杜洛克豬HLCS基因組織表達(dá)分析及其編碼區(qū)多態(tài)性與剩余采食量的關(guān)聯(lián)

張躍博,蒲 蕾,張金山,顏 華,王立剛,侯欣華, 劉 欣,高紅梅,王立賢，張龍超*(.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，北京 0093； .天津農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)與動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，天津 300384)

隨著我國生豬養(yǎng)殖集約化的持續(xù)推進(jìn)，養(yǎng)豬業(yè)逐漸進(jìn)入微利時代，成本控制成為該時期一個鮮明特征。在養(yǎng)豬生產(chǎn)中，飼料投入約占總養(yǎng)殖成本的70%，因此，飼料利用效率的微小提升就會帶來飼養(yǎng)成本的大幅下降[1-2]。因此，飼料利用效率越來越受到人們的重視。目前，對豬的生長性狀和瘦肉率、產(chǎn)仔數(shù)等繁殖性狀的選擇已經(jīng)取得明顯進(jìn)展，飼料利用效率現(xiàn)已成為豬育種中重要選擇目標(biāo)性狀之一。飼料利用效率評價指標(biāo)主要包括飼料增重比(feed/gain ratio, F/G)、增重飼料比(gain/feed ratio, G/F)和剩余采食量(residual feed intake，RFI)。從統(tǒng)計學(xué)角度來說，直接利用比值性狀制定選擇指數(shù)是不盡合理的[3]。RFI是畜禽實際采食量與用于維持和增重所需要的預(yù)測采食量之差，能夠反映動物本身由遺傳背景決定的代謝差異。同時，多項研究表明，RFI具有中等遺傳力[4-6]，是可遺傳的。因此，RFI更加適合作為飼料利用效率的評估指標(biāo)用于畜禽遺傳選育。隨著電子飼喂設(shè)備的更新?lián)Q代以及采食量測定系統(tǒng)的不斷發(fā)展，RFI現(xiàn)已應(yīng)用于一些有關(guān)飼料利用效率的研究中[1,7-9]。

估計RFI需要大量的平均日采食量數(shù)據(jù)，雖然電子飼喂設(shè)備的更新?lián)Q代以及采食量測定系統(tǒng)的不斷發(fā)展使得采食量數(shù)據(jù)收集更加便利，但是依然昂貴費時。因此，鑒定與RFI相關(guān)的分子標(biāo)記十分必要。應(yīng)用重測序技術(shù)，Liu等[10]檢測出46個與科寶雞RFI顯著相關(guān)的SNPs。Seabury等[11]利用混合模型進(jìn)行GWAS分析，在安格斯牛中定位到7個高效QTLs，在海福特牛中鑒定出4個高效QTLs。目前，科研人員對豬RFI分子機理也開展了許多工作。Fan等[12]通過關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)TO上p.Ala198Ala和TCF7L2上c.646+514A > G與RFI顯著關(guān)聯(lián)。Sanchez等[13]在大白豬SSC6上檢測到一個與RFI相關(guān)的QTL。Onteru等[14]通過GWAS方法在大白豬SSC2、3、5、7、8、9、14和15上檢測到了與RFI顯著關(guān)聯(lián)的SNPs。Mauch等[9]在SSC1、5、6、14和16上定位到與RFI相關(guān)的QTLs。Bai等[15]以軍牧1號白豬為研究對象，利用GWAS方法檢測到12個與RFI顯著關(guān)聯(lián)的SNPs。2014年Do等[16]對杜洛克豬的飼料利用效率開展研究，認(rèn)為HLCS是豬RFI性狀的重要候選基因。但目前針對HLCS的研究較少，在豬中未見相關(guān)報道，其對豬剩余采食量的影響尚不明確。

HLCS基因位于人21號染色體長臂22區(qū)，全長HLCS蛋白包含726個氨基酸，預(yù)測分子量為81 ku。豬HLCS基因位于13號染色體上，包含12個外顯子。全羧化酶合成酶能夠催化生物素與羧化酶及組蛋白結(jié)合[17-19]，生物素化的羧化酶在糖原異生、脂肪酸合成、氨基酸等代謝途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用[20]，生物素化的組蛋白可抑制基因轉(zhuǎn)錄[21]。本研究以豬HLCS基因為研究對象，檢測其組織表達(dá)情況，篩選多態(tài)性，并探討多態(tài)位點與RFI性狀之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用豬為美系杜洛克，均來自河南省雛鷹農(nóng)牧集團股份有限公司尉氏分公司，3頭杜洛克豬在100 kg左右時進(jìn)行屠宰，迅速收集心、肝、脾、腎、脂肪、肌肉、小腸和胃底組織于凍存管中，并盡快置于液氮罐中，用于組織表達(dá)分析。利用美國奧斯本自動喂料系統(tǒng)測定1 292頭美系杜洛克豬的每日采食量和每日體重，并采集所有試驗中涉及個體的耳組織。90日齡開始測定，體重達(dá)100 kg時結(jié)束，并在此時用Aquila Vet獸用B超儀測定豬的背膘厚及眼肌面積。試驗中RFI計算參考前人方法[22]：

RFI=ADFI-(b1×(OnBW-30)+b2×(OffBW-100)+b3×MetamidBW+b4×ADGA+b5×OffBFA)，式中，ADFI指平均日采食量；OnBW指初測體重；OffBW指結(jié)測體重；MetamidBW指中間代謝體重，計算公式為((OnBW+OffBW)/2)0.75；ADGA代表90～180天之間的平均日增重校正值；OffBFA指測試結(jié)束時10～11肋背膘厚校正到100kg體重時的值。100kg背膘厚和30～100kg ADGA的校正公式來源于加拿大遺傳改良計劃。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、dNTP混合物、動物組織總RNA提取試劑盒均購自天根生化科技有限公司(北京)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRT Reagent Kit)和熒光定量染料(SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ)均購于TaKaRa公司(大連)。

1.3 DNA和RNA的提取

用酚-仿法從耳組織樣品中提取基因組DNA，利用Nano Drop 2000核酸定量儀測定每頭豬耳樣DNA的濃度，A260 nm/A280 nm比值為1.7～2.2為合格樣品。使用動物組織總RNA提取試劑盒提取總RNA，提取過程全按照試劑盒說明書操作。提取的RNA經(jīng)IMPLEN超微量分光光度計檢測合格方可用于后續(xù)試驗。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.4 引物設(shè)計

參考HLCS基因mRNA序列(GenBank登錄號為XM_021070965.1)，使用NCBI數(shù)據(jù)庫中的Primer-BLAST設(shè)計普通PCR和熒光定量PCR引物，GAPDH作為內(nèi)參基因，引物信息見表1。引物均由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成。

表1普通PCR和熒光定量PCR引物

Table1PrimersforPCRamplificationsandreal-timePCRforporcineHLCS

引物用途Purpose引物名稱Primer引物序列(5′→3′)Primersequence退火溫度/℃Annealingtemperature產(chǎn)物長度/bpProductsize多態(tài)性檢測PolymorphismdetectionHLCS＿1FATGGCCCTTCCCTCTTTTGTT58．9467HLCS＿1RGACACCCACACTACGACACATHLCS＿2FTCCTTCGGGAATGGTGCTG63．81407HLCS＿2RATCCTCTACCCCAGCAAAAAGACHLCS＿3FATACAGCAAGGGGGTCAGGT63．8385HLCS＿3RCCCTCAACTGAATGAGTCCCCHLCS＿4FTTCATGGCAGATGGTGGTCAA61．0817HLCS＿4RCTGGTTCAAGGGAACGGTCAAHLCS＿5FTTCCATCGCTCTCACCACAG61．0730HLCS＿5RAAGAGGCGGTGATCTTTGCTHLCS＿6FTCCCTTGGCACAACATGGAT62．0672HLCS＿6RTTACAAAGAGCAGGTGGAGGCHLCS＿7FAGTGATGAGCCGTCCGAAAA62．0343HLCS＿7RCACTCCCCTCAATGTAGCCAHLCS＿8FTCGGTGGCGTTCTGGTTA59．0816HLCS＿8RGCTGAAGTGCCTGTGGAGHLCS＿9FTGGTGCTTACCAAACGATGC62．01179HLCS＿9RCAAATCCTCCTTTGCGTGTGG熒光定量PCRReal?timePCRH168FACTTGAACAAATGGGCGCTCT60．0168H168RTGCAAGCTAACGGCAAACAA

1.5 熒光定量PCR檢測

利用ABI QuantStudioTM7 Flex實時熒光定量PCR儀檢測HLCS在心、肝、脾、腎、脂肪、肌肉、小腸和胃底組織中的表達(dá)量。反應(yīng)總體積為20 μL：2×SYBR?Premix ExTaqII 10 μL，上下游引物(10 μmol ·L-1)各0.4 μL，50×ROX Reference Dye II 0.4 μL，模板2 μL，ddH2O 6.8 μL。PCR程序：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后分析熔解曲線。采用2-△△Ct法計算目的基因相對表達(dá)量。使用SAS9.2軟件中的ANOVA程序進(jìn)行方差分析。

1.6 PCR擴增

HLCS基因擴增反應(yīng)體系為25 μL：10×Taq Buffer 2.5 μL，dNTP(10 mmol·L-1) 0.5 μL，ddH2O 18.5 μL，模板2 μL，上下游引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，DNA聚合酶(2.5 U·μL-1) 0.5 μL。 PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。反應(yīng)產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，條帶明亮且長度符合預(yù)期的產(chǎn)物交由北京諾賽基因組研究中心有限公司進(jìn)行Sanger測序。運用SeqMan軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計分析

計算各變異位點等位基因頻率、基因型頻率、多態(tài)信息含量、群體雜合度及Hardy-Weinberg平衡檢驗。 使用SAS9.2軟件中的GLM程序，配合下列模型進(jìn)行最小二乘方差分析，比較RFI在各基因型之間的差異。使用的模型：

Yijkl=μ+Gi+Sj+Bk+Pl+eijkl

其中，Yijkl為性狀測定值；μ為群體均值；Gi為基因型效應(yīng)；Sj為性別效應(yīng)；Bk為測定批次效應(yīng)；Pl為胎次效應(yīng)；eijkl為隨機誤差。

2 結(jié) 果

2.1 豬HLCS基因組織表達(dá)譜分析

熒光定量PCR檢測HLCS基因mRNA在杜洛克豬多種組織中的表達(dá)情況如圖1所示。HLCS基因在所檢測的8種組織中均有表達(dá)，其中，在脂肪組織中表達(dá)量最高，肝次之，在心和肌肉中痕量表達(dá)。方差分析顯示，HLCS在脂肪組織中表達(dá)量顯著高于除肝以外的其它組織(P<0.05)，在肝中的表達(dá)顯著高于除脂肪和脾以外的其它組織(P<0.05)，在心和肌肉中的表達(dá)則顯著低于除胃底以外的其它所有組織(P<0.05)。

不同組織間，不同字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母表示不顯著(P>0.05)The different letters indicate significant difference (P<0.05), the same letter indicate no significant difference (P>0.05) among different tissues

圖1 HLCS在杜洛克豬各組織中的表達(dá)水平Fig.1 Relative mRNA abundance of the porcine HLCS in 8 tissues of Duroc pigs

2.2 豬HLCS基因編碼區(qū)遺傳多態(tài)性檢測

在1 292頭美系杜洛克中挑選RFI具有明顯差異的個體各10頭組成高、低組。高組個體RFI均值為(0.528±0.077) kg，低組個體RFI均值為(-0.545±0.059) kg。利用PCR擴增和測序技術(shù)，在HLCS編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn)5個SNPs(圖2)，其中，c.1173C>T和c.1408G>C位于外顯子4，c.1976A>G位于外顯子6，c.2160G>A位于外顯子7，c.2325G>A位于外顯子8。其中，c.1408G>C和c.1976A>G為非同義突變位點，前者使得丙氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦彼?，后者?dǎo)致天冬氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)楦拾彼帷?/p>

圖2 豬HLCS基因SNPs位點示意圖Fig.2 Schematic representation of SNPs in porcine HLCS

2.3 豬HLCS基因多態(tài)位點基因型和等位基因頻率及群體遺傳特性

用288頭杜洛克個體針對c.1408G>C和c.1976A>G位點進(jìn)行基因分型，分別成功分型226頭和241頭，各位點的基因型頻率、等位基因頻率及群體遺傳特性見表2。從表2可以看出，2個多態(tài)位點的雜合度均接近0.5，說明它們的純合度和雜合度基本相同。PIC值顯示，這2個位點在此杜洛克群體中的多態(tài)性較高，遺傳變異比較大。c.1408G>C和c.1976A>G的優(yōu)勢等位基因均為G，基因頻率分別為0.513和0.575；優(yōu)勢等位基因型均為雜合基因型?？ǚ綑z驗顯示，c.1408G>C在所選擇的杜洛克豬群中未達(dá)到Hardy-Weinberg平衡(P<0.05)，而c.1976A>G處于Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。

表2HLCS基因多態(tài)位點c.1408G>C和c.1976A>G的基因型和等位基因頻率及群體遺傳特性

Table2Thegenotypeandallelefrequencyandthepopulationgeneticcharacteristicsofc.1408G>Candc.1976A>GinHLCS

位點SNP個體數(shù)Number基因型頻率Genotypefrequency等位基因頻率Allelefrequency雜合度He多態(tài)信息含量PICχ2c．1408G>C226GGGCCCGC0．5000．3756．4520．2210．5840．1950．5130．487c．1976A>G241AAAGGGAG0．4890．3693．0200．1530．5440．3030．4250．575

2.4 豬HLCS基因多態(tài)性與RFI的關(guān)聯(lián)分析

通過對c.1408G>C和c.1976A>G多態(tài)位點與RFI性狀進(jìn)行群體關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，前者基因型間的RFI沒有顯著差異(P>0.05)，但表現(xiàn)出GG基因型個體的RFI比CC基因型個體低的趨勢；后者與RFI顯著關(guān)聯(lián)(P<0.5)，AA基因型個體的RFI顯著高于GG基因型個體(表3)。2個位點上的有利等位基因型比不利等位基因型分別低0.018 1 和0.063 4 kg。

表3HLCS多態(tài)位點基因型與RFI的關(guān)聯(lián)分析

Table3AssociationofgenotypesatthetwopolymorphismsiteswithRFI

多態(tài)位點Site個體數(shù)Number基因型GenotypeRFI均值/kgMean最小二乘均值/kgLSMc．1408G>C50GG0．03250．0154±0．0279132GC0．06540．0498±0．019544CC0．03090．0335±0．0291c．1976A>G37AA0．07110．0676±0．0267a131AG0．04310．0319±0．0174ab73GG-0．03140．0042±0．0227b

不同基因型間，所標(biāo)字母相異表示差異顯著(P<0.05)，所標(biāo)字母相同表示差異不顯著(P>0.05)

The different letters (within same column) show statistically significant difference (P< 0.05), the same letter(within same column) show statistically no significant difference(P>0.05) among different genotypes

3 討 論

生物素是生物體新陳代謝不可或缺的物質(zhì)，它是生物素依賴性羧化酶的輔助因子。生物素依賴性羧化酶主要有丙酰輔酶A羧化酶、丙酮酸羧化酶、甲基巴豆酰輔酶A羧化酶和2種乙酰輔酶A羧化酶，這些羧化酶在糖異生、脂肪酸合成及氨基酸分解代謝中催化關(guān)鍵反應(yīng)[23]。新合成的生物素依賴性羧化酶不具有酶活性，需在HLCS催化下與生物素以共價鍵結(jié)合后才具有活性[24]。目前，針對HLCS的研究主要集中在人的羧化酶缺乏癥上。羧化酶缺乏癥主要分為兩種，一種是生物素酶缺乏(BTD)所致，一種是全羧化酶合成酶缺乏(HLCSD)所致。HLCS活性下降，導(dǎo)致生物素?zé)o法與生物素依賴的羧化酶結(jié)合，從而影響羧化酶活性，使脂肪酸合成、糖異生及氨基酸的分解代謝發(fā)生障礙，這些過程與機體新陳代謝密切相關(guān)[25]。臨床上，羧化酶缺乏的兒童會表現(xiàn)出發(fā)育遲緩的癥狀[26]。研究表明，代謝通路(metabolic pathways)與豬RFI性狀顯著關(guān)聯(lián)，并且代謝過程中各因子的變異會引起RFI的變化[27]；而HLCS基因就位于代謝通路中。鑒于HLCS在新陳代謝中的重要作用及Do等[16]的研究結(jié)果，本研究分析了豬HLCS基因的多態(tài)性，并進(jìn)一步分析了豬HLCS基因與RFI的關(guān)系。

本研究首先檢測了豬HLCS基因在多種組織中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在脂肪組織和肝中表達(dá)量較高。在人類各相應(yīng)組織中(不包括肌肉)，HLCS也均表達(dá)，只是腎中表達(dá)量最高，肝次之，心最低，脂肪與肝接近[28]。這些結(jié)果預(yù)示著HLCS可能在脂質(zhì)合成代謝過程中發(fā)揮重要作用。Lkhagvador等[29]利用RFI高、低組在豬的脂肪組織和肝中鑒定出大量差異表達(dá)基因，表明脂質(zhì)合成代謝與RFI存在密切關(guān)系；但Lkhagvador等[29]鑒定出的差異表達(dá)基因并不包含HLCS。同時，本實驗室前期對RFI高、低組杜洛克垂體組織RNA-seq數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析中，也未捕獲到HLCS基因。由此推測，HLCS并不是通過表達(dá)量的改變影響RFI，而可能通過改變蛋白結(jié)構(gòu)或功能來影響RFI。

在人類的全羧化酶缺乏癥(holocarboxylase synthetase deficiency，HCSD)研究中均在患者的HLCS基因上檢測到錯義突變[25, 30-33]。R508W和V550M發(fā)生在生物素結(jié)合區(qū)域，是HCSD患者HLCS基因上常見突變，可導(dǎo)致HLCS與生物素結(jié)合能力下降[25]。Esaki等[34]利用定點突變的方法在HLCS基因上引入Q699R變異，發(fā)現(xiàn)重組HLCS蛋白與生物素的親和力顯著下降。這些研究結(jié)果進(jìn)一步驗證了上述猜測。豬HLCS基因上也存在諸多變異，截止到2017年12月2日，NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫[35]共收錄了177個位于豬HLCS基因cDNA序列上的突變位點，其中166個為SNPs，11個為Indels，但是這些變異的生物學(xué)意義還未得到詮釋。本研究中共發(fā)現(xiàn)5個SNPs，除c.1173C>T外均已存在于NCBI的dbSNP數(shù)據(jù)庫中，其中c.1408G>C和c.1976A>G可導(dǎo)致錯義突變。對c.1408G>C和c.1976A>G錯義突變在杜洛克群體中分型，兩者的優(yōu)勢等位基因均為G。根據(jù)Botstein等[36]提出的衡量多態(tài)信息含量標(biāo)準(zhǔn)，本研究中的2個錯義突變位點多態(tài)信息含量(PIC)均為中度多態(tài)，表明2個位點具有作為育種標(biāo)記的潛力，適合進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析。通過對c.1408G>C和c.1976A>G多態(tài)位點與RFI性狀進(jìn)行群體關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，c.1408G>C基因型間的RFI沒有顯著差異(P>0.05)，而c.1976A>G與RFI顯著關(guān)聯(lián)(P<0.05)，GG基因型更有利。使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析豬HLCS氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)c.1976A>G位于BPL_N結(jié)構(gòu)域上。雖然該結(jié)構(gòu)域功能未知，但其氨基酸序列變化更易改變蛋白結(jié)構(gòu)及功能，進(jìn)而影響豬RFI。本研究不僅為開展RFI性狀分子選育提供了有價值的育種標(biāo)記，同時也為進(jìn)一步探究HLCS基因影響豬RFI的分子調(diào)控機理奠定了研究基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究表明，HLCS基因在豬的多種組織中均表達(dá)，且在與新陳代謝密切相關(guān)的肝、脂肪等組織中高表達(dá)。在豬HLCS基因編碼區(qū)共檢測到5個多態(tài)位點，包括2個錯義突變位點c.1408G>C和c.1976A>G。對2個錯義突變位點在杜洛克群體進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)c.1976A>G與杜洛克豬RFI存在顯著關(guān)聯(lián)。這些結(jié)果表明，豬HLCS基因上錯義突變位點c.1976A>G可作為豬飼料利用效率性狀選育的潛在分子標(biāo)記。

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