環(huán)境高溫誘導(dǎo)巴馬香豬睪丸細(xì)胞凋亡并激活Nrf2/HO-1抗氧化信號(hào)通路

李延森，李照見(jiàn)，賈瀟瀟，李春梅(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，南京 210095)

夏季環(huán)境高溫引起的公豬熱應(yīng)激是困擾公豬生產(chǎn)的一大難題。隨著全球氣候變暖趨勢(shì)加劇，近年來(lái)許多地區(qū)，特別是長(zhǎng)江中下游地區(qū)相繼出現(xiàn)夏季持續(xù)性高溫高熱天氣，一些城市(武漢、南京、蘇州、上海、杭州)夏季高溫更是突破40 ℃，致使畜舍飼養(yǎng)環(huán)境溫度大幅升高。夏季高溫會(huì)引起公豬生理內(nèi)分泌紊亂和公豬睪丸機(jī)能障礙，精液品質(zhì)下降[1]，間接導(dǎo)致母豬受胎率降低和胎兒不良發(fā)育[2]，進(jìn)而降低生豬生產(chǎn)能力，給畜牧業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。研究發(fā)現(xiàn)，高溫引起的睪丸組織氧化應(yīng)激以及生精上皮細(xì)胞凋亡和死亡，直接導(dǎo)致生精上皮損傷，精子活力和密度的降低[3-4]。核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)信號(hào)通路能夠顯著誘導(dǎo)機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)答，其缺失或激活障礙，會(huì)加劇氧化應(yīng)激程度，使細(xì)胞內(nèi)正常氧化還原穩(wěn)態(tài)失衡，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙，引起細(xì)胞毒性，細(xì)胞凋亡或死亡，它是目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞抗氧化應(yīng)答的核心途徑之一[5-6]。血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1, HO-1)能被各種引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的因素所誘導(dǎo)，其mRNA和蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)上調(diào)通常也被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的標(biāo)志，HO-1及其催化產(chǎn)物作為體內(nèi)具有高活性的抗氧化成分，能高效清除細(xì)胞過(guò)量的活性氧，緩解細(xì)胞應(yīng)激，維持細(xì)胞氧化還原平衡，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[7]。已有研究表明，Nrf2蛋白和HO-1蛋白可以在睪丸間質(zhì)細(xì)胞高水平表達(dá)，可有效緩解應(yīng)激原引起的睪丸組織細(xì)胞損傷和精子生成障礙[8-10]。然而，目前與睪丸組織細(xì)胞Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達(dá)相關(guān)研究只局限在人或鼠上，還未發(fā)現(xiàn)豬睪丸組織細(xì)胞中表達(dá)定位Nrf2蛋白和HO-1蛋白的報(bào)道，也沒(méi)有發(fā)現(xiàn)測(cè)定豬睪丸組織細(xì)胞Nrf2蛋白通路或HO-1蛋白表達(dá)模式的研究報(bào)道。因此，本試驗(yàn)旨在通過(guò)研究高溫環(huán)境對(duì)巴馬香豬陰囊溫度分布和睪丸組織中抗氧化和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，揭示豬陰囊散熱機(jī)制，明確豬睪丸組織細(xì)胞中Nrf2蛋白和HO-1蛋白表達(dá)定位模式，為探索從細(xì)胞抗氧化分子機(jī)制方面緩解高溫環(huán)境導(dǎo)致的公豬精液品質(zhì)下降提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選取巴馬香豬(泰州泰和生物科技有限公司)為試驗(yàn)對(duì)象。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選取7月齡體重相近雄性巴馬香豬(平均體重(17.93±0.91) kg)12頭，隨機(jī)分成2組，對(duì)照組和高溫組，每組6頭。對(duì)照組飼養(yǎng)環(huán)境溫度保持在25 ℃，高溫組飼養(yǎng)環(huán)境溫度為24 h從25～40 ℃循環(huán)變溫(變溫分4個(gè)階段：①09:00-10:00, 25 ℃→40 ℃；②10:00-15:00, 40 ℃；③ 15:00-16:00, 40 ℃→26 ℃；④16:00-09:00, 25 ℃)，連續(xù)8 d。高溫期間使用熱成像儀(TiR27，F(xiàn)luke Corporation，Washington，USA)記錄動(dòng)物體表溫度和陰囊皮膚溫度分布。測(cè)量陰囊皮膚溫度數(shù)值是指單次測(cè)量時(shí)整個(gè)陰囊皮膚溫度的平均值。體表溫度數(shù)值是指單次測(cè)量時(shí)整個(gè)體表溫度，包括動(dòng)物頭、耳朵、軀體、四肢和尾巴表面溫度的平均值。測(cè)量的溫度數(shù)值通過(guò)Fluke Smart View 3.1 圖像分析軟件分析所得。

1.3 樣品采集與處理

第8天高溫處理結(jié)束后，取豬睪丸器官，浸于4%多聚甲醛溶液，用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)抗氧化通路標(biāo)志蛋白Nrf2，抗氧化蛋白HO-1和細(xì)胞凋亡標(biāo)志蛋白(cleaved caspase 3，c-caspase 3)的組織表達(dá)情況。

1.4 組織切片和免疫組織化學(xué)檢測(cè)

4%多聚甲醛溶液固定好的睪丸組織，依次分別通過(guò)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋和切片，制作睪丸組織石蠟切片；然后，依次通過(guò)二甲苯和梯度酒精脫蠟止水后，用3% H2O2-甲醇處理1 h,消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性；再用0.01 mol·L-1檸檬酸三鈉(pH=6.0)微波爐抗原熱修復(fù)10 min，冷卻，0.01 mol·L-1PBS(pH=7.2～7.4)洗滌3次；10%上樣血清封閉1 h，甩干，分別加一抗Nrf2抗體(abcam, ab53019)，HO-1抗體(abcam, ab13248)，c-caspase 3(cell signaling, 9661S)抗體過(guò)夜；甩去一抗，PBS搖床洗3次，甩干，加二抗，濕盒孵育2 h，PBS搖床洗3次，甩干，加SARC濕盒孵育1 h，PBS搖床洗3次，DAB顯色，鏡檢蛋白著色表達(dá)情況；蘇木素復(fù)染40 s，沖洗返藍(lán)，常規(guī)脫水，透明，封片，最后鏡檢拍照。光鏡下觀察,棕色顆粒染色表示蛋白呈陽(yáng)性。利用Image Pro Plus 6.0 軟件(media cybernetics bethesda, MD, USA)分析對(duì)照組和高溫組睪丸組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)情況。對(duì)細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3的細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別獲得細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase3細(xì)胞的百分比。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism Version 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM)”表示，對(duì)照組和高溫組睪丸組織蛋白表達(dá)采用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度分布的影響

由表1可知，高溫組豬體表溫度顯著升高，升高幅度達(dá)到1.9 ℃，所測(cè)體表溫度范圍中最大溫度點(diǎn)為39.7 ℃，最小溫度點(diǎn)為34.9 ℃，對(duì)照組最大溫度點(diǎn)為38.8℃，最小溫度點(diǎn)為28.0 ℃；高溫組豬陰囊表面平均溫度顯著升高，升高幅度達(dá)到3.7 ℃，所測(cè)陰囊表面溫度范圍中最大溫度點(diǎn)為38.4 ℃，最小溫度點(diǎn)為36.3 ℃，對(duì)照組分別為最大溫度點(diǎn)為35.0 ℃，最小溫度點(diǎn)為31.7 ℃，最大溫度和最小溫度分別升高3.4 ℃和4.6 ℃。高溫組陰囊皮膚升高溫度幅度大于體表溫度升高幅度。與對(duì)照組相比，高溫組豬活動(dòng)減少，表現(xiàn)嗜睡。由圖1可知，豬體體表溫度升高幅度較高部分為豬頭、耳朵、四肢以及背部，相比之下腹部溫度升高幅度較低。發(fā)射率表示物體表面輻射出的能量與相同溫度的黑體輻射能量的比率。

表1環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度參數(shù)的影響

Table1EffectofhighambienttemperatureonbodyandscrotalsurfacetemperaturesinBamaminiaturepig

部位Position分組Treatment平均溫度/℃Avergetemperature最小溫度/℃Minimumtemperature最大溫度/℃Maximumtemperature發(fā)射率Emissivity體表Bodysurface對(duì)照Thermalneutral36．6±1．14a28．038．80．95高溫Heat?treated38．5±0．59b34．939．70．95陰囊表面Scrotalsurface對(duì)照Thermalneutral33．4±0．71?31．735．00．95高溫Heat?treated37．1±0．37?36．338．40．95

同列數(shù)據(jù)上標(biāo)小寫字母不同表示體表溫度組間差異顯著(P<0.05)，*.陰囊表面溫度組間差異顯著(P<0.05)(n=6)

Differentsmall letters in the same colum means significant difference in the body surface between the thermal neutral and the heat-treated treatments(P<0.05)，* in the same colum means significant difference in the scrotal surface between the thermal neutral and the heat-treated treatments(P<0.05)(n=6)

A.對(duì)照組豬熱紅外分布圖；B.對(duì)照組豬可見(jiàn)光圖；C. 高溫組豬熱紅外分布圖；D. 高溫組豬可見(jiàn)光圖。T.睪丸A.The infrared images of pigs in the thermal neutral group；B.The infrared images of pigs in the thermal neutral group；C.The visible images of pigs in the heat-treated group；D.The visible images of pigs in the heat-treated group.T.Testis

圖1 環(huán)境高溫條件下巴馬香豬體表和陰囊皮膚熱紅外分布圖Fig.1 The infrared distribution images of body and scrotal surface in Bama miniature pig under high ambient temperature

2.2 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響

由圖2可知，Nrf2蛋白主要在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(圖2A1，B1,C,D)，在睪丸生精小管表達(dá)較低(圖2A2，B2)。高溫環(huán)境影響巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)，主要對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，與對(duì)照組相比，高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高(圖2E，P<0.05)。對(duì)照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核顯示為藍(lán)色，而高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核顯示為明顯的棕色(圖2 B1)，這說(shuō)明細(xì)胞核Nrf2蛋白表達(dá)明顯升高。高溫環(huán)境影響巴馬香豬睪丸生精小管上皮組織Nrf2蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比，高溫組睪丸生精上皮組織Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高(圖2E，P<0.05)

2.3 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達(dá)的影響

由圖3可知，HO-1蛋白主要在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)(圖3 A1，B1，C,D)，在睪丸生精小管表達(dá)較低(圖3 A2，B2)，與Nrf2表達(dá)模式相似，不同的是HO-1蛋白在高溫組和對(duì)照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核的表達(dá)相似，高溫組并沒(méi)有出現(xiàn)明顯的細(xì)胞核HO-1蛋白棕色染色現(xiàn)象，這證明了Nrf2的核轉(zhuǎn)錄因子作用。高溫環(huán)境影響巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達(dá)，主要對(duì)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中HO-1蛋白表達(dá)產(chǎn)生顯著影響，與對(duì)照組相比，高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(圖3E，P<0.05)，對(duì)照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核與高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核都表現(xiàn)藍(lán)色(圖3 B1)，說(shuō)明高溫不改變細(xì)胞核HO-1蛋白表達(dá)，或者高溫不促進(jìn)HO-1蛋白在細(xì)胞核中累積。高溫環(huán)境影響巴馬香豬睪丸生精小管上皮組織HO-1蛋白表達(dá)，與對(duì)照組相比，高溫組睪丸生精上皮組織HO-1蛋白表達(dá)顯著升高(圖3E，P<0.05)。

2.4 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白細(xì)胞百分比的影響

由圖4可知，正常情況下，睪丸間質(zhì)和睪丸生精上皮細(xì)胞核都會(huì)陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白，與對(duì)照組相比，在高溫組豬睪丸間質(zhì)和睪丸生精上皮細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白細(xì)胞百分比顯著升高(圖4E，A1與B1，A2與B2之間差異顯著，P<0.05)，其中，睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白細(xì)胞百分比由8.5%升高至32.5%，升高2.8倍，高溫組睪丸生精上皮細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白細(xì)胞百分比由3.5%升高至29.8%，升高7.5倍，相比間質(zhì)細(xì)胞升高更為明顯。

睪丸組織Nrf2蛋白免疫組織化學(xué)染色：A.對(duì)照組；A1.對(duì)照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞染色；A2.對(duì)照組睪丸生精上皮染色；B.高溫組；B1.高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞染色；B2.高溫組睪丸生精上皮染色；→.Nrf2蛋白染色的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，紅色長(zhǎng)方形代表Nrf2在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，黃色長(zhǎng)方形代表Nrf2在睪丸生精上皮細(xì)胞表達(dá)，棕色為蛋白陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色為細(xì)胞核染色。ipp軟件增強(qiáng)睪丸組織Nrf2蛋白免疫組織化學(xué)染色為紅色：C.對(duì)照組；D.高溫組；E.ipp軟件分析對(duì)應(yīng)睪丸不同區(qū)域A1、A2、B1和B2的Nrf2蛋白染色的平均光密度。*.A1和B1、A2和B2，P<0.05。下同Immunohistochemical detection of Nrf2 in the thermal neutral group (A) and the heat-treated group (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of Nrf2 in testicular interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1)，and immunohistochemical detection of Nrf2 in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2). The immunohistochemical signal appears brown; the counterstained background appears blue. →.Stained interstitial cells. E.The quantitative evaluation of mean density of Nrf2 immunostaining in interstitial cells and seminiferous epithelium of the thermal neutral group (C) and the heat-treated group (D)，and Nrf2 immunostaining areas are highlighted in red colour. *.A1 and B1，A2and B2,P<0.05. The same as below

圖2 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of high ambient temperature on the testicular Nrf2 protein expression in Bama miniature pig

睪丸組織HO-1蛋白免疫組織化學(xué)染色：A.對(duì)照組；A1.對(duì)照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞染色；A2.對(duì)照組睪丸生精上皮染色；B.高溫組；B1.高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞染色；B2.高溫組睪丸生精上皮染色；→.HO-1蛋白染色的睪丸間質(zhì)細(xì)胞，紅色長(zhǎng)方形代表HO-1在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，黃色長(zhǎng)方形代表HO-1在睪丸生精上皮細(xì)胞表達(dá)，棕色為蛋白陽(yáng)性表達(dá)，藍(lán)色為細(xì)胞核染色。ipp軟件增強(qiáng)睪丸組織HO-1蛋白免疫組織化學(xué)染色為紅色：C.對(duì)照組；D.高溫組；E.ipp軟件分析對(duì)應(yīng)睪丸不同區(qū)域A1，A2，B1，B2的Nrf2蛋白染色的平均光密度Immunohistochemical detection of HO-1 in the thermal neutral group (A) and the heat-treated group (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of HO-1 in testicular interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1)，and immunohistochemical detection of HO-1 in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2). The immunohistochemical signal appears brown. The counterstained background appears blue. →, stained interstitial cells. E. The quantitative evaluation of mean density of HO-1 immunostaining in interstitial cells and seminiferous epithelium of the thermal neutral group (C) and the heat-treated group (D), and HO-1 immunostaining areas are highlighted in red colour

圖3 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effect of high ambient temperature on the testicular HO-1 protein expression in Bama miniature pig

睪丸組織細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞：A.對(duì)照組；A1.對(duì)照組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞；A2.對(duì)照組睪丸生精上皮細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞；B.高溫組；B1.高溫組睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞；B2.高溫組睪丸生精上皮細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞；→.睪丸間質(zhì)細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞；↑.生精上皮細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞；紅色長(zhǎng)方形代表c-caspase 3在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，黃色長(zhǎng)方形代表c-caspase 3在睪丸生精上皮細(xì)胞表達(dá)，棕色表示c-caspase 3蛋白陽(yáng)性表達(dá)。E.睪丸不同區(qū)域A1，A2，B1，B2的細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞百分比Percentage of cellswith c-caspase 3-positive nucleuses in the thermal neutral group and the heat-treated group. Sections of control (A) and heated testes (B). The red and yellow rectangles enlarged immunohistochemical detection of c-caspase 3-positive interstitial cells of the thermal neutral group (A1) and the heat-treated group (B1)，and immunohistochemical detection of c-caspase 3-positive germ cells in testicular seminiferous epithelium of the thermal neutral group (A2) and the heat-treated group (B2).→.c-caspase 3-positive interstitial cells；↑.c-caspase 3-positive germ cells；The positive cells appear brown in colour. E. The percentage of positive cells in the thermal neutral group and the heat-treated group

圖4 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞百分比的影響Fig.4 Effect of high ambient temperature on percentage of cells with the c-caspase 3-positive nucleuses in testes of Bama miniature pig

3 討 論

3.1 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬體表溫度和陰囊皮膚溫度分布影響

豬皮膚表面溫度受自身體溫和外界環(huán)境的雙重影響，一般距離體核較遠(yuǎn)，皮毛較少，散熱面積較大部位，變化較大。如果環(huán)境溫度高于體表溫度，機(jī)體蒸發(fā)散熱須排除體內(nèi)產(chǎn)熱和自然得熱，才能維持體溫正常，只有汗腺機(jī)能發(fā)達(dá)的靈長(zhǎng)類可以通過(guò)加強(qiáng)蒸發(fā)散熱維持體溫正常，一般家畜很難維持體溫恒定[11]。豬汗腺不發(fā)達(dá)，高溫環(huán)境主要通過(guò)加強(qiáng)呼吸道蒸發(fā)散熱維持體溫，如果高溫持續(xù)時(shí)間較久，便很難維持體溫恒定。余進(jìn)等[12]將中國(guó)實(shí)驗(yàn)用小型豬暴露于高于豬體表溫度40 ℃的環(huán)境溫度中，與暴露之前相比豬體表溫度和直腸溫度顯著升高，表現(xiàn)呼吸急促，排尿減少，喜飲水或滾臥糞尿。Li等[13]利用FLUKE TiR27紅外成像儀對(duì)高溫環(huán)境中小鼠的體表溫度和陰囊溫度測(cè)定發(fā)現(xiàn)，體表溫度和陰囊溫度顯著升高，同時(shí)直腸溫度也顯著升高。對(duì)夏季高溫期間公豬直腸溫度和陰囊皮膚溫度測(cè)定發(fā)現(xiàn)，當(dāng)環(huán)境溫度處于35 ℃時(shí)，公豬直腸溫度升高幅度接近1 ℃，陰囊皮膚溫度升高幅度接近3.5 ℃[14]。在本試驗(yàn)中，高溫組豬體表溫度和陰囊表面平均溫度顯著升高，陰囊皮膚溫度仍舊明顯低于體表皮膚溫度，但陰囊皮膚升高溫度幅度>體表溫度升高幅度。由于豬陰囊皮膚有豐富的汗腺，并且肉膜能在氣溫升高時(shí)變松弛使陰囊變薄，而豬皮膚汗腺退化，所以在高溫時(shí)陰囊皮膚較體表皮膚蒸發(fā)散熱更強(qiáng)，使得高溫組陰囊皮膚溫度仍低于體表溫度。同時(shí)，本試驗(yàn)也表明當(dāng)環(huán)境溫度高于一定值后，陰囊的熱調(diào)節(jié)功能達(dá)到極致，隨著體核溫度升高睪丸溫度也伴隨升高，陰囊皮膚溫度升高幅度變大。

3.2 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織Nrf2蛋白表達(dá)影響

抗氧化信號(hào)通路Nrf2/ARE (antioxidant responsive element, ARE)是機(jī)體抵抗內(nèi)外環(huán)境應(yīng)激的重要防御性轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一。細(xì)胞正常代謝時(shí)，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中含量處于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于環(huán)境應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞質(zhì)中的Nrf2轉(zhuǎn)位入核，使細(xì)胞核中Nrf2含量升高，增加其與核內(nèi)抗氧化應(yīng)答元件上GCTGAGTCA位點(diǎn)結(jié)合，提高ARE調(diào)控的多種解毒酶及抗氧化酶基因表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)環(huán)境應(yīng)激的抗性，進(jìn)而維持細(xì)胞和組織器官內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[15]。小鼠高溫環(huán)境熱應(yīng)激和小鼠陰囊水浴局部熱應(yīng)激都能夠顯著誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精上皮細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)，并促使睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)Nrf2蛋白轉(zhuǎn)位入核[13,16]。利用Western blot方法測(cè)定陰囊局部熱應(yīng)激小鼠睪丸細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中Nrf2蛋白表達(dá)發(fā)現(xiàn)，高溫可促使睪丸細(xì)胞中胞質(zhì)Nrf2向胞核中轉(zhuǎn)移累積的現(xiàn)象[17]。除此，很多體內(nèi)外研究也發(fā)現(xiàn)Nrf2蛋白不僅在睪丸間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，而且在應(yīng)對(duì)外界應(yīng)激導(dǎo)致的損傷以及維持間質(zhì)細(xì)胞睪酮分泌功能發(fā)揮重要作用[8,18]。本研究結(jié)果表明，環(huán)境高溫顯著增加豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞和生精上皮組織Nrf2蛋白表達(dá)，其中睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Nrf2表達(dá)更高，入核現(xiàn)象更明顯。由此可見(jiàn)，豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞可高效表達(dá)Nrf2蛋白，并且豬在受到高溫環(huán)境暴露時(shí)會(huì)有效激活睪丸間質(zhì)細(xì)胞中Nrf2蛋白通路，這可能在一定程度上維持了睪丸間質(zhì)細(xì)胞的正常功能，緩解高溫誘導(dǎo)的睪丸溫度升高對(duì)生精上皮造成的損傷。

3.3 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織HO-1蛋白表達(dá)影響

HO-1即熱休克蛋白32，能被各種引起細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷因素所誘導(dǎo)，包括高氧、缺氧、熱休克、內(nèi)毒素、過(guò)氧化氫、紫外線和重金屬等，其mRNA和蛋白質(zhì)在組織中的上調(diào)表達(dá)通常也被認(rèn)為是氧化應(yīng)激的標(biāo)志[7]。在細(xì)胞應(yīng)激發(fā)生時(shí)，HO-1作為血紅素降解的起始酶和限速酶能快速催化應(yīng)激誘導(dǎo)紅細(xì)胞破壞產(chǎn)生的血紅素，其催化產(chǎn)生的膽綠素、CO以及亞鐵作為體內(nèi)具有高活性的抗氧化成分，能高效清除細(xì)胞內(nèi)由應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧，維持細(xì)胞氧化還原平衡和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)，緩解血紅素毒性和細(xì)胞應(yīng)激，發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[19]。近年研究發(fā)現(xiàn)，睪丸間質(zhì)細(xì)胞受到環(huán)境應(yīng)激后，能夠通過(guò)上調(diào)HO-1的mRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)，緩解柴油機(jī)納米顆粒物等環(huán)境應(yīng)激引起的細(xì)胞凋亡或死亡[20-21]。HO-1可受許多上游信號(hào)激活，其中核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2是通過(guò)結(jié)合ARE序列激活HO-1啟動(dòng)子，啟動(dòng)HO-1 mRNA表達(dá)。因此，通過(guò)Nrf2/ARE信號(hào)通路上調(diào)HO-1表達(dá)也已成為近年研究者攻克細(xì)胞氧化應(yīng)激難題的首要選擇[22]。本研究結(jié)果表明，在睪丸組織中，環(huán)境高溫主要誘導(dǎo)睪丸間質(zhì)細(xì)胞中HO-1蛋白高水平表達(dá)，這說(shuō)明豬睪丸間質(zhì)細(xì)胞可高效表達(dá)HO-1蛋白，并通過(guò)啟動(dòng)HO-1蛋白表達(dá)，抵抗環(huán)境高溫引起的睪丸組織損傷。考慮到高溫同時(shí)誘導(dǎo)了睪丸間質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白入核，這表明高溫可能是通過(guò)激活Nrf2/ARE/HO-1信號(hào)通路間接上調(diào)HO-1表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用。

3.4 環(huán)境高溫對(duì)巴馬香豬睪丸組織細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)cleaved caspase 3蛋白細(xì)胞百分比影響

一般情況下，有絲分裂活動(dòng)旺盛的細(xì)胞，如癌細(xì)胞和生殖細(xì)胞，比體細(xì)胞更易受到熱應(yīng)激影響。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率和溫度之間存在一定關(guān)系，當(dāng)細(xì)胞溫度處于或高于42.5 ℃左右，大多數(shù)細(xì)胞存活率快速下降，對(duì)于生精細(xì)胞，溫度超過(guò)36.5 ℃時(shí)，會(huì)導(dǎo)致生精細(xì)胞凋亡，當(dāng)溫度超過(guò)43 ℃時(shí)，生精細(xì)胞則主要表現(xiàn)為壞死[23]。在體內(nèi)，熱誘導(dǎo)細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)在不同細(xì)胞的表現(xiàn)也不同，精母細(xì)胞和早期精子細(xì)胞，不具有熱耐受性，很容易出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，而支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞具有完善的抗氧化體系和較強(qiáng)的熱耐受性，對(duì)溫度的敏感性較低[24]。免疫組織化學(xué)染色方法測(cè)定熱應(yīng)激大白公豬睪丸組織中c-caspase 3蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)熱應(yīng)激處理會(huì)誘導(dǎo)公豬睪丸支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞c-caspase 3蛋白表達(dá)，并且大量生精細(xì)胞細(xì)胞核呈c-caspase 3蛋白陽(yáng)性著色[25]。本研究結(jié)果表明，環(huán)境高溫誘導(dǎo)豬睪丸間質(zhì)和睪丸生精上皮細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白，并且睪丸生精上皮細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)c-caspase 3蛋白的細(xì)胞百分比升高幅度更為明顯，這說(shuō)明環(huán)境高溫可誘導(dǎo)公豬睪丸組織細(xì)胞凋亡。由于生精細(xì)胞熱耐受性較間質(zhì)細(xì)胞弱，因此睪丸生精上皮細(xì)胞比睪丸間質(zhì)細(xì)胞對(duì)高溫反應(yīng)更加敏感，出現(xiàn)凋亡的比例也更多。

4 結(jié) 論

本研究表明，豬睪丸組織間質(zhì)細(xì)胞和生精上皮細(xì)胞可表達(dá)Nrf2蛋白和HO-1蛋白。環(huán)境高溫可促進(jìn)睪丸間質(zhì)細(xì)胞Nrf2蛋白入核，并且高效表達(dá)HO-1蛋白。環(huán)境高溫會(huì)誘導(dǎo)公豬睪丸組織細(xì)胞凋亡，其中生精上皮細(xì)胞比睪丸間質(zhì)細(xì)胞對(duì)高溫更加敏感，出現(xiàn)凋亡比例更多，這可能是由于環(huán)境溫度超過(guò)了陰囊的最大熱調(diào)節(jié)功能范圍，隨著體核溫度升高睪丸溫度也伴隨升高，進(jìn)而引起細(xì)胞應(yīng)激損傷，最終導(dǎo)致豬睪丸組織細(xì)胞凋亡增加。同時(shí)，激活的Nrf2信號(hào)通路和高效表達(dá)的HO-1蛋白，是豬睪丸組織通過(guò)體內(nèi)分子途徑緩解高溫環(huán)境誘導(dǎo)損傷的有效措施，也給體內(nèi)尋找解決熱應(yīng)激導(dǎo)致公豬精液品質(zhì)下降難題，提供潛在的有效分子靶點(diǎn)。

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