VEGF對(duì)體外培養(yǎng)絨山羊次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的影響

張婧婧，王德光，周小兵，高 曄，何曉琳，陳玉林，張恩平(西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，楊凌 712100)

毛囊是哺乳動(dòng)物皮膚中普遍存在的衍生器官[1]，由毛球、連接組織鞘、外根鞘、內(nèi)根鞘和毛干等部分構(gòu)成，并始終發(fā)生著周期性的變化：生長(zhǎng)期、退行期和休止期[2]。毛囊中大約包含20多種細(xì)胞，這些細(xì)胞在體內(nèi)通過(guò)復(fù)雜的相互作用，共同參與毛囊生長(zhǎng)、發(fā)育、分化與周期性調(diào)節(jié)[3]。外根鞘(outer root sheat, ORS)由厚的細(xì)胞層組成，包裹在內(nèi)根鞘和毛干的外側(cè)，成為毛囊與真皮層的分界線[4]。外根鞘細(xì)胞(outer root sheath cells, ORSCs)是成熟毛囊在分化過(guò)程中幸存下來(lái)的，形態(tài)學(xué)上類似于上皮的角質(zhì)化細(xì)胞[5]，在毛囊周期、毛發(fā)生長(zhǎng)和創(chuàng)傷愈合期間起重要的作用[6]。生長(zhǎng)期階段，外根鞘細(xì)胞可以產(chǎn)生終止生長(zhǎng)期的信號(hào)并使得毛囊進(jìn)入退行期[5]；皮膚損傷時(shí)，外根鞘細(xì)胞會(huì)分化形成上皮細(xì)胞[7]。

血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)是一類多功能的細(xì)胞因子，可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖、促進(jìn)血管生成以及增加血管的通透性[8]，并在創(chuàng)傷愈合、胚胎發(fā)育、視網(wǎng)膜血管新生風(fēng)濕性關(guān)節(jié)以及腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中都起重要的作用[9]。近些年研究發(fā)現(xiàn)，VEGF在毛囊中表達(dá)并作用于毛囊。Yano等[10]以轉(zhuǎn)基因小鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ停^(guò)表達(dá)毛囊外根鞘中的VEGF，發(fā)現(xiàn)相同時(shí)間內(nèi)VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠比野生型小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)快，同時(shí)通過(guò)石蠟切片組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠的毛囊更密更大。Wu等[11]利用MTT法檢測(cè)外根鞘細(xì)胞的增殖，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)液中添加VEGF可以促進(jìn)人毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)基因是鑒定體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖的一個(gè)基因，是細(xì)胞增殖的特異性標(biāo)記；角蛋白10(keratin 10，K10)是細(xì)胞分化的特異性標(biāo)記。PCNA和K10均在外根鞘細(xì)胞中特異性表達(dá)。成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5(fibroblast growth factor 5，F(xiàn)GF5)與哺乳動(dòng)物毛發(fā)生長(zhǎng)密切相關(guān)。本試驗(yàn)以體外培養(yǎng)的絨山羊次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞為對(duì)象，研究培養(yǎng)液中添加VEGF對(duì)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖、分化及PCNA、K10和FGF5基因表達(dá)量的影響，為進(jìn)一步研究絨山羊次級(jí)毛囊發(fā)育機(jī)制提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣品采集

選取臨床健康的雌性成年陜北白絨山羊(陜西省陜北白絨山羊原種場(chǎng)，榆林市橫山縣)，采取體側(cè)部約0.5 cm×2.0 cm的皮膚樣品，置于無(wú)菌PBS中，4 ℃條件下帶回實(shí)驗(yàn)室。

1.2 主要試劑及其配制

EpiLife Medium with 60 μmol·L-1calcium, HKGS, Coating Matrix, 胎牛血清, 0.25%胰蛋白酶(g·dL-1), 1×PBS粉末(Gibco, 美國(guó))；DispaseII(Roche, 瑞士)；雙抗(青霉素、鏈霉素, HyClone，美國(guó))；DMSO、VEGF、MTT粉末(Sigma, 美國(guó))；Cell-LightTMEdU Apollo?488invitroImaging Kit(100T)(RiboBio，廣州)；純RNA提取試劑盒(Ultrapure RNA Kit北京康為世紀(jì)公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)及熒光定量試劑盒(TaKaRa，日本)。

0.25%中性蛋白酶消化液(dispase II)：使用前，0.25 g DispaseII粉末溶于100 mL無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液中，充分溶解混勻后，過(guò)濾除菌。

PBS：1×PBS粉末溶解于1 L的去離子水中，加入1 mL雙抗(100 IU)，過(guò)濾除菌，分裝保存。

MTT液：稱取0.5 g MTT粉末，充分溶解于100 mL PBS中，過(guò)濾除菌，-20 ℃保存。

細(xì)胞培養(yǎng)液： EpiLifeTM培養(yǎng)基 90 mL添加HKGS(包含0.2%BPE(v/v)，5 μg·mL-1牛胰島素，0.18 μg·mL-1氫化可的松，5 μg·mL-1牛轉(zhuǎn)鐵蛋白, 0.2 ng·mL-1人表皮生長(zhǎng)因子) 0.9 mL、胎牛血清9 mL，雙抗(100 IU·mL-1)0.1 mL，總體積為100 mL。

1.3 樣品處理

將置于無(wú)菌PBS中的皮膚樣品帶入細(xì)胞操作間，用75%的酒精浸泡進(jìn)行樣品表面滅菌，無(wú)菌PBS液沖洗4～5次，在體視鏡下將樣品切成寬度為0.2 cm左右的皮膚組織片、浸泡在無(wú)菌0.25% dispaseII中，4 ℃消化4.5 h，在PBS液中清洗2～3次。消化結(jié)束的樣品在體視鏡下，用眼科鑷子順毛囊方向?qū)⒚覄冸x出來(lái)，此時(shí)的毛囊無(wú)真皮鞘。

1.4 原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)與純化

將剝離的毛囊分離初級(jí)和次級(jí)毛囊,分別放入2 mL離心管中，加入300～400 μL的0.25%胰蛋白酶溶液消化20～25 min，消化過(guò)程中可在顯微鏡下觀察消化情況；消化結(jié)束時(shí)，加入含有血清的培養(yǎng)液終止消化，吹打10～15次；去除多余的毛囊，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清；加入新的培養(yǎng)液1 mL重懸細(xì)胞，移入預(yù)先鋪有Coating Matrix的培養(yǎng)皿中，再加入1 mL培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4～5 d，發(fā)現(xiàn)有貼壁細(xì)胞后，更換培養(yǎng)液，之后每2～3 d更換1次培養(yǎng)液。

當(dāng)原代細(xì)胞生長(zhǎng)匯合時(shí)，進(jìn)行傳代。首先棄舊培養(yǎng)液，PBS清洗兩次，加入適量0.25%胰蛋白酶，處理細(xì)胞數(shù)十秒，棄胰酶液體，然后加入1 mL新的0.25%胰蛋白酶(g·dL-1)消化3～4 min，含血清培養(yǎng)液終止消化，并吹打成細(xì)胞懸液，移入2 mL離心管中，1 000 r·min-1離心5 min，收集細(xì)胞，加入新的培養(yǎng)皿中，每2～3 d更換1次培養(yǎng)液。前3代細(xì)胞傳代時(shí)，新的培養(yǎng)皿中都需要預(yù)先鋪好涂層培養(yǎng)基(coating matrix)。

在原代細(xì)胞和初次傳代細(xì)胞貼壁后，采用細(xì)胞時(shí)間差酶消化法純化。

1.5 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

收集第5代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為0.5×104·mL-1，將細(xì)胞懸液接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1 mL。每隔24 h,取3個(gè)孔的細(xì)胞分別進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，每隔24 h的細(xì)胞數(shù)平均值為縱坐標(biāo)作圖，即得次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。

1.6 毛囊外根鞘細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定

對(duì)絨山羊毛囊外根鞘細(xì)胞采用鏡下觀察和選用CK17、CK15進(jìn)行免疫熒光染色鑒定。免疫熒光染色步驟參考文獻(xiàn)[12]，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄。

建筑施工行業(yè)是一個(gè)勞動(dòng)密集型的產(chǎn)業(yè)，機(jī)械化水平較低，施工過(guò)程中需要依靠大量的工人參與手工作業(yè)，無(wú)法像工廠一樣大規(guī)模生產(chǎn)出標(biāo)準(zhǔn)化的產(chǎn)品，不可避免地會(huì)產(chǎn)生一些缺陷或偏差。

1.7 次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的活性檢測(cè)

選擇第5代次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞，使96孔板中每孔的細(xì)胞密度為3×104·mL-1，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%,加入不同質(zhì)量濃度VEGF(0、1、10、50和100 ng·mL-1)的培養(yǎng)液，其中0 ng·mL-1為對(duì)照組，每個(gè)濃度分別處理24和48 h后，每孔加入20 μL的MTT (5 mg·mL-1)，于28 ℃、5%CO2條件下，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄培養(yǎng)液，用PBS洗1次，每孔加入150 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，28 ℃孵育10 min，溶解細(xì)胞中的甲臢。使用酶標(biāo)儀于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，每組6個(gè)重復(fù)。

1.8 次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖檢測(cè)

選擇第5代次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞，使96孔板中每孔的細(xì)胞密度為3×104·mL-1，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%后，加入不同質(zhì)量濃度VEGF(0、1、10、50和100 ng·mL-1)的培養(yǎng)液，其中0 ng·mL-1為對(duì)照組，每個(gè)濃度處理48 h后，每孔加入100 μL的EdU培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，進(jìn)行Apollo染色和Hoechst33342染色。使用熒光顯微鏡觀察并記錄，每個(gè)孔隨機(jī)選擇5個(gè)視野拍照。

1.9 次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中與增殖和分化相關(guān)基因mRNA表達(dá)的檢測(cè)

選擇第5代次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞，使96孔板中每孔的細(xì)胞密度為3×105·mL-1，待細(xì)胞長(zhǎng)至70%～80%后，加入不同質(zhì)量濃度VEGF(0、10、100 ng·mL-1)，其中0 ng·mL-1為對(duì)照組，每個(gè)濃度分別處理24和48 h，根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80 ℃保存。

以NCBI上山羊β-actin作為內(nèi)標(biāo)基因，同時(shí)參照山羊PCNA、K10、FGF5 mRNA的 CDS區(qū)序列，使用Primier 5.0軟件設(shè)計(jì)跨內(nèi)含子的特異性引物(表1)，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

表1實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

Table1PrimersequencesforReal-timequantitativePCR

基因Gene基因登錄號(hào)GenBankID引物序列(5′→3′)Primersequence產(chǎn)物長(zhǎng)度/bpProductlengthβ?actinXM＿005694067．1S：TGCGTGACATCAAGGAGAAGC198A：GGATGCCACAGGACTCCATACCCPCNAXM＿005688167S：CAGGCGTTCGTAATCGTG298A：TCGCAGCGGTAAGTGTCGK10XM＿013972064S：GTTCGATACAGCTCAAGCAAGCAA159A：AGCAGAGCTCCCACGGCTAAFGF5EF042192．1S：CAGAGTGGGCATCGGTTTC121A：TATTCCTACAATCCCCTGAGACA

S.上游引物；A.下游引物

S. Sense primer；A. Antisense primer

采用TaKaRa公司的熒光染料SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ，以β-actin為內(nèi)標(biāo)基因，利用Bio-Rad iQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀對(duì)各待測(cè)cDNA樣品中PCNA、K10、FGF5 mRNA的表達(dá)量進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品3次重復(fù)。q-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)[13]。

1.10 數(shù)據(jù)分析

所有樣品用β-actin進(jìn)行歸一化處理，同時(shí)以內(nèi)標(biāo)基因β-actin作為參照基因，用2-△△Ct法計(jì)算PCNA、K10、FGF5 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所有數(shù)據(jù)均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SE)”表示。采用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(one samplettest)，*表示差異顯著(P<0.05)；**表示差異極顯著(P<0.01)。

2 結(jié) 果

2.1 陜北白絨山羊毛囊外根鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)

A.初級(jí)毛囊；B.次級(jí)毛囊；C.培養(yǎng)6 d的初級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞；D.培養(yǎng)6 d的次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞；E.培養(yǎng)12 d的初級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞；F.培養(yǎng)12 d的次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞A. Primary hair follicle；B. Secondary hair follicle；C. Primary hair follicle ORSCs cultured 6 d；D. Secondary hair follicle ORSCs cultured 6 d；E. Primary hair follicle ORSCs cultured 12 d； F. Secondary hair follicle ORSCs cultured 12 d

圖1 毛囊外根鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)(40×)Fig.1 The hair follicle outer root sheath cells in vitro cultured (40×)

2.2 絨山羊毛囊外根鞘細(xì)胞的鑒定

CK17是外根鞘細(xì)胞的特異性標(biāo)記[20]，如圖2所示，CK17的細(xì)胞免疫組化結(jié)果呈陽(yáng)性，表明培養(yǎng)細(xì)胞為次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞。CK15是毛囊干細(xì)胞的特異性標(biāo)記[22]，圖3顯示，CK15的細(xì)胞免疫組化結(jié)果呈陽(yáng)性，表明外根鞘細(xì)胞中有毛囊干細(xì)胞。

2.3 次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4。由圖4可知，體外培養(yǎng)1 d左右，細(xì)胞貼壁并開(kāi)始緩慢增殖；培養(yǎng)2～3 d，細(xì)胞增殖速度緩慢增加；3～5 d，細(xì)胞進(jìn)入快速增殖期，呈現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；培養(yǎng)5 d后，細(xì)胞進(jìn)入平穩(wěn)期并很快進(jìn)入衰退期。細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈典型的“S”型。

2.4 MTT法檢測(cè)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖

MTT法檢測(cè)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖結(jié)果見(jiàn)圖5。如圖5所示，VEGF濃度和處理時(shí)間對(duì)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞增殖均有影響。相同處理時(shí)間(處理24或48 h)，50 ng·mL-1組和100 ng·mL-1組的細(xì)胞活力均顯著或極顯著高于對(duì)照組、1 ng·mL-1組和10 ng·mL-1組(P<0.05和P<0.01)；VEGF處理48 h時(shí)，100 ng·mL-1組的細(xì)胞活力顯著高于50 ng·mL-1組(P<0.05)。相同濃度VEGF，處理48 h的細(xì)胞活力均極顯著高于處理24 h(P<0.01)。

A.CK17；B.DAPI；C.Overlay

圖2 細(xì)胞免疫熒光鑒定(CK17) (200×)Fig.2 Cytoimmunochemistry of CK17 (200×)

A.CK15；B.DAPI；C.Overlay

圖3 細(xì)胞免疫熒光鑒定(CK15) (200×)Fig.3 Cytoimmunochemistry of CK15 (200×)

2.5 EdU檢測(cè)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖

EdU檢測(cè)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖結(jié)果見(jiàn)圖6和圖7。圖6為VEGF處理48 h后1個(gè)視野中EdU標(biāo)記的次級(jí)毛囊外根鞘增殖細(xì)胞染色照片，圖7為染色增殖細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。如圖7所示，VEGF處理48 h，100 ng·mL-1組和50 ng·mL-1組的細(xì)胞計(jì)數(shù)極顯著高于對(duì)照組、1 ng·mL-1組、10 ng·mL-1組(P<0.01)，100 ng·mL-1組的細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于50 ng·mL-1組(P<0.05)。

圖4 次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞生長(zhǎng)曲線Fig.4 Secondary hair follicle ORSCs growth curve

*與**.同色柱或連線色柱之間比較差異顯著或極顯著(P<0.05或 P<0.01)。下同* and **means significant difference(P<0.05 and P<0.01)between columns with same color or with connecting line respectively. The same as follows

圖5 VEGF處理的細(xì)胞活力檢測(cè)Fig.5 Detection of cell activity treated with VEGF

圖6 VEGF處理48 h EdU標(biāo)記的增殖細(xì)胞染色照片 (200×)Fig.6 EdU mark the staining pattern of proliferation cells treated with VEGF for 48 h (200×)

圖7 EdU標(biāo)記增殖細(xì)胞計(jì)數(shù)(48 h)Fig.7 Counting of EdU mark proliferating cells (48 h)

2.6 PCNA、K10和FGF 5基因mRNA在次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中的表達(dá)

PCNA、K10和FGF5基因mRNA在次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中的表達(dá)情況見(jiàn)圖8。圖8A顯示，PCNAmRNA在次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中有表達(dá)，表達(dá)量隨VEGF濃度的增加而增加。相同處理時(shí)間(處理24或48 h)，PCNAmRNA表達(dá)量均以100 ng·mL-1組的最高，極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，顯著高于10 ng·mL-1組(P<0.05)。VEGF處理24 h，10 ng·mL-1組PCNAmRNA的表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。由圖8B可知，角蛋白K10 mRNA在次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中有表達(dá)，VEGF處理可降低其表達(dá)量。VEGF處理24 h， 100 ng·mL-1組K10 mRNA 的表達(dá)量顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；處理48 h，10 ng·mL-1組和100 ng·mL-1K10 mRNA的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。VEGF處理時(shí)間對(duì)K10 mRNA的表達(dá)量也有影響，100 ng·mL-1組處理48 h的表達(dá)量顯著低于處理24 h的表達(dá)量(P<0.05)。

FGF5基因在次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中的表達(dá)情況見(jiàn)圖8C。由圖8C可知，F(xiàn)GF5 mRNA在次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中有表達(dá)，VEGF處理可抑制其表達(dá)，隨著VEGF濃度增大，F(xiàn)GF5 mRNA表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。VEGF處理48 h，100 ng·mL-1組FGF5 mRNA的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)。

圖8 PCNA、K10和 FGF 5 mRNA在次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中的表達(dá)Fig.8 Expression of PCNA, K10 and FGF 5 mRNA in secondary hair follicle ORSCs

3 討 論

3.1 絨山羊次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定

絨山羊具有異質(zhì)的雙重被毛，由無(wú)髓的絨毛和髓質(zhì)發(fā)達(dá)的粗毛組成。山羊絨是毛被下層無(wú)髓毛，由次級(jí)毛囊生成[14]。初級(jí)毛囊不隨季節(jié)發(fā)生周期變化，與初級(jí)毛囊相比較，次級(jí)毛囊呈現(xiàn)出周期性的季節(jié)變化[15]。外根鞘是次級(jí)毛囊的主要組成部分，外根鞘細(xì)胞可以產(chǎn)生終止生長(zhǎng)期的信號(hào)并使得毛囊進(jìn)入退行期[5]，對(duì)次級(jí)毛囊的周期發(fā)育起到重要的作用。因此，本研究選擇培養(yǎng)絨山羊次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞。

外根鞘細(xì)胞的培養(yǎng)方法多采用組織法和消化法。二者相比較，組織法的細(xì)胞增殖快不易傳代；消化法的細(xì)胞可以傳8～10代[16]。本試驗(yàn)采用消化培養(yǎng)法，選擇處于生長(zhǎng)期的毛囊，此時(shí)的外根鞘最厚。崔正軍等[17]通過(guò)對(duì)比DispaseⅡ和胰酶消化法對(duì)大鼠皮膚角朊細(xì)胞分離的研究發(fā)現(xiàn)，在相同消化時(shí)間下，DispaseⅡ消化法可以分離皮膚的表皮和真皮結(jié)合處，并獲得活力較高的角朊細(xì)胞，因此本試驗(yàn)中也采用DispaseⅡ消化皮膚樣品。由于試驗(yàn)中需要?jiǎng)冸x出帶有外根鞘的毛囊，因此在DispaseⅡ的消化時(shí)間不需要太長(zhǎng)，經(jīng)優(yōu)化后皮膚樣品剪成厚度0.2 cm左右的長(zhǎng)條，DispaseⅡ的消化時(shí)間為4.5 h左右；外根鞘細(xì)胞屬于上皮樣細(xì)胞，在原代培養(yǎng)時(shí)較難貼壁。Aasen等[18]通過(guò)在培養(yǎng)皿中鋪入Coating Matrix成功培養(yǎng)出了皮膚中的角質(zhì)細(xì)胞，且細(xì)胞活性很高，因此本研究中也選擇在培養(yǎng)皿中鋪一層Coating Matrix，以促進(jìn)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞很好的貼壁生長(zhǎng)。Cui等[19]用無(wú)血清培養(yǎng)液(K-SFM)培養(yǎng)外根鞘細(xì)胞，且細(xì)胞能夠穩(wěn)定健康的生長(zhǎng)，而本研究中發(fā)現(xiàn)用無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)(epilife medium)的細(xì)胞雖然可以傳代，但細(xì)胞形態(tài)上會(huì)變?yōu)樗笮吻抑饾u凋亡，所以選擇在培養(yǎng)液中添加血清，存在這樣差異的原因可能是所用無(wú)血清培養(yǎng)液的成分不同。外根鞘細(xì)胞是一種未分化的角質(zhì)化細(xì)胞[18]，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)多種角蛋白，所以在外根鞘細(xì)胞的表面存在許多特異性標(biāo)記，Vidal等[20]發(fā)現(xiàn)角蛋白17在外根鞘中特異表達(dá)，認(rèn)為是外根鞘細(xì)胞的特異性標(biāo)記，可用CK17鑒定外根鞘細(xì)胞。毛囊外根鞘隆突部是毛囊干細(xì)胞的重要儲(chǔ)存點(diǎn)[21]，角蛋白K15是隆突部毛囊干細(xì)胞的特異性標(biāo)記，在人和小鼠的毛囊隆突部均有高表達(dá)[22]，經(jīng)CK15鑒定，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)的絨山羊外根鞘細(xì)胞中包含有毛囊干細(xì)胞。就目前的技術(shù)條件而言，分離培養(yǎng)外根鞘細(xì)胞的方法存在雜有毛囊干細(xì)胞的缺陷，進(jìn)一步分離可以采用流式細(xì)胞儀分離及純化外根鞘細(xì)胞。

3.2 VEGF對(duì)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞增殖、分化的影響

次級(jí)毛囊外根鞘在毛囊周期中的變化：生長(zhǎng)期，外根鞘細(xì)胞向下遷移與毛乳頭結(jié)合開(kāi)啟毛囊重建，新的外根鞘出現(xiàn)并增殖變厚；退行期，外根鞘開(kāi)始凋亡并持續(xù)變薄；靜止期，外根鞘最薄且形態(tài)持續(xù)不變[23]。從外根鞘在毛囊周期中的變化可以看出，外根鞘細(xì)胞在生長(zhǎng)期持續(xù)增殖，促進(jìn)外根鞘細(xì)胞增殖的因子有IGF-I、HGF、VEGF和TGF-β1[24]。Li等[25]利用q-PCR、WB和免疫組化法研究發(fā)現(xiàn)，VEGFR-2受體在人外根鞘細(xì)胞中表達(dá)；在人外根鞘細(xì)胞體外培養(yǎng)液中添加不同濃度VEGF發(fā)現(xiàn)，高濃度VEGF可以促進(jìn)人外根鞘細(xì)胞增殖。VEGF對(duì)絨山羊次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞增殖同樣有促進(jìn)作用。MTT的檢測(cè)結(jié)果顯示， VEGF濃度為100 ng·mL-1，處理48 h時(shí)，對(duì)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的促進(jìn)效果極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。EdU標(biāo)記檢測(cè)顯示了同樣結(jié)果：處理48 h時(shí)，VEGF濃度為100 ng·mL-1時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖的促進(jìn)效果極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)。PCNA是鑒定體外培養(yǎng)細(xì)胞增殖的一個(gè)基因，是細(xì)胞增殖的特異性標(biāo)記，且在外根鞘細(xì)胞中特異性表達(dá)[26]。q-PCR顯示PCNAmRNA在VEGF濃度為100 ng·mL-1時(shí)表達(dá)量最高且極顯著高于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明VEGF對(duì)絨山羊次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的增殖具有促進(jìn)作用。外根鞘細(xì)胞是未分化的角質(zhì)化細(xì)胞，當(dāng)皮膚受損時(shí)，外根鞘細(xì)胞會(huì)向上遷移并分化為上皮細(xì)胞[7]。因此，外根鞘是如何分化及影響其分化的分子機(jī)制需要深入研究。角蛋白K10是細(xì)胞分化的特異性標(biāo)記，在外根鞘細(xì)胞中特異性表達(dá)[26]。q-PCR顯示，VEGF處理48 h時(shí)，K10 mRNA在VEGF濃度為10和100 ng·mL-1時(shí)表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明VEGF對(duì)絨山羊次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞的分化具有抑制作用，目前國(guó)內(nèi)有關(guān)VEGF影響外根鞘細(xì)胞分化分子機(jī)理的研究鮮有報(bào)道，有待深入研究。

3.3 VEGF對(duì)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中FGF 5基因mRNA表達(dá)的影響

國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GF5基因自發(fā)突變與人[27]、小鼠[28]、貓[29]、狗[30]等哺乳動(dòng)物呈現(xiàn)較長(zhǎng)毛發(fā)的表型相關(guān)。Hébert等[31]通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建FGF5基因敲除小鼠，該小鼠也出現(xiàn)類似毛發(fā)增長(zhǎng)的表型，通過(guò)免疫組化及mRNA原位雜交的技術(shù)對(duì)FGF5 mRNA及蛋白表達(dá)進(jìn)行定位，發(fā)現(xiàn)FGF5表達(dá)于外根鞘細(xì)胞。Yano等[10]通過(guò)原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)VEGFmRNA高表達(dá)于毛囊生長(zhǎng)期中期的外根鞘中；以轉(zhuǎn)基因小鼠為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，過(guò)表達(dá)毛囊外根鞘中的VEGF，發(fā)現(xiàn)相同時(shí)間內(nèi)VEGF轉(zhuǎn)基因小鼠比野生型小鼠的毛發(fā)生長(zhǎng)快；敲除VEGF基因后發(fā)現(xiàn)抑制了毛發(fā)的生長(zhǎng)。說(shuō)明VEGF通過(guò)作用于毛囊外根鞘促進(jìn)小鼠毛發(fā)的生長(zhǎng)。本研究結(jié)果顯示，隨著VEGF濃度的升高，體外培養(yǎng)的毛囊外根鞘細(xì)胞中，F(xiàn)GF5 mRNA的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)；處理48 h，VEGF濃度為100 ng·mL-1時(shí)，次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞中FGF5 mRNA的表達(dá)量極顯著低于對(duì)照組(P<0.01)，說(shuō)明VEGF可以抑制FGF5的表達(dá)。FGF5基因參與誘導(dǎo)次級(jí)毛囊退行期的發(fā)生，Housley等[30]通過(guò)體外培養(yǎng)人毛囊發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加FGF5重組蛋白，可誘導(dǎo)毛囊退行期的提前發(fā)生。因此，推測(cè)VEGF可以通過(guò)抑制FGF5的表達(dá)促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)，而VEGF是如何通過(guò)抑制FGF5來(lái)促進(jìn)毛囊生長(zhǎng)的相關(guān)分子機(jī)制需要進(jìn)一步的研究證實(shí)。

4 結(jié) 論

本研究成功分離并培養(yǎng)出陜北白絨山羊次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞；VEGF能夠促進(jìn)次級(jí)毛囊外根鞘細(xì)胞增殖，抑制外根鞘細(xì)胞分化；VEGF抑制外根鞘細(xì)胞中FGF5基因的表達(dá)。

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