發(fā)酵玉米-豆粕型全價飼料對生長豬生長性能、糞便臭味物質和菌群區(qū)系的影響

劉志云，鐘曉霞，謝躍偉，肖 融，江 山，黃 健，黃金秀，周曉容(重慶市畜牧科學院 農業(yè)部養(yǎng)豬科學重點實驗室，重慶 402460)

隨著我國畜牧業(yè)的穩(wěn)定發(fā)展以及人們對綠色安全畜產品關注的進一步提升，生物發(fā)酵飼料已成為我國飼料工業(yè)的重要組成部分。通過微生物的代謝作用，不僅可以降解飼料中的部分多糖、蛋白質、脂肪等大分子物質，生成有機酸、可溶性多肽等小分子物質，提高飼料養(yǎng)分消化率[1]，而且發(fā)酵飼料中的大量活性益生菌及其代謝產物可調節(jié)畜禽腸道微生態(tài)平衡，改善腸道功能和健康，對于提高動物生長性能、減少抗生素使用具有重要作用[2]。生物飼料對動物腸道菌群的調節(jié)作用，尤其是后腸微生物的改變，直接影響到后腸微生物的發(fā)酵方式，進而影響糞便中的惡臭化合物組成[3-4]和豬舍環(huán)境衛(wèi)生。目前，國外關于發(fā)酵全價飼料的研究較為成熟，在養(yǎng)豬生產上具有較好的應用效果，但多為液體發(fā)酵飼料。國內受限于飼喂設備、工藝等，液體飼喂模式未得到較好發(fā)展，研究多為固態(tài)發(fā)酵工藝，近年來多集中在花生粕[1]、棉粕[5]、豆粕[6]等原料的發(fā)酵，全價飼料發(fā)酵研究相對較少。

本試驗以玉米-豆粕型基礎日糧為發(fā)酵底物，通過添加外源菌劑，進行厭氧固態(tài)發(fā)酵，制備成發(fā)酵全價飼料，研究固態(tài)發(fā)酵全價飼料對生長豬生產性能、糞便臭味物質以及糞便菌群區(qū)系的影響。

1 材料與方法

1.1 發(fā)酵飼料的制備

參照《中國豬飼養(yǎng)標準2004》肉脂型生長豬營養(yǎng)需要量，配制玉米-豆粕型基礎日糧，日糧組成及其營養(yǎng)水平見表1。隨后將日糧與水按55∶47的比例混合均勻，使水分含量達到50%左右，接種0.5%的發(fā)酵菌液，混合均勻后分裝入發(fā)酵桶中密封，自然發(fā)酵3 d后即可使用，每桶拆封后3 d內用完。所用發(fā)酵菌液為短乳桿菌與地衣芽孢桿菌，二者比例為1∶1。

1.2 試驗設計

試驗于2017年4-5月在重慶市畜牧科學院動物營養(yǎng)研究所試驗豬場進行。選取22 kg左右，體重相近的(約克夏×榮昌豬二元雜交豬)生長豬90頭，隨機分成3組，每組6個重復，每個重復5頭，經7 d預飼后，分別飼喂無抗日糧(對照組)，含0.04% 桿菌肽鋅(有效含量為10%)的日糧(抗生素組)，發(fā)酵全價日糧(發(fā)酵組)，試驗期30 d。試驗期間，豬只自由采食和飲水，按豬場常規(guī)程序消毒免疫。

表1基礎飼糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)

Table1Thecompositionandnutrientlevelsofbasaldiets(airdrybasis) %

1). 預混料為每千克飼糧提供: VA 1 500 IU，VD3200 IU，VE 10 IU，VK 30.5 mg，生物素0.05 mg，膽堿0.3 g，葉酸0.3 mg，煙酸10.0 mg，泛酸10.0 mg，VB11.0 mg，VB22.5 mg，VB61.0 mg，VB1210.0 μg，Cu 4 mg，F(xiàn)e 60 mg，Zn 65 mg，Mn 3 mg，Se 0.25 mg，I 0.15 mg。2). 所有營養(yǎng)成分均為計算值

1). The premix provides the following per kg of diets: VA 1 500 IU, VD3200 IU, VE 10 IU, VK 30.5 mg, Biotin 0.05 mg, choline 0.3 g, folic acid 0.3 mg, niacin 10.0 mg, pantothenic acid 10.0 mg, VB11.0 mg, VB22.5 mg, VB61.0 mg, VB1210.0 μg, Cu 4 mg, Fe 60 mg, Zn 65 mg, Mn 3 mg, Se 0.25 mg, I 0.15 mg.2). All of the values are calculated

1.3 樣品采集與生長性能測定

試驗期間，以圈為單位記錄采食量。試驗結束時空腹稱重，記錄豬只末重，計算平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)、料重比(F/G)。

試驗結束當天上午8:00，以圈為單位采集豬新鮮排泄的糞便，使用無菌勺掰開糞便，取未沾到地面的中心部分，放到無菌封口袋中，收集半袋后混勻，一部分分裝于EP管中，-80 ℃保存，用于糞便菌落多樣性檢測和分析；另一部分分裝于50 mL離心管，放置于冰盒中，運回實驗室后立即處理樣品，測定吲哚、3-甲基吲哚、對甲酚以及揮發(fā)性脂肪酸(VFA)含量。

1.4 糞便臭味物質測定

飼料常規(guī)養(yǎng)分測定參照《飼料分析及飼料質量檢測技術》[7]。發(fā)酵飼料pH的檢測：稱取10 g樣品置于90 mL水中，混勻后在搖床上震蕩30 min，靜置，用pH計測定pH。飼料中乳酸含量測定采用對羥基聯(lián)苯比色法進行測定[8]；乳酸菌含量按照《GB4789.35-2010食品微生物學檢驗 乳酸菌檢驗》進行測定。糞便中苯環(huán)類化合物(對甲酚、吲哚、3-甲基吲哚)[9]以及VFA[10]的測定采用氣相色譜法。

1.5 糞便菌群豐度和多樣性測定

糞便總DNA的抽提采用MoBio PowerFecal?DNA提取試劑盒(MoBio, USA)，參照說明書的提取方法提取總DNA。DNA片段的完整性經1%瓊脂糖膠檢測。隨后對16S rRNA V3-V4基因片段進行PCR(ABI GeneAmp?9700型)擴增，所用引物為338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)[11]。試驗采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase 20 μL反應體系：5×FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 2 μL，F(xiàn)orward Primer(5 μmol·L-1) 0.8 μL，Reverse Primer(5 μmol·L-1) 0.8 μL，F(xiàn)astPfu Polymerase 0.4 μL，Template DNA 10 ng，補ddH2O至20 μL。PCR擴增產物經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，切膠回收，進行MiSeq 高通量測序(Illumina, San Diego, USA)，高通量測序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成。

對測序得到的序列質量進行質控和過濾后，在97%的相似水平下進行OUT聚類和生物信息統(tǒng)計分析，以MOTHUR軟件及序列聚類軟件Usearch(vsesion 7.1)進行序列比較及分析(對比數據庫為Silva)。

1.6 數據處理及統(tǒng)計分析

試驗數據以“平均值±標準誤”表示。采用SPSS19.0對發(fā)酵飼料營養(yǎng)物質變化進行獨立樣本t-檢驗，對豬只生長性能、臭味物質進行單因素方差分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結 果

2.1 飼糧發(fā)酵前后營養(yǎng)物質變化

由表2可以看出，基礎日糧經發(fā)酵處理后，粗蛋白、粗灰分、粗纖維含量未見顯著變化，粗脂肪含量顯著升高(P<0.01)，鈣(P<0.01)和總磷(P<0.05)含量顯著降低，pH顯著降低(P<0.01)，乳酸菌含量為9.67 lg cfu·g-1，乳酸含量為421.67 mmol·kg-1，大腸桿菌未檢出。由表3可以看出，基礎日糧經發(fā)酵處理后，總氨基酸和必需氨基酸含量都沒有出現(xiàn)顯著變化，非必需氨基酸的絲氨酸(P<0.05)和精氨酸(P<0.01)顯著降低，丙氨酸顯著升高(P=0.01)。

表2飼料發(fā)酵前后營養(yǎng)成分變化(風干基礎)

Table2Nutrientsvariationoffeedbeforeandafterfermentation(airdrybasis)

項目Item發(fā)酵前Beforefermentation發(fā)酵后AfterfermentationP值P?value粗蛋白/%CP15．76±0．2515．87±0．110．526粗灰分/%ASH4．27±0．124．04±0．090．052粗脂肪/%EE2．37±0．042．73±0．100．005粗纖維/%CF3．60±0．073．87±0．190．074鈣/%Ca0．82±0．0060．79±0．010．007總磷/%TP0．48±0．0060．46±0．0060．013乳酸菌/(lgcfu·g-1)LAB-9．67±0．17-pH6．89±0．024．11±0．01<0．0001乳酸/(mmol·kg-1)Lacticacid-421．67±69．70-

-表示檢測限以下

- is below detection threshold

表3飼料發(fā)酵前后氨基酸含量的變化(風干基礎)

Table3Changeofaminoacidcontentsoffeedbeforeandafterfermentation(airdrybasis) %

2.2 發(fā)酵飼料對生長豬生產性能的影響

由表4可以看出，發(fā)酵組豬只末重和ADG均顯著高于對照組(P<0.05)，與抗生素組相比差異不顯著(P>0.05)；ADFI顯著高于對照組和抗生素組(P=0.001)；F/G顯著低于對照組(P<0.05)，與抗生素組相比差異不顯著(P>0.05)。試驗期間發(fā)酵組和抗生素組豬只均未出現(xiàn)患病淘汰，對照組淘汰兩頭。

表4發(fā)酵全價飼料對生長豬生長性能的影響

Table4TheeffectofFCFonthegrowthperformanceofgrowingpigs

項目Item對照組Controlgroup抗生素組Antibioticsgroup發(fā)酵組FermentationgroupP值P?value初始均重/kgIABW22．53±0．1522．90±0．1922．82±0．040．589末重/kgFinalweight38．58±0．28b39．42±0．40ab40．12±0．25a0．025平均日增重/gADG548．30±7．84b569．50±11．79ab596．60±7．96a0．018平均日采食量/gADFI1．31±0．005b1．32±0．002b1．36±0．01a0．001F/G2．41±0．03a2．33±0．05ab2．27±0．05b0．086死淘率/%Mortality6．67±4．22a0．00±0．00b0．00±0．00b0．068

各組間，同行肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)，下同

Values with different letters superscripts mean significant difference among different groups (P<0.05). The same as below

2.3 發(fā)酵飼料對生長豬糞便臭味物質的影響

由表5可以看出，發(fā)酵組豬只新鮮糞便中的吲哚含量極顯著低于對照組和抗生素組(P<0.01)，對甲酚含量有升高趨勢，糞臭素和VFA含量有下降趨勢，其中丙酸和丁酸含量顯著低于抗生素組(P<0.05)，與對照組相比差異不顯著(P>0.05)，乙酸、異戊酸、戊酸含量差異不顯著(P>0.05)。

表5發(fā)酵飼料對生長豬糞便臭味物質的影響

Table5TheeffectofFCFontheodorconcentrationinfaecesofgrowingpigs

項目Item對照組Controlgroup抗生素組Antibioticsgroup發(fā)酵組FermentationgroupP值P?value對甲酚/(μg·g-1)P?cresol426．27±27．73370．48±15．56430．34±57．270．351吲哚/(μg·g-1)Indole50．21±5．80a38．26±3．50a23．46±5．09b0．006糞臭素/(μg·g-1)Skatole59．71±9．0657．68±11．5055．88±14．870．834乙酸/(mg·g-1)Aceticacid3．89±0．594．46±0．353．66±0．270．222丙酸/(mg·g-1)Propionicacid1．67±0．20ab1．98±0．12a1．42±0．10b0．115丁酸/(mg·g-1)Butyrate0．95±0．13ab1．14±0．15a0．73±0．08b0．103異戊酸/(mg·g-1)Isovalericacid0．16±0．050．19±0．030．16±0．040．616戊酸/(mg·g-1)Valericacid0．07±0．030．13±0．040．03±0．010．051

2.4 發(fā)酵飼料對生長豬糞菌群的影響

2.4.1 糞便細菌α-多樣性分析 提取糞便微生物基因組進行測序，分析不同處理糞便菌群的豐度和多樣性，從宏觀上評估發(fā)酵飼料對豬腸道微生物菌群的影響。從表6可以看出，發(fā)酵組豬只糞便菌群物種的豐度指數Sobs顯著高于對照組和抗生素組(P<0.05)，對照組和抗生素組相比差異不顯著；發(fā)酵組和抗生素組的Chao 1指數和Ace指數顯著高于對照組(P<0.05)。與對照組和抗生素組相比，發(fā)酵組的多樣性指數Shannon升高、Simpson指數降低，但均未達到顯著水平。表明飼喂發(fā)酵飼料可以提高豬糞便菌群的豐度，同時具有提高糞便菌群多樣性的趨勢。

2.4.2 糞便菌群結構變化 由圖1可以看出，發(fā)酵組的樣本聚類程度很高，組內相似度高，而與對照組和抗生素組的樣本距離較遠，與二者的組間相似度低。

從圖2可以看出，在門水平上(圖2a、2b)，發(fā)酵組的Tenericutes相對豐度高于其他兩組，Saccharibacteria含量高于抗生素組。在屬水平上(圖2c、2d)，發(fā)酵組的菌落組成明顯區(qū)別于其他兩組，其中發(fā)酵組的Lactobacillus、Streptococcus、Rikenellaceae、Megasphaera、Oscillospira、Mitsuokella、Prevotella相對豐度低于對照組和抗生素組；Clostridium、Turicibacter、Mollicutes、Anaerostipes、Acetitomaculum相對豐度高于對照組和抗生素組；對照組的Bifidobacterium相對豐度高于抗生素組和發(fā)酵組，抗生素組的Escherichia-Shigella相對豐度高于發(fā)酵組和對照組。

表6糞便菌群多樣性指數表

Table6Alphadiversityindexesofbacterialcommunityinfaeces

項目Item群落豐度指數CommunityrichnessSobsChao1Ace群落多樣性指數CommunitydiversityShannonSimpson對照組Controlgroup653．67±16．23b774．08±20．97b752．48±16．70b4．49±0．170．044±0．010抗生素組Antibioticsgroup686．67±12．64b823．75±17．76a816．57±11．97a4．50±0．120．052±0．012發(fā)酵組Fermentationgroup738．67±20．08a855．48±15．97a843．36±19．04a4．81±0．080．028±0．004P值P?value0．0080．0190．0040．1760．216

不同組間，同列肩標字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Values with different letters superscripts mean significant difference among different groups (P<0.05)

1-1～1-6為對照組的6個樣本，2-1～2-6為抗生素組的6個樣本，3-1～3-6為發(fā)酵組的6個樣本，下同1-1 to 1-6 are the 6 samples of control group, 2-1 to 2-6 are the 6 samples of antibiotics group, 3-1 to 3-6 are the 6 samples of fermentation group, the same as below

圖1 基于OTU水平的樣本聚類分析圖Fig.1 Hierarchical clustering tree at OTU level

3 討 論

試驗采用短乳桿菌和地衣芽孢桿菌作為發(fā)酵菌株，對全價飼料進行了3 d自然發(fā)酵后，得到發(fā)酵全價飼料，經測定發(fā)酵飼料的pH為4.11，乳酸菌活菌數為9.67 lg cfu·g-1，乳酸含量約為421.67 mmol·kg-1，這與Brooks[2]和Missotten等[12]描述的理想發(fā)酵飼料的條件相符。研究表明，發(fā)酵飼料的低pH以及高濃度的乳酸含量可以有效抑制腸桿菌、沙門氏菌等病原菌在飼料中生長繁殖[2, 13-14]。飼料在發(fā)酵過程中，大腸桿菌和沙門氏菌能夠使賴氨酸等合成氨基酸降解，生成1,5-二氨基戊烷(尸胺)[15-16]，人工接種乳酸菌，通過控制發(fā)酵飼料的乳酸含量和pH，可以有效保護賴氨酸等合成氨基酸不被分解[17]，有利于發(fā)酵飼料長期安全存儲。本研究測得的發(fā)酵全價飼料中既沒有大腸桿菌檢出，賴氨酸含量也沒有顯著改變，保證了發(fā)酵全價飼料的安全性。

在生長豬生產性能方面，與無抗基礎日糧相比，飼喂發(fā)酵飼料可以提高生長豬ADFI、ADG和飼料轉化率，降低生長豬死淘率。與含抗生素的基礎日糧相比，飼喂發(fā)酵飼料可以顯著提高生長豬ADFI、ADG和飼料轉化效率，但差異不顯著。大量研究結果表明，飼喂發(fā)酵飼料可以減少生長豬飲水量，提高干物質采食量、動物日增重和飼料轉化效率[18-20]。本試驗對生長豬生產性能的分析結果與上述研究相一致。表明發(fā)酵全價飼料具有替代抗生素、促進動物生長、提高飼料轉化率的作用。

a、c為樣本平均豐度，b、d為各個樣本豐度；a、b為門水平，c、d為屬水平a, c. The average abundance of samples; b, d. The abundance of individual sample; a, b. At the phylum level; c, d. At the genus level

圖2 豬糞便菌群豐度柱狀圖Fig.2 Bar plots showing percentage of bacterial community in pig feces

研究表明，豬糞便中最主要的惡臭氣體是揮發(fā)性脂肪酸、酚類、吲哚類、硫醇類[21]。其中對甲酚、吲哚、糞臭素在豬糞臭味物質中的相對含量高且不易去除；揮發(fā)性脂肪酸則與豬糞惡臭強度之間存在良好的相關性，且碳鏈越長除臭難度越大[22-23]。因此，本試驗主要以對甲酚、吲哚、糞臭素和揮發(fā)性脂肪酸的含量作為考核指標。從結果中可以看出，飼喂發(fā)酵全價飼料可以降低糞便中吲哚、糞臭素、揮發(fā)性脂肪酸(乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸、戊酸)含量，其中對吲哚、丙酸、丁酸的降低效果達到了顯著水平。表明全價料經發(fā)酵后，一方面養(yǎng)分消化率得到了提高；另一方面，飼喂發(fā)酵飼料改變了豬腸道微生物的菌群結構，從而影響了其對營養(yǎng)物質的消化吸收以及后腸微生物發(fā)酵方式，最終影響到糞便揮發(fā)性臭味物質的含量[3-4]。

研究表明，日糧類型可以改變腸道菌群結構[24]，而新鮮糞便菌落組成在一定程度上可以反映豬后腸道菌群組成的特征。本試驗比較了無抗基礎日糧、含抗生素的基礎日糧以及發(fā)酵全價料對豬糞便微生物群落的影響。結果表明，與無抗基礎日糧相比，含抗生素的基礎日糧在一定程度上提高了糞便菌群的豐度，對糞便菌群多樣性沒有顯著影響；與這兩組相比，發(fā)酵全價飼料顯著提高了糞便菌群的物種豐度，在一定程度上提高了物種多樣性。此外，飼喂無抗基礎日糧、含抗生素基礎日糧的豬只糞便物種組成相似，但明顯區(qū)別于發(fā)酵全價飼料組，其中飼喂發(fā)酵全價飼料的糞便中屬Lactobacillus、Streptococcus、Rikenellaceae、Megasphaera、Oscillospira、Mitsuokella、Prevotella的相對豐度低于其它兩組；門Tenericutes，屬Clostridium、Turicibacter、Mollicutes、Anaerostipes、Acetitomaculum的相對豐度高于其它兩組。發(fā)酵飼料可以改變動物胃腸道菌群組成，其中影響最顯著的就是乳酸菌，研究表明，飼喂液態(tài)發(fā)酵飼料可以提高生長豬后腸段中乳酸菌的相對豐度[25]，提高母豬及其后代生長豬糞便中的乳酸桿菌數量[26]，然而本研究發(fā)現(xiàn)，飼喂發(fā)酵飼料降低了豬只糞便中乳酸菌的相對豐度，這可能是由于發(fā)酵飼料對胃腸道中乳酸菌的影響，與不同品種豬的生理階段、腸道位點以及腸道內容物的培養(yǎng)條件都有關系，因此有待于進一步分析不同腸段位點中菌落組成特征。

4 結 論

發(fā)酵玉米-豆粕型全價飼料飼喂生長豬可以提高其生長性能，降低糞便中吲哚、糞臭素、揮發(fā)性脂肪酸的含量，提高對甲酚含量，提高新鮮糞便菌群豐度和多樣性，改變糞便菌落組成。

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