可控表達(dá)pGH基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立與分析

張建斌，劉 穎，白立景，4，牟玉蓮，韓俊文(1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，太谷 00801； 2.天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 0084； .中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 10019； 4.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院深圳農(nóng)業(yè)基因組研究所，深圳 518120)

豬生長(zhǎng)激素(porcine growth hormone, pGH)是豬垂體前葉分泌的調(diào)節(jié)機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育、由190個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽類激素，生長(zhǎng)激素在體內(nèi)呈脈沖式分泌，具有廣泛的調(diào)節(jié)生長(zhǎng)的生理功能，它能夠影響體內(nèi)幾乎所有的組織類型和細(xì)胞，包括免疫組織、腦組織及造血系統(tǒng)[1-5]。在機(jī)體的生長(zhǎng)軸中，生長(zhǎng)激素是調(diào)控動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育的核心，其作用方式類似于胰島素和甲狀腺激素，能明顯促進(jìn)骨、軟骨及其他組織生長(zhǎng)，刺激蛋白質(zhì)與膠原的合成，促進(jìn)組織細(xì)胞對(duì)循環(huán)氨基酸的攝取與利用[3,5]。在生命過(guò)程中，生長(zhǎng)激素的急劇減少與衰老有關(guān)，同時(shí)伴隨骨和肌肉密度的減少和脂肪組織的增加[6]。由于生長(zhǎng)激素在醫(yī)學(xué)、畜牧生產(chǎn)和漁業(yè)生產(chǎn)中的重要作用，研究者很早就開(kāi)始了對(duì)其基因結(jié)構(gòu)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究，其cDNA 序列在人、大鼠、小鼠、雞、鴨、火雞、大馬哈魚(yú)、鯉魚(yú)中相繼被測(cè)定。目前為止，由各種各樣異源啟動(dòng)子啟動(dòng)生長(zhǎng)激素過(guò)表達(dá)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物均表現(xiàn)出生長(zhǎng)速度明顯加快，但是同時(shí)也能觀察到由于長(zhǎng)期處于該激素高表達(dá)壓力下，機(jī)體表現(xiàn)出繁殖障礙、關(guān)節(jié)炎、器官受損、免疫機(jī)能失調(diào)等不良反應(yīng)[7-11]。

基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)是現(xiàn)代分子生物學(xué)研究的重要手段，也是近年來(lái)開(kāi)展轉(zhuǎn)基因研究，成功制備各種轉(zhuǎn)基因動(dòng)、植物的理論基礎(chǔ)，基因的可控表達(dá)已成為研究熱點(diǎn)[12]。利用ZFN、TALEN與CRISPR/Cas9技術(shù)，我國(guó)在基因組編輯豬、牛、羊方面研究進(jìn)展迅速。中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所利用ZFN技術(shù)成功制備并培育出具有“雙肌”表型的MSTN雙等位基因編輯梅山豬新種群。目前該MSTN基因編輯豬已經(jīng)獲準(zhǔn)進(jìn)入農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)的環(huán)境釋放階段[13]。同時(shí)，該團(tuán)隊(duì)改造了Tet-on調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)外源GH基因表達(dá)的安全、可控，并通過(guò)該系統(tǒng)制備了可控表達(dá)外源GH的轉(zhuǎn)基因豬[14]。此外，多重轉(zhuǎn)基因技術(shù)在生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究上優(yōu)于單基因技術(shù)，利用多重轉(zhuǎn)基因技術(shù)我國(guó)獲得了轉(zhuǎn)11βHSD1-CHOP-hIAPP三基因豬[15-16]。目前存在的調(diào)控系統(tǒng)很多, 其中研究較多、應(yīng)用最為廣泛的是四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)(簡(jiǎn)稱Tet調(diào)控系統(tǒng))[17-18]。Tet 調(diào)控基因表達(dá)系統(tǒng)的建立是以大腸桿菌 Tn10 特異的抗性操縱子 (resistance operon)為基礎(chǔ)，通過(guò)誘導(dǎo)底物四環(huán)素(teTc)及其衍生物強(qiáng)力霉素(doxycycline，DOX)的添加來(lái)調(diào)控基因表達(dá)，該誘導(dǎo)系統(tǒng)有著誘導(dǎo)效率高、毒性低、條件范圍寬等優(yōu)點(diǎn)，在目前動(dòng)、植物轉(zhuǎn)基因研究中有著廣泛的應(yīng)用[19-21]。

本研究為實(shí)現(xiàn)豬生長(zhǎng)激素基因(pGH)在小鼠體內(nèi)特定時(shí)間表達(dá)，利用課題組前期成功構(gòu)建并在PK15細(xì)胞系中驗(yàn)證的整合型誘導(dǎo)表達(dá)pGH四環(huán)素(Tet-on)載體系統(tǒng)獲得可控表達(dá)豬生長(zhǎng)激素的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。利用 PCR和 Southern blot 技術(shù)進(jìn)行整合檢測(cè)，篩選轉(zhuǎn)基因小鼠。對(duì)3～10周齡轉(zhuǎn)基因小鼠及對(duì)照組小鼠進(jìn)行強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)試驗(yàn)，利用RT-qPCR技術(shù)檢測(cè)外源基因表達(dá)水平；利用放射性免疫檢測(cè)方法對(duì)小鼠血液中pGH水平進(jìn)行定量檢測(cè)；同時(shí)稱重，評(píng)估轉(zhuǎn)入基因?qū)π∈髾C(jī)體表型的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及試劑盒

地高辛DNA標(biāo)記試劑盒及Southern blot檢測(cè)試劑盒購(gòu)自深圳萊伯克公司；定量檢測(cè)試劑SYBR?Premix Ex TaqTM購(gòu)自大連寶生物公司；內(nèi)切酶Hind Ⅲ、AhdⅠ、Ssp購(gòu)自MBI公司；Ex-Tag E購(gòu)自大連寶生物公司；TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；總RNA提取試劑盒購(gòu)自Bioteck公司；DL100、DL1000 Marker購(gòu)自TRANS gen公司；凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；SYBR Green I 購(gòu)自Molecular Probes公司；QIAGEN純化試劑盒，TOYOBO反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TOYOBO公司；Tris-飽和酚、氯仿、無(wú)水乙醇、異丙醇、氯化鈉等均為國(guó)產(chǎn)分析純；強(qiáng)力霉素(DOX)購(gòu)自Clone tech公司。

1.2 轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

將前期成功構(gòu)建并在PK15細(xì)胞表達(dá)驗(yàn)證準(zhǔn)確的pTTGH載體用限制性內(nèi)切酶AhdⅠ及Ssp雙酶切[22-23]，凝膠電泳回收9.2 kb大片段，純化后的 pTTGH 質(zhì)粒用TE稀釋到終濃度為2～5 ng·μL-1通過(guò)顯微注射到C57小鼠受精卵中，將受精卵重新植入假孕母鼠輸卵管中，原核顯微注射轉(zhuǎn)基因小鼠的制備由北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心完成。

1.3 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠制備

將原核顯微注射獲得的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性公鼠分別于8、9、10周齡與正常性成熟母鼠交配，每周與3只正常母鼠合籠1周；將原核顯微注射獲得的轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性母鼠于8周齡開(kāi)始與正常公鼠交配，產(chǎn)生的仔鼠定義為F1代小鼠。

1.4 F1代小鼠基因整合檢測(cè)

通過(guò)PCR反應(yīng)初步鑒定胚胎移植后出生的C57小鼠及其F1代，取10日齡小鼠尾尖，用組織DNA提取試劑盒提取DNA 后以此為模板，擴(kuò)增rtTA和pGH基因(表1)，進(jìn)行小鼠外源基因檢測(cè)。對(duì)經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)為陽(yáng)性小鼠，再次提取高濃度基因組，進(jìn)行rtTA和pGH基因Southern blot雜交檢測(cè)。

表1鑒定轉(zhuǎn)基因小鼠的引物信息

Table1Primersequenceinformationusedtoidentifytransgenicmice

項(xiàng)目Item引物代號(hào)Primercode引物序列(5′→3′)Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductslengthPCRrtTA?1FCATTCCGCTGTGCTCTCCTCTC459rtTA?1RGAGCGTCAGCAGGCAGCATATCPCRrtTA?2FTACACTGGGCTGCGTATTGGAG250rtTA?2RATCGGCTGGGAGCATGTCTAAGSouthernprobe/rtTA?RTF1CTGTGCTCTCCTCTCACATC234RT?qPCRrtTA?RTR1GAATCGGTGGTAGGTGTCTCSouthernprobe/pGH?FCACCAACCTTGGGCTTTGGG280RT?qPCRpGH?RCACGGCGTTGGCAAATAGGCMouseβ?actinβ?actin?RTF1GGTGGGAATGGGTCAGAAG305β?actin?RTR1CAGAGGCATACAGGGACAG

1.5 F1代小鼠rtTA 和 pGH 基因表達(dá)檢測(cè)

將經(jīng)過(guò)PCR、Southern blot 檢測(cè)為陽(yáng)性的F1代轉(zhuǎn)基因小鼠統(tǒng)計(jì)，提取尾組織，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織總RNA。根據(jù)TOYOBO 的RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit使用說(shuō)明書(shū)完成總RNA第一鏈的合成，以此cDNA為模板，梯度稀釋模板，驗(yàn)證選定最佳模板濃度，以小鼠β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)試劑盒SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ使用說(shuō)明書(shū)，利用Real-time PCR測(cè)定rtTA和pGH表達(dá)活性。按照ABI定量試劑說(shuō)明書(shū)上樣，利用7500 System SDS Software V 1.4.0，根據(jù)2-ΔΔCT方法，對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6 F1代小鼠誘導(dǎo)試驗(yàn)及生長(zhǎng)性能測(cè)定

將F1代轉(zhuǎn)基因小鼠分為3組，每組14只(公母各半)，進(jìn)行強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)試驗(yàn)及體重表型鑒定。誘導(dǎo)分組：轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)組、轉(zhuǎn)基因小鼠非誘導(dǎo)組、同日齡同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組。誘導(dǎo)條件：2 g·L-1強(qiáng)力霉素， 2.5 g·L-1糖精，飲水供給。誘導(dǎo)時(shí)間：3～10周齡。誘導(dǎo)時(shí)段內(nèi)每周同一時(shí)間對(duì)所有試驗(yàn)組及對(duì)照組小鼠稱重，同時(shí)觀察小鼠的健康狀況。

1.7 F1代小鼠血清中外源GH放免測(cè)定

誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)誘導(dǎo)組和對(duì)照組小鼠采用眼腔靜脈采血法收集血液，4 ℃ 1 000 r·min-1離心1 h，取上清-80 ℃保存。購(gòu)買美國(guó)Linco 公司放免試劑盒(Cat：pGH-46HK)對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠血清樣品進(jìn)行pGH定量測(cè)定。放免操作委托北京中同藍(lán)博臨床檢驗(yàn)所完成。

1.8 試驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境

C57小鼠在本實(shí)驗(yàn)室SPF級(jí)鼠房飼養(yǎng)。溫度(25±1) ℃，相對(duì)濕度(70±4)%，蘇州市蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)備廠制造蘇杭智能獨(dú)立送回風(fēng)凈化籠系統(tǒng)，飼養(yǎng)密度≤5只·籠-1。籠具、墊料、飲水均高壓滅菌處理，從北京協(xié)和醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心購(gòu)買真空包裝飼料。2周更換鼠籠1次，小鼠自由采食、飲水，自動(dòng)光控(12 h明/12 h暗)。

試驗(yàn)小鼠的使用符合動(dòng)物保護(hù)、動(dòng)物福利和倫理原則，符合國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理相關(guān)規(guī)定，并通過(guò)中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 EXCEL 2010 軟件初步整理，用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析，并用LSD法進(jìn)行多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來(lái)表示，以P<0.05作為差異顯著的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 原核顯微注射質(zhì)?；虻拿盖泻图兓?/h3>

將pTTGH載體用限制性內(nèi)切酶AhdⅠ及Ssp雙酶切，回收9.2 kb大片段，用于顯微注射轉(zhuǎn)基因小鼠的制備，載體結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 載體結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Figure of the vector structure

2.2 F1代小鼠rtTA 和 pGH 基因的PCR鑒定

將2.1中pTTGH載體顯微注射到C57小鼠的受精卵中，并移植到代孕母鼠中。代孕母鼠共產(chǎn)下22只Founder鼠，提取22只小鼠基因組DNA，通過(guò)PCR-GH-F、PCR-GH-R和PCR-rtTA-1F、PCR-rtTA-1R基因特異性引物，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，可見(jiàn)GH基因整合鼠PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為280 bp，rtTA基因整合鼠PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為459 bp，與預(yù)期的片段大小基本一致(圖2)。經(jīng)PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，有4只 為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性個(gè)體(♂：T34和T63，♀：T43和T81)。21日齡將轉(zhuǎn)基因Founder鼠公母分開(kāi)，單獨(dú)飼養(yǎng)，除去♂T63不育, ♀T81不孕外，待8周齡性成熟時(shí)開(kāi)始與正常的C57小鼠交配，擴(kuò)繁建系，F(xiàn)1代 小鼠21日齡斷奶。取10日齡小鼠尾組織，提取基因組DNA，檢測(cè)rtTA、GH基因整合情況。

2.3 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠Southern blot檢測(cè)

將經(jīng)過(guò)PCR鑒定的粗篩陽(yáng)性鼠進(jìn)一步做Southern blot鑒定。提取尾組織基因組DNA 20 μg，EcoR Ⅰ酶切過(guò)夜，45 v電泳10 h，轉(zhuǎn)移到Hybond-N+尼龍膜上，進(jìn)行Southern 雜交。以同窩非轉(zhuǎn)基因鼠為陰性對(duì)照，pTTGHEcoRⅠ 酶切質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照，雜交探針?lè)謩e設(shè)計(jì)在rtTA和GH片段上。結(jié)果顯示，35只小鼠與PCR檢測(cè)結(jié)果一致，外源rtTA、GH基因雜交帶型一致(圖3)。

2.4 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠表達(dá)檢測(cè)

F1代轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)束后，提取誘導(dǎo)組和對(duì)照組尾尖組織總RNA,選用β-actin基因做內(nèi)參，通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)后代轉(zhuǎn)基因小鼠中rtTA、GH基因的表達(dá)情況， 篩選rtTA和GH基因能同時(shí)高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠留種做下游試驗(yàn)(圖4)。

2.5 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠的誘導(dǎo)試驗(yàn)

將F1代小鼠分為3組，每組14只(公母各半)，進(jìn)行強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)試驗(yàn)及體重表型鑒定。誘導(dǎo)分組：轉(zhuǎn)基因小鼠誘導(dǎo)組(DOX-TM)、轉(zhuǎn)基因小鼠非誘導(dǎo)組(NO-DOX-TM)、同日齡同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠對(duì)照組(Control)。誘導(dǎo)條件：2 g·L-1強(qiáng)力霉素， 2.5 g·L-1糖精，飲水供給。誘導(dǎo)時(shí)間：3～10周齡。誘導(dǎo)時(shí)段內(nèi)每周同一時(shí)間稱1次體重。結(jié)果顯示，飲水中加入誘導(dǎo)藥物DOX之后，誘導(dǎo)組轉(zhuǎn)基因小鼠體重在誘導(dǎo)期內(nèi)持續(xù)增加，生長(zhǎng)速度顯著高于轉(zhuǎn)基因小鼠無(wú)藥物誘導(dǎo)組和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ战M(P<0.05，圖5)。

M.DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；-.陰性對(duì)照；+.陽(yáng)性對(duì)照;數(shù)字.動(dòng)物個(gè)體，圖3同M.DL1000 DNA marker; -.Negative control; +.Positive control; Number. Animal number, the same as Figure3

圖2 轉(zhuǎn)基因小鼠pGH基因和rtTA基因PCR鑒定Fig.2 PCR results of pGH and rtTA genes of transgenic mice

圖3 Southern blot 鑒定轉(zhuǎn)基因鼠Fig.3 Southern blot analysis of transgenic mouse

A. rtTA基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果；B. GH基因表達(dá)檢測(cè)結(jié)果。*. 代表差異顯著(P<0.05)，下同A. rtTA gene expression results; B.GH gene expression results. *. Means significant difference between treatments(P<0.05), the same as below

圖4 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠基因表達(dá)檢測(cè)Fig.4 RT-qPCR analysis of rtTA and GH genes expression of F1 transgenic mice

圖5 轉(zhuǎn)基因小鼠強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)后體重表型變化Fig.5 Body weight variation of transgenic mice after supplying DOX by water

2.6 F1代轉(zhuǎn)基因小鼠血清中外源GH放免測(cè)定

為進(jìn)一步檢測(cè)轉(zhuǎn)基因小鼠基因組中整合pGH基因是否能夠正常發(fā)揮生理學(xué)功能，用放免法檢測(cè)F1代轉(zhuǎn)基因小鼠和對(duì)照組小鼠血清樣本中pGH水平。誘導(dǎo)試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)誘導(dǎo)組和對(duì)照組小鼠采用眼腔靜脈采血法收集血液。將收集到的血清樣品-80 ℃ 低溫保存送至北京中同藍(lán)博臨床檢驗(yàn)所統(tǒng)一檢測(cè)。結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組轉(zhuǎn)基因組小鼠血清中pGH水平顯著高于對(duì)照組小鼠 (P<0.05，圖6)。

圖6 放免法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因與同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠血清中pGH 含量Fig.6 The concentration of pGH in the serum of transgenic and non-transgenic mice

3 討 論

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物是以分子遺傳學(xué)和試驗(yàn)胚胎學(xué)為基礎(chǔ)發(fā)展起來(lái)的生物新技術(shù)，是在分子水平對(duì)發(fā)育生物學(xué)進(jìn)行深入研究的重要手段。自Palmiter等[24]的超級(jí)小鼠試驗(yàn)成功后，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究就沒(méi)有中斷過(guò)，到目前為止，世界各國(guó)的優(yōu)秀科學(xué)家已經(jīng)培育出多種具有優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、抗逆等優(yōu)良品質(zhì)的動(dòng)物新品系。通過(guò)原核顯微注射等基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，將各種不同來(lái)源的生長(zhǎng)激素基因?qū)氲叫∈?、大鼠、兔、羊、牛、豬基因組內(nèi)，培育出了除體重增大外攜帶其他各種表型的轉(zhuǎn)基因模型，研究結(jié)果顯示，這些外源基因不僅可以整合到轉(zhuǎn)基因動(dòng)物染色體中，而且有相當(dāng)一部分還可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)并發(fā)揮出生物學(xué)效應(yīng)[25-30]。生長(zhǎng)激素可以通過(guò)刺激結(jié)締組織、肌肉和骨骼的生長(zhǎng)發(fā)育而促進(jìn)機(jī)體生長(zhǎng)，Palmiter等[24]和Mathews等[31]考慮到生長(zhǎng)激素蛋白產(chǎn)物所具有的多種生物學(xué)效應(yīng)，把MT-I啟動(dòng)子與大鼠和人的生長(zhǎng)激素基因融合，分別導(dǎo)入小鼠受精卵。結(jié)果顯示，兩種結(jié)構(gòu)形式的基因都分別在轉(zhuǎn)基因鼠體內(nèi)得到了整合和有效的調(diào)控表達(dá)而培育出“超級(jí)鼠”。該試驗(yàn)成功開(kāi)辟了生長(zhǎng)激素結(jié)構(gòu)與功能、表達(dá)與調(diào)控研究的新紀(jì)元，并通過(guò)生長(zhǎng)激素為其它真核基因在機(jī)體發(fā)育中的時(shí)空調(diào)控提供了良好模式。

已有文獻(xiàn)報(bào)道了成功轉(zhuǎn)入GH基因的動(dòng)物，大部分都是全身過(guò)表達(dá)GH基因，而且外源GH基因從胚胎期到成年都持續(xù)發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，其機(jī)體發(fā)育的異常很可能和GH在全身多個(gè)組織器官中的自分泌異常有關(guān)，這也和臨床上發(fā)現(xiàn)的GH分泌失常引發(fā)動(dòng)物機(jī)體疾病、癌癥等病理現(xiàn)象相似[32-35]。本試驗(yàn)首先將四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)中兩個(gè)載體核心元件整合到 pCAGGS一個(gè)載體上，并在前期的細(xì)胞水平試驗(yàn)中證明了培養(yǎng)液中添加不同濃度誘導(dǎo)底物強(qiáng)力霉素(DOX)誘導(dǎo)外源基因表達(dá)的效率不同[22-23]。本研究利用整合型可控表達(dá)GH載體系統(tǒng)制備了轉(zhuǎn)基因小鼠模型，通過(guò)在飲水中添加強(qiáng)力霉素(DOX) 研究 GH對(duì)機(jī)體作用的時(shí)效、量效關(guān)系，有望大大減少生長(zhǎng)激素長(zhǎng)期過(guò)高表達(dá)給機(jī)體帶來(lái)的負(fù)面影響。

本研究中，目的基因GH是對(duì)動(dòng)物機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育極為重要的基因，本課題組前期的研究結(jié)果表明，制備轉(zhuǎn)GH基因動(dòng)物可以用于提高動(dòng)物的生長(zhǎng)速度、減少飼喂成本，同時(shí)還有助于研究GH基因功能，通過(guò)控制GH基因的表達(dá)有助于了解傳統(tǒng)過(guò)表達(dá)GH方法制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物常出現(xiàn)的一些發(fā)育異?，F(xiàn)象，本課題后續(xù)通過(guò)控制GH的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)量來(lái)減少GH過(guò)早表達(dá)產(chǎn)生的副作用，大大提高了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的存活率，也有助于研究GH對(duì)機(jī)體發(fā)育的影響。

本研究利用原核顯微注射法制備出可控表達(dá)GH基因的轉(zhuǎn)基因小鼠，通過(guò)飲水中添加誘導(dǎo)底物強(qiáng)力霉素(DOX) 以后，轉(zhuǎn)基因小鼠的體重與同窩非轉(zhuǎn)基因小鼠相比明顯增大，血清中pGH水平明顯上升，說(shuō)明外源GH可以正常表達(dá)并通過(guò)機(jī)體生長(zhǎng)軸發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠和正常鼠交配后能夠穩(wěn)定產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代小鼠，F(xiàn)1代至F3代獲得的小鼠，外源基因經(jīng)PCR和Southern blot檢測(cè)，F(xiàn)1代整合效率48%(35/73)，F(xiàn)2代整合效率51%(45/88)，F(xiàn)3代整合效率49%(50/102),在后代的擴(kuò)繁培育中外源基因的遺傳遵循孟德?tīng)栠z傳規(guī)律。本研究構(gòu)建的整合型誘導(dǎo)表達(dá)載體在能達(dá)到研究目的前提下大大簡(jiǎn)化了試驗(yàn)流程、提高了研究效率。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果提示，可控表達(dá)pGH基因轉(zhuǎn)基因小鼠模型的建立有助于深入研究GH對(duì)機(jī)體發(fā)育的影響以及機(jī)體中影響GH分泌的分子機(jī)制和信號(hào)通路，促進(jìn)GH在家畜生產(chǎn)中的應(yīng)用，也為制備安全、高效的GH轉(zhuǎn)基因大家畜奠定理論基礎(chǔ)。

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