機(jī)械加載對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖和非酒精性脂肪肝的治療作用

譚念，李心樂，翟麗東，劉大全，張平

肥胖是由多種因素引起的能量和代謝失衡性慢性疾病，以體內(nèi)脂肪沉積異常過多為特點(diǎn)，并伴有冠心病、高血壓、2型糖尿病、高脂血癥和非酒精性脂肪肝（NAFLD）等一系列全身性疾?。?］。肝臟脂肪變性是NAFLD的早期癥狀，其特點(diǎn)是肝臟脂質(zhì)過多積累［2］。目前對于肥胖和脂肪肝尚無特異性的藥物治療［3］。機(jī)械加載是一種脈沖式關(guān)節(jié)加載，該方法以一定頻率的溫和動(dòng)態(tài)加載力作用于膝關(guān)節(jié)等滑膜關(guān)節(jié)，進(jìn)行機(jī)械刺激，通過作用于骨干的微小原位機(jī)械應(yīng)力引起全身的相關(guān)合成代謝反應(yīng)。筆者早期的研究表明，機(jī)械加載能夠預(yù)防骨關(guān)節(jié)炎中的組織退化、減少股骨頭壞死后的骨質(zhì)流失以及促進(jìn)骨折愈合［4-5］。迄今為止，機(jī)械加載對肥胖和脂肪肝的作用尚不清楚。因此，本研究通過建立高脂飲食誘導(dǎo)肥胖和脂肪肝的動(dòng)物模型，探討機(jī)械加載是否可改善肥胖和肝脂肪變性，并從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的角度探討其可能的病理機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級雌性C57BL/6小鼠30只，體質(zhì)量約18 g，購自解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)所用飼料購自北京華阜康生物科技有限公司，高脂飼料含脂量為60%。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的飼養(yǎng)與管理過程均嚴(yán)格遵守天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)定，本研究經(jīng)天津醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑 油紅O染色試劑盒購于Sigma公司，轉(zhuǎn)錄激活因子4（activating transcription factor 4，ATF4）抗體、真核啟動(dòng)因子2α（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）抗體和真核啟動(dòng)因子2α磷酸化（eukaryotic promoter2α phosphorylation，p-eIF2α）抗體購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將動(dòng)物分成3組，正常對照（NC）組、高脂飲食（HF）組和高脂飲食機(jī)械加載治療（HF+L）組，每組10只。在實(shí)驗(yàn)起始階段，各組動(dòng)物體質(zhì)量沒有明顯差異。NC組給予正常飲食，HF和HF+L組給予高脂飲食，持續(xù)飲食誘導(dǎo)12周。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保證小鼠充足的食水，小鼠自由進(jìn)食、進(jìn)水。室溫22～25℃，相對濕度約50%，明暗各12 h的照明條件。

1.2.2 機(jī)械加載 高脂誘導(dǎo)6周后，HF+L組小鼠經(jīng)1.5%異氟烷麻醉后，采用自制的小動(dòng)物關(guān)節(jié)加載治療儀進(jìn)行治療。將小鼠膝關(guān)節(jié)外側(cè)、內(nèi)側(cè)置于加載桿和定子之間，松緊應(yīng)適宜，太緊會(huì)影響血流供應(yīng)，以能觸及到小鼠踝關(guān)節(jié)動(dòng)脈跳動(dòng)為標(biāo)準(zhǔn)（圖1）。加載力為1 N，加載頻率為10 Hz，每天加載6 min，每側(cè)膝關(guān)節(jié) 3 min，每周連續(xù)加載5 d［6］，連續(xù)加載6周。小鼠加載治療期間，HF+L組持續(xù)高脂喂養(yǎng)，直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。NC組和HF組接受假機(jī)械加載治療，即小鼠給予麻醉后，同樣將膝關(guān)節(jié)置于加載儀，但不接受任何機(jī)械刺激。

1.2.3 收集動(dòng)物體質(zhì)量、脂肪含量等數(shù)據(jù) 每周固定時(shí)間用電子稱（精密度0.01 g）測量并記錄小鼠體質(zhì)量，每3天統(tǒng)計(jì)1次小鼠攝食量。處死動(dòng)物前12 h，小鼠禁食不禁水，取血測量小鼠空腹血糖。動(dòng)物處死后，分離小鼠肝臟，稱濕質(zhì)量并記錄。一部分肝臟固定于4%多聚甲醛，用于組織形態(tài)學(xué)分析；一部分肝臟用于Western blot分析。同時(shí)，收集小鼠腹股溝脂肪、子宮周脂肪、腎周脂肪和腸系膜脂肪，稱濕質(zhì)量并記錄。

1.2.4 體成分分析 小鼠經(jīng)1.5%異氟烷面罩吸入麻醉小鼠，測量體質(zhì)量、體長（鼻尖至肛門），將所得數(shù)據(jù)輸入體成分分析儀，按要求將探針刺入小鼠皮下（圖2）。紅色探針置于鼻尖處，黃色探針置于兩耳連線中點(diǎn)處，藍(lán)色探針置于肛門上方處，黑色探針置于尾巴距離藍(lán)色探針1 cm處，然后開始測量并記錄體脂含量。

1.2.5 組織形態(tài)學(xué)觀測 小鼠新鮮肝臟經(jīng)4%多聚甲醛固定48 h后，部分肝臟組織經(jīng)蔗糖梯度脫水后進(jìn)行冰凍切片，切片厚度8 μm，選取同一位置的切片進(jìn)行油紅O染色，光鏡下觀察肝脂肪變性程度；部分肝臟組織經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋后進(jìn)行切片，切片厚度5 μm，同樣選取同一位置的切片進(jìn)行常規(guī)HE染色，中性樹膠封片，光鏡下觀察3組肝組織切片的病理改變。每組選取7個(gè)樣本切片，每個(gè)切片選擇5個(gè)鏡下視野進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.6 Western blot分析 每組分別取3個(gè)肝臟標(biāo)本，稱取小鼠肝臟50 mg，冰上剪碎后置于研磨管中，加含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液0.5 mL，冰上裂解20 min后研磨成勻漿，14 000×g離心15 min，提取總蛋白，測量蛋白濃度。上樣總蛋白濃度20 μg，加5×上樣緩沖液，100℃變性5 min，采用10%分離膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，電泳后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜。再使用5%脫脂奶粉封閉2 h，洗膜后，一抗4℃孵育過夜，1×TBST清洗3次，二抗室溫孵育2 h，化學(xué)發(fā)光、X線膠片曝光、顯影和定影后用凝膠成像系統(tǒng)檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 機(jī)械加載對高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的治療作用 實(shí)驗(yàn)期間，3組小鼠攝食量無明顯差異。與NC組小鼠相比，HF組小鼠體型較大，治療后HF+L組與HF組相比體型較小，見圖3。高脂喂養(yǎng)2周后，與NC組相比，HF組小鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.05），6周后體質(zhì)量持續(xù)增長（均P＜0.05）。機(jī)械加載治療2周后（第8周），HF+L組小鼠體質(zhì)量較HF組顯著降低，但仍然比NC組體質(zhì)量高，治療3周后體質(zhì)量趨于平穩(wěn)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1 The body weight changes throughout the experiment in three groups of mice表1 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中3組小鼠的體質(zhì)量變化（n=10，g，±s）

Tab.1 The body weight changes throughout the experiment in three groups of mice表1 整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中3組小鼠的體質(zhì)量變化（n=10，g，±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與NC組比較，b與HF組比較，P＜0.05；表2～4同

組別NC組HF組HF+L組F第2周18.98±0.27 19.86±0.22a 20.52±0.28a 6.692＊＊第4周20.83±0.49 22.59±0.28a 22.60±0.45a 4.770＊第6周20.93±0.37 24.74±0.54a 24.90±0.70a 9.898＊＊NC組HF組HF+L組F 21.20±0.28 27.98±0.81a 25.97±0.40ab 24.600＊＊22.53±0.55 30.43±0.89a 27.21±0.99ab 14.900＊＊22.67±0.53 32.05±0.99a 27.36±0.98ab 19.800＊＊

2.2 機(jī)械加載的降脂作用 體成分分析結(jié)果表明，與NC組相比，高脂飲食導(dǎo)致HF組小鼠全身體脂含量增加。機(jī)械加載干預(yù)后，HF+L組較HF組體脂含量降低，但仍高于NC組體脂含量，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。長期高脂飲食導(dǎo)致HF組空腹血糖高于NC組（P＜0.05），而HF+L組血糖明顯低于HF組（P＜0.05），并且恢復(fù)到NC組血糖水平，見表2。

Tab.2 Comparison of body fat content,fasting blood glucose and hepatic adipocyte number between three groups of mice表2 小鼠體脂含量、空腹血糖和肝臟脂肪細(xì)胞數(shù)目比較（±s）

Tab.2 Comparison of body fat content,fasting blood glucose and hepatic adipocyte number between three groups of mice表2 小鼠體脂含量、空腹血糖和肝臟脂肪細(xì)胞數(shù)目比較（±s）

組別NC組HF組HF+L組F體脂含量（n=10，%）35.57±2.28 53.39±1.21a 47.75±1.24ab 31.760＊＊血糖（n=10，mmol/L）4.22±0.26 9.52±0.85a 4.54±0.39b 27.940＊＊肝臟脂肪細(xì)胞數(shù)目（n=7，個(gè)）0 60.58±4.21a 9.90±1.64ab 71.650＊＊

2.3 機(jī)械加載對不同部位脂肪組織的作用 與NC組相比，HF組腎周脂肪、子宮周脂肪、腸系膜脂肪、腹股溝脂肪均增加（均P＜0.05）。治療干預(yù)后，HF+L組各部位脂肪質(zhì)量較HF組顯著降低，但仍高于NC組（均P＜0.05），見表3。

Tab.3 The comparison of adipose tissue mass between different tissues表3 各部位脂肪組織質(zhì)量的比較（n=10，g，±s）

Tab.3 The comparison of adipose tissue mass between different tissues表3 各部位脂肪組織質(zhì)量的比較（n=10，g，±s）

組別NC組HF組HF+L組F腎周脂肪0.13±0.01 0.93±0.13a 0.58±0.10ab 11.520＊＊子宮周脂肪0.29±0.01 1.49±0.18a 0.98±0.15ab 11.930＊＊腹股溝脂肪0.24±0.01 1.41±0.18a 0.91±0.10ab 15.110＊＊腸系膜脂肪0.22±0.02 0.57±0.06a 0.41±0.03ab 13.610＊＊

2.4 機(jī)械加載對肝臟組織中脂肪細(xì)胞的作用 與NC組相比，HF組肝臟發(fā)生脂肪變性，肝臟體積增大，顏色輕度發(fā)黃，而HF+L組肝臟體積較HF組變小，肝臟顏色紅潤，見圖4。肝臟組織HE染色顯示，NC組小鼠肝臟組織肝索結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞大小均勻，細(xì)胞核圓，胞質(zhì)豐富；HF組肝索結(jié)構(gòu)遭到破壞，脂肪細(xì)胞導(dǎo)致肝細(xì)胞排列紊亂，而HF+L組肝索結(jié)構(gòu)較HF組規(guī)則，肝細(xì)胞核圓；與NC組相比較，HF組肝臟組織出現(xiàn)大量形態(tài)規(guī)則的白色空泡樣脂肪細(xì)胞（圖5黑色箭頭所示），而HF+L組脂肪細(xì)胞較HF組明顯減少。油紅O染色結(jié)果顯示，HF組肝臟組織出現(xiàn)大量紅色著染的脂肪細(xì)胞（圖6白色箭頭所示），HF+L組幾乎沒有紅色著染。將脂肪細(xì)胞量化后結(jié)果表明，HF組脂肪細(xì)胞較NC組明顯增多，HF+L組脂肪細(xì)胞較HF組顯著減少，但與NC組相比，仍然有一定數(shù)量的脂肪細(xì)胞（P＜0.05），見表2。

2.5 機(jī)械加載對肝臟組織中p-eIF2α和ATF4表達(dá)的影響 肝臟組織蛋白檢測分析表明，與NC組相比，HF組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白p-eIF2α、eIF2α和ATF4的表達(dá)顯著升高，而HF+L組較HF組明顯降低（均P＜0.05），與NC組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表4、圖7。

Tab.4 The marker proteins of endoplasmic reticulum stress detected by Western blot assay in three groups表4 Western blot檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性標(biāo)志蛋白的表達(dá)（n=3，±s）

Tab.4 The marker proteins of endoplasmic reticulum stress detected by Western blot assay in three groups表4 Western blot檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性標(biāo)志蛋白的表達(dá)（n=3，±s）

組別NC組HF組HF+L組F p-eIF2α/eIF2α 0.81±0.08 1.39±0.12a 0.87±0.05b 11.770＊＊ATF4 0.73±0.04 1.14±0.07a 0.83±0.05b 13.360＊＊

Fig.7 The marker proteins of endoplasmic reticulum stress detected by Western blot assay in three groups圖7 Western blot檢測3組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記性蛋白的表達(dá)

3 討論

3.1 機(jī)械加載治療對體質(zhì)量、體脂的作用 高熱量食物的攝入和缺乏運(yùn)動(dòng)鍛煉是導(dǎo)致肥胖的主要原因，而機(jī)體對于過剩的能量最初始的反應(yīng)是將多余的能量儲存于脂肪細(xì)胞［7］。盡管能量可以以此種形式儲存于體內(nèi)，但是脂肪組織的過度堆積會(huì)成為導(dǎo)致代謝性疾病的主要高危因素。本課題組通過長期高脂飲食誘導(dǎo)小鼠建立肥胖動(dòng)物模型，6周高脂飲食誘導(dǎo)后，HF組小鼠體質(zhì)量顯著高于NC組，各部位脂肪組織也顯著增加。運(yùn)動(dòng)鍛煉被認(rèn)為是減輕體質(zhì)量最有效的治療方法，同時(shí)可以提高心肺功能和整體生活質(zhì)量［8］。但一些有基礎(chǔ)疾病的老年人或身體殘疾者難以進(jìn)行運(yùn)動(dòng)鍛煉，并且過度的運(yùn)動(dòng)可能會(huì)有肌肉損傷和骨折的風(fēng)險(xiǎn)。因此，本研究探討了膝關(guān)節(jié)加載對肥胖的影響，結(jié)果提示膝關(guān)節(jié)加載治療通過降低體質(zhì)量和全身體脂含量，有效緩解了高脂飲食導(dǎo)致的肥胖的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果表明，膝關(guān)節(jié)加載可以作為一種新的物理康復(fù)理療方式，改善肥胖相關(guān)的脂質(zhì)代謝異常。

3.2 機(jī)械加載對肥胖和脂肪肝的療效 NAFLD是以肝臟脂質(zhì)沉積和肝細(xì)胞脂肪變性為基本特征的一類疾病，是肥胖最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一［9］。肥胖和NAFLD之間關(guān)系密切，據(jù)報(bào)道約90%的肥胖患者伴有NAFLD，其嚴(yán)重程度與肥胖的程度成正比［10］。作為體內(nèi)參與代謝的一個(gè)重要器官，肝臟對超重或肥胖極其敏感，體內(nèi)脂肪的減少會(huì)導(dǎo)致肝臟中的脂滴減少和肝功能指數(shù)升高。研究表明內(nèi)臟脂肪增加會(huì)增加患脂肪肝的風(fēng)險(xiǎn)，并且兩者之間的關(guān)系呈正相關(guān)［11-12］，本研究中，高脂導(dǎo)致了內(nèi)臟脂肪（腎周脂肪、腸系膜脂肪和子宮周脂肪）的顯著增加，而機(jī)械加載治療有效減少了內(nèi)臟脂肪的堆積。肝臟組織學(xué)分析結(jié)果也表明，長期高脂飲食導(dǎo)致肝臟組織內(nèi)脂滴異常沉積。反之，膝關(guān)節(jié)加載干預(yù)治療通過減少肝內(nèi)脂肪沉積而緩解了NAFLD的發(fā)生發(fā)展。這些結(jié)果表明膝關(guān)節(jié)加載改善了高脂飲食導(dǎo)致的肝脂肪變性，為治療肝臟脂質(zhì)代謝異常提供了新的策略。

3.3 機(jī)械加載治療脂肪肝中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制 很多研究表明內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在肥胖以及NAFLD發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［13-15］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激不僅是肝臟脂肪堆積的結(jié)果，也是造成這種病理表現(xiàn)的原因。在脂肪肝中，脂肪生成過多和脂肪沉積異常會(huì)導(dǎo)致慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激［13］。肝臟是葡萄糖和脂質(zhì)代謝的主要場所，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的非折疊蛋白反應(yīng)通路激活又是肝糖元和脂質(zhì)代謝的重要調(diào)節(jié)通路［16］。同時(shí)，本研究結(jié)果也表明長期高脂飲食導(dǎo)致血糖異常升高，機(jī)械加載能夠有效降低異常升高的血糖，并使其控制在正常范圍內(nèi)。為了探討膝關(guān)節(jié)加載是否通過影響肝臟內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而起到了這一系列的治療作用，本研究檢測了與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)的PERK-ATF4軸蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示在HF組小鼠p-eIF2α和ATF4蛋白表達(dá)水平升高，說明長期高脂飲食導(dǎo)致了慢性內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而，在6周機(jī)械加載治療后，這些蛋白表達(dá)水平顯著降低。以上結(jié)果表明膝關(guān)節(jié)加載對肥胖和非酒精性脂肪肝的治療作用可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。

（圖1～6見插頁）

Fig.2 The fixation of the surgical aspirator圖2 吸引器的固定

Fig.3 Preoperative brain CT of case1圖3 病例1術(shù)前頭部CT

Fig.4 The postoperative brain CT 6 h after operation of case 1圖4 病例1手術(shù)后6 h復(fù)查頭部CT

Fig.5 Preoperative brain CT of case 2圖5 病例2術(shù)前頭部CT

Fig.6 The postoperative brain CT 6 h after operation of case 2圖6 病例2手術(shù)后6 h復(fù)查頭部CT

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