壩上長尾雞MITF基因核心啟動子鑒定與分析

劉小輝, 彭永東，周榮艷，張傳生，李祥龍*(. 河北農(nóng)業(yè)大學 動物科技學院，保定 0700； . 河北科技師范學院 動物科技學院，秦皇島 066004)

禽羽毛是反映品種和性別的重要表型器官之一，羽毛顏色、色澤、形態(tài)等外觀性狀是定價的重要參考指標，羽色的多樣性也是自身的天然保護色。小眼畸形相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(MITF)是影響羽色形成的重要基因，主要在色素細胞中表達，在黑色素細胞的存活、遷移、增殖和分化中發(fā)揮重要作用，在維持黑色素細胞色素生成中至關(guān)重要[1]，與多個色素相關(guān)基因的表達激活相關(guān)，直接參與酪氨酸酶基因家族的表達[2-5]，MITF對白絨烏雞體內(nèi)黑色素沉積起正向調(diào)控作用，其高表達可能有助于烏雞體內(nèi)黑色素的形成[6]，其自身功能性缺失或突變的發(fā)生會導(dǎo)致許多物種出現(xiàn)一系列的表型變化，尤其是在色素細胞中，部分突變導(dǎo)致眼的色素缺失、減退及小眼畸形。例如，美國海德倫德貂的MITF突變會引起皮毛色素減退[7]，白色獺兔之間或白色和海貍色獺兔之間MITF外顯子1、5、7中部分多態(tài)與獺兔的毛色有顯著關(guān)聯(lián)[8]。雞MITF基因定位于12號染色體上，約88 kb，含有10個外顯子。MITF表達激活依賴于基因上游激活劑和抑制劑對該基因轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的調(diào)控，受到部分轉(zhuǎn)錄因子和通路的影響[9]。啟動子區(qū)突變的發(fā)生可能會影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，進而影響啟動子活性。關(guān)于豬的MITF啟動子已有相關(guān)報道[10]，而雞的該基因啟動子仍未見報道。

本研究對雞MITF基因啟動子結(jié)構(gòu)活性的分析，為闡明雞MITF基因的表達調(diào)控機制提供理論基礎(chǔ)，并為從遺傳學角度分析羽色的形成提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗樣品

試驗用壩上長尾雞的血液樣品來源于張家口京星園生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司。

1.2 試驗試劑

基因組提取試劑盒、Taq酶、PCR純化試劑盒、DNA Marker、Trans5α 感受態(tài)、染色劑、胎牛血清(全式金，中國北京)，T載體、DNA 連接液、KpnⅠ、MluⅠ(TaKaRa，中國大連)，DNA小量抽提試劑盒、膠回收試劑盒(生工，中國上海)，無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提試劑盒(天根，中國北京)，雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(Promega，美國)，DMEM、DPBS(Hyclone，美國)，T4連接酶、Opti-MEM、0.25%胰蛋白酶、Lipofectamine?2000(Thermo Fisher Science，美國)，pGL3-Basic、pRL-TK(平皓生物技術(shù)有限公司，中國北京)、雞成纖維細胞(DF1)(北京協(xié)和細胞資源庫，中國北京)。

1.3 試驗方法

1.3.1 啟動子序列分析 通過UCSC數(shù)據(jù)庫(http://genome.ucsc.edu/)、NCBI數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)、Ensemble數(shù)據(jù)庫(http://asia.ensembl.org/index.html)和BioEdit分析序列，通過ALGGEN PROMO數(shù)據(jù)庫預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3)。

1.3.2 PCR擴增和載體構(gòu)建 從NCBI數(shù)據(jù)庫獲取雞MITF基因上游序列(登錄號: NC_006099.4)2 000 bp，利用Primer5設(shè)計引物，分析擴增序列KpnⅠ和MluⅠ的酶切位點，并加入保護堿基(表1)，擴增出不 同長度的缺失片段。PCR擴增體系：Taq酶0.5 μL，10×TaqBuffer 5 μL，2.5 mmol·L-1dNTPs 4 μL，DNA(50 ng·μL-1)5 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，ddH2O補至50 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，退火30 s，72 ℃延伸，退火溫度及延伸時間見表1，共33個循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠回收純化，連接pMD19-T(Simple)載體并于Trans5α感受態(tài)細胞中進行擴繁，KpnⅠ和MluⅠ雙酶切陽性T載體，選取目的片段與pGL3-Basic連接，將菌液PCR擴增，有目的條帶的菌液送至北京六合華大基因測序，對質(zhì)粒進行雙酶切，對鑒定為陽性的菌液提取無內(nèi)毒素質(zhì)粒，并檢測其濃度和純度。

1.3.3 細胞培養(yǎng)和活性檢測 控制培養(yǎng)箱的溫度為37℃，CO2穩(wěn)定在5%，待DF1細胞狀態(tài)好時，鋪于24孔板內(nèi)，24 h觀察細胞狀態(tài)，貼壁80%左右，進行轉(zhuǎn)染，包含構(gòu)建的重組質(zhì)粒(0.475 μg)、pRL-TK(0.025 μg)脂質(zhì)體(1.0 μL)、Opti-MEM共計50 μL的脂質(zhì)體和質(zhì)粒孵育5 min，轉(zhuǎn)染到DF1細胞，48 h檢測螢火蟲與海腎熒光素酶的相對活性。試驗進行3次系統(tǒng)重復(fù)，每次包含3次機械重復(fù)。

1.3.4 統(tǒng)計分析 分別測得螢火蟲熒光素酶活性檢測值F和海腎熒光素酶活性檢測值R，得到相對值F/R，再除以陰性對照pGL3-Basic的相對熒光素酶活性檢測的背景值，以消除不同轉(zhuǎn)染批次的系統(tǒng)誤差。利用SPSS19.0軟件非參數(shù)檢驗法統(tǒng)計分析試驗數(shù)據(jù)。

表1擴增雞MITF基因啟動子的引物信息

Table1TheinformationofprimersamplifyingchickenMITFgenepromoter

名稱Name引物序列(5′→3′)Primersequence產(chǎn)物長度/bpLengthTm/℃延伸時間/sExtensiontimep4?FGGGGTACCATTGGGAGGGTGGTGTTTTTGC12856080p2?FGGGGTACCGGAGCCAGAGGTGGAGTTTC8606055p5?FGGGGTACCGTGTAGTTTGATGTTTACCTTCCTTAAGAGTTCC7515847p6?FGGGGTACCCTGTAAAACTTGAAATAGTGAGGCATGTTTTCCAG3516025RCGACGCGTCCGACGCTCCTGCTCCTGFGGGGTACCGGAGCCAGAGGTGGAGTTTCp1?RCGACGCGTGGGGCAGGCTGGCGGGCA9606860p3?RCGACGCGTGGATTCGTGAGGTCATGCTG8105650

表中黑體字部分表示保護堿基，下劃線部分表示酶切位點

Bold letters are protective bases, and underlined sequences are restriction enzyme digestion sites

2 結(jié) 果

2.1 壩上長尾雞MITF啟動子擴增與序列分析

以壩上長尾雞基因組為模板，進行PCR擴增獲得了雞MITF基因候選啟動子區(qū)域1 385 bp，并對擴增產(chǎn)物進行了測序，與UCSC提交的MITF基因序列(Chromosome 12: 15 557 648～15 559 032 bp)相似性為99.9%(圖1)，說明片段來源正確，可用于試驗。將此處外顯子1起始位點作為+1。

圖1 壩上長尾雞MITF基因上游序列與UCSC數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果Fig.1 Alignment of upstream sequence of Bashang Long-tail chicken MITF gene with UCSC database

2.2 壩上長尾雞MITF啟動子區(qū)不同缺失片段的擴增

利用不同引物擴增雞MITF基因上游序列的缺失片段，包括p1(-660～+300 bp)、p2(-660～+200 bp)、p3(-660～+150 bp)、p4(-1 085～+200 bp)、p5(-551～+200 bp)、p6(-151～+200 bp)，PCR擴增出的雞MITF基因的各個片段經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖2)，與預(yù)期長度一致。

2.3 壩上長尾雞MITF啟動子熒光素酶表達載體的構(gòu)建與活性分析

PCR擴增片段與pMD-19T載體的連接體系: 1 μL pMD-19T vector，1～4 μL PCR回收產(chǎn)物，5 μL Solution I，ddH2O補足至10 μL，16℃連接，重組質(zhì)粒經(jīng)過雙酶切后通過T4連接酶連接到表達載體pGL3-Basic，將菌液PCR有目的條帶的菌液送至北京六合華大基因進行測序，并對重組質(zhì)粒進行KpnⅠ和MluⅠ雙酶切(圖3)，對鑒定為陽性的菌液提無內(nèi)毒素質(zhì)粒，并檢測其濃度和純度。

將重組表達載體轉(zhuǎn)染到DF1細胞中，進行雙熒光素酶活性檢測，圖4表明，構(gòu)建的P1～P6的活性與陰性對照組差異顯著 (P<0.05)，報告基因P2(-660～+200 bp)轉(zhuǎn)染活性值最高，該活性值是對照組pGL3-Basic的50倍，從-1 085 bp缺失到-151 bp時，啟動子活性在DF1中先升高后降低，表明-660～+200 bp區(qū)域為雞MITF基因的核心啟動子區(qū)域，含有200 bp的外顯子1。

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；p1～p6. 擴增的目的片段M. Trans2K? Plus DNA marker; p1-p6. The amplified target fragments

圖2 MITF基因啟動子PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of PCR products in MITF promoter

M. DNA相對分子質(zhì)量標準；p1～p6. 重組質(zhì)粒酶切鑒定M. Trans2K? Plus DNA marker; p1-p6. Enzyme digestion of each recombinant plasmid

圖3 重組質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.3 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmids by dual-enzyme digestion

右圖誤差線表示標準誤，不同質(zhì)粒間，標有不同小寫字母代表差異顯著(P<0.05)，標有相同小寫字母代表差異不顯著(P>0.05)，圖5同The standard error is represented by the error line in the right figure, the different letters on the column indicate the significant difference (P<0.05), and the same letter indicates no significant difference (P>0.05) among the expression vectors, the same as figure5

圖4 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染DF1細胞后的相對熒光活性值Fig.4 Relative luciferase activity of recombinant plasmids in DF1 cell

2.4 壩上長尾雞MITF核心啟動子區(qū)突變

雞P2上下游引物之間的序列存在突變，UCSC數(shù)據(jù)庫公布了10個單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(圖1)，以60只壩上長尾雞DNA為模板，擴增該區(qū)域片段，并送至北京六合華大基因測序，發(fā)現(xiàn)壩上長尾雞MITF該區(qū)域存在10個突變位點，分別為-579 bp、-505 bp、-274 bp、-220 bp、-203～-202 bp、-98 bp、-46 bp、-14 bp、+1 bp、+28 bp(表2)。

表2核心啟動子區(qū)突變位點

Table2Mutantsitesinthecorepromoterregion

UCSC參考SNP編號UCSCreferenceSNPID位置/bpPositionUCSC數(shù)據(jù)庫UCSCdatabase壩上長尾雞BashangLong?tailchickenrs739244840-579A/TA/Trs735905475-535A/TArs14983773-505C/TC/Trs317801581-354C/TTrs314129601-294C/TCrs14983774-274A/GA/Grs732406418-220T/AT/A無編號-203～-202ATAT/AT缺失rs317496556-98A/GA/G無編號-46CC/Trs313918239-23A/GGrs316071234-14C/TC/T無編號+1GG/A無編號+28CC/T

2.5 壩上長尾雞MITF核心啟動子區(qū)突變載體的構(gòu)建與活性分析

以壩上長尾雞的不同個體DNA為模板進行PCR擴增獲得突變序列，構(gòu)建核心啟動子區(qū)突變載體，分別轉(zhuǎn)染到DF1細胞中，對報告基因進行雙熒光素酶活性檢測(圖5)，mut-1～mut-3及P2均顯著高于pGL3-Basic活性值(P<0.05)，且兩兩之間差異顯著(P<0.05)，mut-4與pGL3-Basic活性值差異不顯著(P>0.05)，均顯著低于其他啟動子活性值(P<0.05)。

圖5 熒光素酶表達載體(P2)及其對應(yīng)突變載體(mut-1～mut-4)不同位點的堿基組成和活性分析Fig.5 The base composition of different loci and activity analysis of relative luciferase expression vectors (P2) and corresponding mutant vectors (mut-1-mut-4)

2.6 壩上長尾雞MITF突變位點轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測

用ALGGEN PROMO數(shù)據(jù)庫對核心啟動子區(qū)突變區(qū)域進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測，堿基突變前后，預(yù)測到HOX家族(HOXA3、HOXD8、HOXD9、HOXD10、HOX11)、NF-1、DBP、TFIID和TFIIB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的相似性發(fā)生了變化(圖6)，例如，-274 A>G導(dǎo)致NF-1與序列結(jié)合性增強， -203～-202AT缺失后HOXD9、HOXD10與序列結(jié)合性降低。-98C>T導(dǎo)致TFIID、HOXD8與序列結(jié)合性增強，-46C>T導(dǎo)致HOXA3與序列結(jié)合性略有降低，-14C>T導(dǎo)致NF-1和HOXA3與序列結(jié)合性增強，+1G>A導(dǎo)致DBP與序列結(jié)合性降低，+28C>T導(dǎo)致TFIIB與序列結(jié)合性降低。

圖6 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的相似性Fig.6 The similarity of transcription factor binding sites

3 討 論

MITF基因是影響羽色形成的重要基因，MITF通過和其他基因互作對皮膚毛色形成以及其他組織色素形成均有作用，其自身功能性缺失或突變的發(fā)生會影響基因表達量的改變進而影響表型。啟動子區(qū)突變的發(fā)生可能會影響轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，影響啟動子活性。本研究通過雞MITF基因啟動子活性分析，確定-660～+200 bp區(qū)域為雞MITF基因的核心啟動子區(qū)域。通過啟動子區(qū)的突變載體mut-1～mut-4活性分析表明，-579 bp、-505 bp、-274 bp、-220 bp、-203～-202 bp、-98 bp、-46 bp、-14 bp、+1 bp、+28 bp位點對MITF基因啟動子活性有較大影響，通過ALGGEN PROMO數(shù)據(jù)庫進行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點預(yù)測，發(fā)現(xiàn)MITF基因核心啟動子突變區(qū)域HOX家族(HOXA3、HOXD8、HOXD9、HOXD10、HOX11)、NF-1、DBP、TFIID和TFIIB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的相似性發(fā)生了變化。

有研究表明，基因轉(zhuǎn)錄時，轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物(pre-initiation complex, PIC)是啟動基因表達的關(guān)鍵，包括RNA聚合酶II以及普遍轉(zhuǎn)錄因子TFIIA、TFIIB、TFIID、TFIIE、TFIIF和TFIIH。TFIIB是繼TFIID之后加入形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物PIC的重要組成部分，TFIIB有兩個結(jié)構(gòu)域，一個可以促進TFIID的TATA結(jié)合蛋白(TBP)亞基與RNA聚合酶II結(jié)合，決定轉(zhuǎn)錄起始，另一個可以介導(dǎo)其他普遍轉(zhuǎn)錄因子的介入，TFIIB是一些反式調(diào)控元件的作用靶點[11-15]。DPB是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，例如感染病毒后，DPB轉(zhuǎn)錄本或蛋白的缺失，使得芽病毒和包涵體部分減少[16]，DBP可通過DBP-TRIM55-TNF-α-CCL2通路上調(diào)單核趨化因子CCL2的表達[17]，也可以使IGFBP-1啟動子活性增強[18]。由本研究結(jié)果分析可知，mut-4活性缺失，存在+1G>A，+28C>T突變，+1位點DBP與序列結(jié)合性降低，+28位點TFIIB與序列結(jié)合性降低，說明啟動子活性缺失可能是由于DBP對MITF有正調(diào)控作用，同時，轉(zhuǎn)錄因子TFIIB與序列結(jié)合性降低，無法形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物而使得轉(zhuǎn)錄受到抑制從而影響mut-4啟動子的活性。

張濤等[19]的研究結(jié)果表明，NF-1對熱休克蛋白90的表達起到一定抑制作用，而李麗莎等[20]的研究表明，NF-1為山羊PMEL基因轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控元件。同源框基因(homeobox genes，Hox)表達的蛋白質(zhì)是重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在人、小鼠、絨山羊已有相關(guān)研究[21]，Hox基因在毛囊生長發(fā)育過程中扮演著重要的角色，幾乎所有的Hox家族基因均在皮膚和毛囊中表達[22-23]。本試驗中，mut-1、P2、mut-2、mut-3活性值依次顯著降低(P<0.05)，推測啟動子活性值改變可能是由于啟動子區(qū)突變引起了轉(zhuǎn)錄因子HOX家族(HOXA3、HOXD8、HOXD9、HOXD10、HOX11)、NF-1、DBP、TFIID和TFIIB與啟動子序列的結(jié)合性發(fā)生了改變，這些轉(zhuǎn)錄因子可能對雞MITF基因表達具有調(diào)控作用，進一步結(jié)合染色質(zhì)免疫共沉淀(CHIP)和凝膠阻滯電泳(EMSA)技術(shù)，將對研究MITF基因在毛囊組織中的表達調(diào)控提供依據(jù)。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建了6個含有不同長度雞MITF基因啟動子片段的pGL3-Basic表達載體及4個核心啟動子區(qū)突變載體，確定了核心啟動子區(qū)域為-660～+200 bp，其中-579 bp、-505 bp、-274 bp、-220 bp、-203～-202 bp、-98 bp、-46 bp、-14 bp、+1 bp、+28 bp突變位點對MITF基因啟動子活性有較大影響。并且軟件預(yù)測這些位點突變改變了HOX家族(HOXA3、HOXD8、HOXD9、HOXD10、HOX11)、NF-1、DBP、TFIID和TFIIB與序列的結(jié)合性。

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