(dá)試驗(yàn) 將細(xì)胞消化后鋪于細(xì)胞板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染不同劑量的TPL2真核表達(dá)質(zhì)粒，同時(shí)在轉(zhuǎn)染過程中轉(zhuǎn)入pCMV3-N-Flag空載體來設(shè)置對(duì)照。在轉(zhuǎn)染后24 h，用1 MOI FMDV感染BHK-21細(xì)胞，感染10 h收取兩份細(xì)胞樣品；一份用于實(shí)時(shí)定量PCR，以GAPDH作為內(nèi)參，分別檢測(cè)TPL2和FMDV轉(zhuǎn)錄水平的變化；另一份用于Western blotting，以β-Actin作為內(nèi)參，分別檢測(cè)Flag-TPL2和FMDV蛋白水平的變化。

1.2.6 TPL2 siRNA干擾試驗(yàn) 將細(xì)胞消化后鋪于細(xì)胞板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至50%～60%時(shí)，分別轉(zhuǎn)染NC siRNA 和TPL2 siRNA，轉(zhuǎn)染36 h后，感染1 MOI FMDV，分別在感染后0、4、8和12 h收取兩份細(xì)胞樣品；一份用于實(shí)時(shí)定量PCR，以GAPDH作為內(nèi)參，分別檢測(cè)TPL2和FMDV轉(zhuǎn)錄水平的變化；另一份用于Western blotting，以β-actin作為內(nèi)參，分別檢測(cè)TPL2和FMDV蛋白水平的變化。

1.2.7 Western blotting 細(xì)胞蛋白樣品的制備：棄去培養(yǎng)液，用1×PBS漂洗細(xì)胞2次，去除細(xì)胞碎片；加入適量的NP-40裂解液，并在使用前數(shù)分鐘內(nèi)加入PMSF，使PMSF的最終濃度為1 mol·L-1；充分裂解后，12 000 r·min-1離心10 min，將樣品上清收集于新準(zhǔn)備的EP管中，再加入5×SDS Loading Buffer(已加β-巰基乙醇)，100 ℃煮樣10～15 min。

SDS-PAGE蛋白凝膠電泳及轉(zhuǎn)?。号渲?0%聚丙烯酰胺蛋白膠；取適量的蛋白樣品上樣，同時(shí)加上蛋白預(yù)染Marker作為大小的指示；電泳電壓先調(diào)80 V跑30 min，待蛋白樣品跑出濃縮膠進(jìn)入分離膠后，將電壓調(diào)至120 V，直至電泳結(jié)束;電泳結(jié)束后200 mA，轉(zhuǎn)膜2 h；轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，利用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；封閉之后，TBST洗2次，每次5 min；孵育一抗，4 ℃過夜(一抗可以回收利用)；TBST快洗3次，每次10 min；孵育二抗，室溫孵育2 h；TBST快洗3次，每次10 min；用高分辨圖像采集系統(tǒng)進(jìn)行ECL顯影并保存結(jié)果。

1.2.8 實(shí)時(shí)定量PCR 實(shí)時(shí)定量PCR的反應(yīng)體系(20 μL)：10 μL SYBR Permix ExTaqⅡ，0.8 μL上游引物，0.8 μL下游引物，7 μL DEPC水，ROXⅡ0.4 μL和1 μL cDNA。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火加延伸34 s，共40個(gè) 循環(huán)。定量引物序列見表1所列，引物序列由金唯智公司合成。

2 結(jié) 果

2.1 FMDV感染BHK-21細(xì)胞致內(nèi)源性TPL2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)

將BHK-21細(xì)胞鋪于35 mm小皿中，待細(xì)胞長(zhǎng)至80%～90%時(shí)，根據(jù)試驗(yàn)方法“1.2.3”進(jìn)行感染試驗(yàn)，分別在0、20、40、60 min收取細(xì)胞樣品，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，以GAPDH作為內(nèi)參，分別檢測(cè)TPL2和FMDV轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明隨著FMDV的轉(zhuǎn)錄水平的上升，TPL2的轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)顯著的上調(diào)(圖1)。

2.2 TPL2過表達(dá)促進(jìn)FMDV的復(fù)制

2.2.1 Flag-TPL2真核質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá) 構(gòu)建Flag-TPL2真核質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增、酶切和序列鑒定正確(圖略)，將構(gòu)建的Flag-TPL2真核質(zhì)粒以不同的劑量轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后24 h，收取細(xì)胞樣品，Western blotting驗(yàn)證Flag-TPL2真核質(zhì)粒的表達(dá)。結(jié)果表明，構(gòu)建的Flag-TPL2真核質(zhì)?？梢栽贐HK-21細(xì)胞中表達(dá)，并且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖2)。

A.實(shí)時(shí)定量檢測(cè)FMDV轉(zhuǎn)錄水平的變化；B.實(shí)時(shí)定量檢測(cè)TPL2轉(zhuǎn)錄水平的變化A.The mRNA level of FMDV was detected by qPCR; B. The mRNA level of TPL2 was detected by qPCR

圖1 FMDV感染誘導(dǎo)TPL2轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)Fig.1 FMDV infection induced an increase of TPL2 transcriptional level

圖2 Western blotting驗(yàn)證TPL2蛋白在BHK-21細(xì)胞表達(dá)Fig.2 Verification the expression of TPL2 protein by Western blotting in BHK-21 cells

2.2.2 過表達(dá)TPL2促進(jìn)FMDV在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制 按照試驗(yàn)方法“1.2.5”，轉(zhuǎn)染不同劑量Flag-TPL2真核表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)隨著TPL2轉(zhuǎn)錄水平的上升(圖3A)，F(xiàn)MDV的轉(zhuǎn)錄水平也呈現(xiàn)上調(diào)的趨勢(shì)(圖3B)；同時(shí)檢測(cè)了蛋白水平的變化，與轉(zhuǎn)錄水平變化一致，隨著TPL2蛋白表達(dá)的增加，F(xiàn)MDV蛋白的表達(dá)水平呈現(xiàn)明顯上調(diào)的趨勢(shì)，并且呈現(xiàn)劑量依賴性(圖3C)。結(jié)果表明，過表達(dá)TPL2促進(jìn)FMDV在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制。

2.3 TPL2 siRNA干擾效果

將siRNA-354、siRNA-855、siRNA-1500和NC siRNA分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，設(shè)置不同的轉(zhuǎn)染劑量和作用時(shí)間后收集細(xì)胞樣品，同時(shí)用qRT-PCR和Western blotting檢測(cè)不同TPL2 RNAi序列對(duì)TPL2轉(zhuǎn)錄水平及表達(dá)水平的干擾作用。結(jié)果表明，編號(hào)為TPL2-1500的干擾序列在轉(zhuǎn)染濃度為150 pmol·mL-1以及作用時(shí)間為36 h時(shí)，TPL2轉(zhuǎn)錄水平(圖4A)及蛋白表達(dá)水平(圖4B)干擾效果最佳。

A.實(shí)時(shí)定量檢測(cè)TPL2轉(zhuǎn)錄水平變化；B.實(shí)時(shí)定量檢測(cè)FMDV轉(zhuǎn)錄水平變化；C.Western blotting檢測(cè)TPL2和FMDV蛋白水平變化A.TPL2 transcription was detected by qPCR; B.FMDV transcription was detected by qPCR; C.TPL2 and FMDV proteins were detected by Western blotting

圖3 過表達(dá)TPL2促進(jìn)FMDV在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制Fig.3 Overexpression of TPL2 enhanced FMDV replication in BHK-21 cells

A.實(shí)時(shí)定量檢測(cè)TPL2轉(zhuǎn)錄水平變化；B. Western blotting檢測(cè)TPL2蛋白水平變化A.TPL2 transcriptional level was evaluated by qPCR; B.TPL2 protein level was evaluated by western blotting

圖4 鑒定BHK-21細(xì)胞中TPL2 siRNA的干擾效率Fig.4 Evaluation of the efficiency of TPL2 siRNA in BHK-21 cells

2.4 下調(diào)表達(dá)內(nèi)源性TPL2抑制FMDV在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制

利用siRNA干擾技術(shù)，下調(diào)內(nèi)源性TPL2蛋白表達(dá)，觀察FMDV在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制的變化。結(jié)果表明，在不同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比，TPL2轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)(圖5A)，F(xiàn)MDV的mRNA水平也呈現(xiàn)下調(diào)的趨勢(shì)(圖5B)；同時(shí)檢測(cè)蛋白水平的變化，在不同時(shí)間點(diǎn)與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)TPL2蛋白表達(dá)下調(diào)，F(xiàn)MDV的蛋白表達(dá)水平也是呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)(圖5C)，即下調(diào)表達(dá)內(nèi)源性TPL2抑制FMDV在BHK-21細(xì)胞中的復(fù)制。

A.實(shí)時(shí)定量檢測(cè)TPL2轉(zhuǎn)錄水平變化；B.實(shí)時(shí)定量檢測(cè)FMDV轉(zhuǎn)錄水平上的變化；C.Western blotting檢測(cè)TPL2和FMDV蛋白水平變化A.TPL2 transcriptional level was detected by qPCR; B.FMDV transcriptional level was detected by qPCR; C.TPL2 and FMDV protein levels were detected by Western blotting

圖5 下調(diào)表達(dá)內(nèi)源性TPL2抑制FMDV的復(fù)制Fig.5 Downregulation of endogenous TPL2 inhibited FMDV replication

3 討 論

病原體為了自身在宿主中進(jìn)行復(fù)制和傳播，會(huì)破壞宿主的防御機(jī)能，以抵抗天然免疫系統(tǒng)，比如FMDV在體外可以主動(dòng)抑制宿主干擾素的產(chǎn)生[19-20]。另外，F(xiàn)MDV或者FMDV合成的一些蛋白質(zhì)可以通過抑制宿主蛋白的翻譯或轉(zhuǎn)錄水平來拮抗宿主的先天性反應(yīng)[21]。FMDV的前導(dǎo)蛋白酶Lpro通過破壞干擾素(IFN)信號(hào)通路抑制宿主先天免疫應(yīng)答從而來促進(jìn)病毒的復(fù)制[21]，F(xiàn)MDV的3Cpro通過剪切干擾素信號(hào)通路中接頭蛋白NEMO來抑制病毒刺激產(chǎn)生IFN-α/β[22]，另外它還能阻斷IFN信號(hào)通路中STAT1和STAT2的入核[23],近期有研究表明3Cpro可以通過溶酶體途徑誘導(dǎo)雙鏈RNA活化蛋白激酶(PKR)降解，從而拮抗宿主PKR介導(dǎo)的抗病毒作用[24]。 FMDV的結(jié)構(gòu)蛋白VP1也可以抑制Ⅰ型IFN的誘導(dǎo)，F(xiàn)MDV的非結(jié)構(gòu)蛋白2B蛋白可以與RIG-Ⅰ相互作用，降低RIG-Ⅰ在宿主細(xì)胞中的表達(dá)，來抵抗宿主的抗病毒機(jī)制[25]。FMDV的非結(jié)構(gòu)蛋白3A通過與干擾素信號(hào)通路中的接頭蛋白 RIG-Ⅰ，MDA5和VISA相互作用，此外3A還破壞RIG-Ⅰ、MDA5和VISA 的mRNA水平的變化，表明3A抑制RLR介導(dǎo)的IFN-β[26]。總之，F(xiàn)MDV通過自身的一些結(jié)構(gòu)蛋白或者非結(jié)構(gòu)蛋白與宿主蛋白作用，從而來逃避宿主的免疫系統(tǒng)。

TPL2在天然免疫中起著關(guān)鍵的作用，在調(diào)節(jié)TNF-α，Toll樣受體和G蛋白偶聯(lián)受體信號(hào)中起著重要的作用[27]。TPL2通過促進(jìn)ERK依賴性誘導(dǎo)c-fos(AP-1異二聚體轉(zhuǎn)錄因子的組成成分)，在調(diào)節(jié)IFN產(chǎn)生起重要作用[28]。同時(shí)TPL2是以細(xì)胞類型特異性方式針對(duì)模式病毒配體的刺激有差異地調(diào)節(jié)IFN產(chǎn)生[16]。在漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDCs)中通過TPL2誘導(dǎo)產(chǎn)生IFN-α，而在TPL2-/-的CD4+T細(xì)胞中分泌IFN-γ的能力顯著減弱，但是在巨噬細(xì)胞和DCs中，TPL2卻是IFN-β有效的負(fù)調(diào)節(jié)因子[28-29]。TPL2在不同的組織中都有廣泛的表達(dá)，但是在各組織中具體的功能報(bào)道較少，對(duì)于其與病毒之間的相互作用以及具體分子機(jī)制相關(guān)的報(bào)道也是所知甚微。有研究表明TPL2以細(xì)胞類型特異性方式差異性地調(diào)控流感病毒感染所涉及的PRRs下游的IFN產(chǎn)生，在TPL2-/-的巨噬細(xì)胞和上皮細(xì)胞，TPL2抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生，而在pDCs中是促進(jìn)Ⅰ型和Ⅲ型干擾素的產(chǎn)生[28]。TPL2在調(diào)節(jié)IFN-α/β和IFN-λ產(chǎn)生過程中至關(guān)重要，在流感病毒的研究當(dāng)中，發(fā)現(xiàn)在pDCs中TPL2是通過激活A(yù)kt和ERK誘導(dǎo)IFN-λ的產(chǎn)生來抵抗流感病毒的感染[17]。在有關(guān)丙型肝炎病毒(HCV)的研究報(bào)告中，miR-17-5p和miR-17-5p靶向TPL2 3′UTR來抑制TPL2蛋白表達(dá)從而抑制HCV的復(fù)制[30]。FMDV可以通過各種方式來逃避宿主的天然免疫系統(tǒng)，而TPL2在天然免疫的過程中也發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，所以，關(guān)于TPL2是否調(diào)節(jié)IFN的產(chǎn)生進(jìn)而影響FMDV在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制將是下一步的研究方向和重點(diǎn)。

4 結(jié) 論

首先使用FMDV感染BHK-21細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)TPL2的轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，表明TPL2與FMDV感染復(fù)制之間有著必然的聯(lián)系。其次，本研究成功構(gòu)建Flag-TPL2真核質(zhì)粒，并且通過Western blotting驗(yàn)證了其能夠正常表達(dá)。通過過表達(dá)TPL2蛋白，可以顯著促進(jìn)FMDV在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制，同時(shí)下調(diào)表達(dá)TPL2會(huì)抑制FMDV在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制。本研究表明在FMDV易感的BHK-21細(xì)胞中，F(xiàn)MDV的復(fù)制和TPL2的表達(dá)呈正相關(guān)性，即TPL2是促進(jìn)FMDV在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制，通過FMDV感染試驗(yàn)，以及過表達(dá)和干擾兩個(gè)試驗(yàn)，從轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平兩個(gè)方面證明TPL2可以促進(jìn)FMDV在BHK-21細(xì)胞中復(fù)制。

參考文獻(xiàn)(References)：

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